KR101316899B1 - 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 검출용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수인성 감염으로 인해 질병을 유발시킬 수 있는 주요 원생동물로 알려진 람블편모충(Giardia lamblia), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum) 및 이질아메바(Entamoeba histolytica)의 검출용 키트에 관한 것으로, 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바를 특이적으로 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바를 특이적을 검출할 수 있는 기술을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 통해 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바를 동시 검출할 수 있는 키트를 제공 할 수 있다.
Description
본 발명은 수인성 감염으로 인해 질병을 유발시킬 수 있는 주요 원생동물로 알려진 람블편모충(Giardia lamblia), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum) 및 이질아메바(Entamoeba histolytica)의 검출용 키트에 관한 것이다.
우리나라를 포함한 전 세계적으로 주요한 수인성 감염 원충으로 인식되는 3가지 원충은 소화기 질환을 일으키고 특히 집단 발병을 일으킨다고 알려져 있다. 이들 원충의 존재 여부에 대한 조사에 대한 수요는 높은 상태이며 미래에는 더욱 증가될 가능성이 높다. 이에 람블편모충(Giardia lamblia), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum) 및 이질아메바(Entamoeba histolytica)의 존재 유무를 신속하고 효율적으로 확인하는 탐지 방법이 요청된다.
람블편모충(Giardia lamblia)은 사람의 소장 및 십이지장에 기생하는 편모충이다. 영양형의 크기는 4.5-21 ㎛이고 자라모양으로 앞부분은 넓은 원형이며, 뒤쪽은 뾰족하고 좌우대칭이다. 4개의 난원형 핵은 흡반의 밑부분에 좌우 1쌍씩 존재한다. 8개의 편모가 전방, 중앙, 복부 그리고 꼬리 부분에 각각 1 쌍씩 있다. 포낭은 난원형 또는 타원형이고 크기는 8-12 ㎛이며 2-4개의 핵, 때로는 8개의 핵이 있고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 진하게 염색되는 성질이 있다.
람블편모충은 선진국에서도 감염률이 높아 미국에서 가장 흔하게 관찰되는 장내 기생충이다. 열대 지역의 후진국에서는 물론 감염률이 매우 높다. 국내에서 포낭 양성률이 0.5% 정도이다. 여행자 설사의 가장 중요한 원인으로 알려져 있고, 역시 수인성 전염이 가장 흔하다. 동성연애자에서 감염률이 높으며 여러 경로를 통하여 변강구강전파(fecal-to-oral transmission)가 될 수 있다. 가축이나 애완동물이 보유숙주가 될 수 있다는 견해도 있다. 가장 흔한 증상은 설사, 위경련, 복부팽만감, 구역, 묽은 변, 색이 옅은 지방 변, 피로감 및 체중감소이다. 증상이 나타나지 않는 사람도 있으나, 그래도 다른 사람에게 여전히 전염시킬 수 있다. 감염 후 발증이 시작될 때까지의 잠복기는 3-25일(평균 7-10일)이며, 대부분의 건강인은 4-6주 내에 회복된다.
작은와포자충은 전세계적으로 분포하는 원충성 병원체로써 면역능력이 억제된 사람에서는 극심한 설사와 탈수로 사망에 이르기까지 할 수 있는 감염성 원충의 하나이다. 이 원충은 크기가 매우 작아, 난포낭(oocyst)는 4-6 ㎛에 불과하다. 접합자낭 내에는 스포로시스트(sporocyst)가 없고 4개의 종충(sporozoite)만을 포함하고 있다. 이 원충의 인체감염은 체외에 존재하는 난포낭을 섭취함으로써 이루어진다.
선진국에서는 해외여행 후 귀국하여 발병하는 여행자 설사의 주요원인으로 취급되고 있다. 도시 지역보다 농촌 지역의 감염률이 더 높다. 개인위생 관념이 낮은 사람이 감염되기 쉬우며, 보편적으로 소아 연령층에서 빈발한다. 보유 숙주로 개, 고양이 및 가축에서 발견된다. 인체 감염 경로는 난포낭에 오염된 식수를 마시거나 가축이나 애완동물 또는 감염자와 접촉 등으로 일어날 수 있다.
이질아메바(Entamoeba histolytica)는 아메바성 이질이나 간농양 등을 일으키는 병원성 아메바이다. 열대와 아열대 지역에서 많이 분포하며 우리나라는 60년대와 70년대에 5-10%의 높은 감염률을 보였으나 현재는 많이 감소되고 있는 추세이다. 영양형과 포낭형의 생활기를 갖으며, 영양형은 인체에 감염되면 위액에 의하여 파괴되나 포낭형은 외부의 저항력에 비교적 강하다. 몸의 길이는 20-30 ㎛이고 단세포 동물로 사람의 입을 통하여 감염된다. 큰창자 점막에서 번식하여 발병하며, 주로 사람에 기생하나 개-고양이-원숭이-돼지-쥐 등에서도 볼 수 있는 병원충이다. 몸길이 15-60 ㎛이며, 한 개의 핵을 가진다. 투명한 피막을 만들어 5-20 ㎛의 포자낭이 되고, 대변과 함께 배설되어 감염원이 된다. 주로 큰창자 조직 속에 기생하여 궤양을 형성하며, 세균의 2차감염을 일으키거나 작은 창자-간 등을 침범하는 일도 있다. 열대지방에서는 이질현상을 일으키지 않고 열이 없이 만성이 되는 일이 많다.
탐색의 신속성과 경제적 견지에서, 위 세 가지 주요 원충을 동시에 탐지할 수 있다면 매우 바람직할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로써 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 수인성 감염을 일으키는 주요 병원성 원생동물인 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 효율적인 검출방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바에 대하여 특이적인 마커를 발굴하였고 이 마커를 검출하는 경우에는 상기 3종의 원생동물을 모노플렉스 방식, 바람직하게는 멀티플렉스 방식으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 람블편모충을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 작은와포자충을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이질아메바를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 동시 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 13 서열 또는 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 람블편모충(Giardia lamblia)을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 15 서열 또는 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 작은와포자충(Cryptosporidium parvum)을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 17 서열 또는 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제 13 서열 또는 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; (b) 서열목록 제 15 서열 또는 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 (c) 서열목록 제 17 서열 또는 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 람블편모충(Giardia lamblia), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum) 및 이질아메바(Entamoeba histolytica)의 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 수인성 감염을 일으키는 주요 병원성 원생동물인 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 효율적인 검출방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바에 대하여 특이적인 마커를 발굴하였고 이 마커를 검출하는 경우에는 상기 3종의 원생동물을 모노플렉스 방식, 바람직하게는 멀티플렉스 방식으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 람블편모충의 Axoneme-associated protein 또는 Cyst wall protein 1, 작은와포자충의 Oocyst wall protein 또는 Heat shock protein 70, 이질아메바의 Cysteine proteinase 5 또는 EhRab7B protein 단백질은 각 원충에 특이적으로 존재하는 마커로써, 이들의 존재를 유전자 증폭 또는 마이크로어레이 방법을 통해 검출할 경우 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 존재를 높은 신뢰도와 특이도(specificity)로 예측할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 용어, “검출”은 특정 대상시료 또는 개체 내의 목적균주의 존재, 농도, 조성 또는 활성을 판단하거나 예측하는 것 뿐 아니라, 이러한 분석결과를 통해 질병 또는 질환에 대한 분석대상 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커 중 하나인 asp(Axoneme-associated protein)은 GenBank 접근번호 XM_001709095, cwp1(Cyst wall protein 1)은 GenBank 접근번호 U09330, owp(Oocyst wall protein)은 GenBank 접근번호 GU904405, hsp70(Heat shock protein 70)는 GenBank 접근번호 U69698, cp5(Cysteine proteinase 5)은 GenBank 접근번호 DQ899179, ehrab7b(EhRab7b protein)은 GenBank 접근번호 AB186363에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로써 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로써, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 동시 검출용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 존재 여부를 판단할 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 존재 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바의 존재로 진단된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 13 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열은 람블편모충의 asp 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열은 람블편모충의 cwp1단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 15 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 5 서열 및 서열목록 제 6 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 5 서열 및 서열목록 제 6 서열의 뉴클레오타이드 서열은 작은와포자충의 owp 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 7 서열 및 서열목록 제 8 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 7 서열 및 서열목록 제 8 서열의 뉴클레오타이드 서열은 작은와포자충의 hsp70 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 17 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 뉴클레오타이드 서열은 이질아메바의 cp5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12서열의 뉴클레오타이드 서열은 이질아메바의 ehrab7b 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 정방향 및 역방향 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예 에 따르면, 본 발명은 유전자 증폭용 키트이다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 정성 또는 정량 분석을 한다.
따라서 본 발명의 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 마커의 검출 방법을 gDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커로 감염여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 마이크로 어레이 키트일 수 있다.
본 발명의 키트가 유전자 증폭용 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다. 본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바를 특이적을 검출할 수 있는 기술을 제공한다.
(b) 바람직하게는, 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 통해 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바를 동시 검출할 수 있는 키트를 제공 할 수 있다.
도 1은 람블편모충의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 보여준다(아가로즈 젤의 1열: 100 bp 사이즈 마커, 2열: 작은와포자충 gDNA, 3열: 이질아메바 gDNA, 4열: 람블편모충 gDNA, 5열: 파울러 자유아메바 gDNA).
도 2는 작은와포자충의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 보여준다(아가로즈 젤의 1열: 100 bp 사이즈 마커, 2열: 작은와포자충 gDNA, 3열: 이질아메바 gDNA, 4열: 람블편모충 gDNA, 5열: 파울러 자유아메바 gDNA).
도 3은 이질아메바의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 보여준다(아가로즈 젤의 1열: 100 bp 사이즈 마커, 2열: 작은와포자충 gDNA, 3열: 이질아메바 gDNA, 4열: 람블편모충 gDNA, 5열: 파울러 자유아메바 gDNA).
도 4는 멀티플렉스 PCR 세트1의 결과를 보여준다(람블편모충 유래의 asp 339 bp, 작은와포자충 유래의 owp 385 bp 및 이질아메바 유래의 cp5 435bp).
도 5는 멀티플렉스 PCR 세트6의 결과를 보여준다(람블편모충 유래의 cwp1 377 bp, 작은와포자충 유래의 hsp70 496 bp 및 이질아메바 유래의 ehrab7b 166 bp).
도 2는 작은와포자충의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 보여준다(아가로즈 젤의 1열: 100 bp 사이즈 마커, 2열: 작은와포자충 gDNA, 3열: 이질아메바 gDNA, 4열: 람블편모충 gDNA, 5열: 파울러 자유아메바 gDNA).
도 3은 이질아메바의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 보여준다(아가로즈 젤의 1열: 100 bp 사이즈 마커, 2열: 작은와포자충 gDNA, 3열: 이질아메바 gDNA, 4열: 람블편모충 gDNA, 5열: 파울러 자유아메바 gDNA).
도 4는 멀티플렉스 PCR 세트1의 결과를 보여준다(람블편모충 유래의 asp 339 bp, 작은와포자충 유래의 owp 385 bp 및 이질아메바 유래의 cp5 435bp).
도 5는 멀티플렉스 PCR 세트6의 결과를 보여준다(람블편모충 유래의 cwp1 377 bp, 작은와포자충 유래의 hsp70 496 bp 및 이질아메바 유래의 ehrab7b 166 bp).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
원충에 선택적인 특이 프라이머 세트 디자인
진뱅크 데이타베이스(GenBank database)에 기탁된 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 원충의 지노믹 DNA를 탐색한 후, 각 원충에서만 특이적으로 존재하는 염기서열을 비교 분석하여 람블편모충 증폭용 프라이머 세트인 asp-F 및 asp-R, cwp1-F 및 cwp1-R, 작은와포자충 증폭용 프라이머 세트인 owp-F 및 owp-R, hsp70-F 및 hsp70-R 그리고 이질아메바 증폭용 프라이머 세트인 cp5-F 및 cp5-R, ehrab7b-F 및 ehrab7b-R이라 명명한 프라이머 세트를 디자인하였다(표 1 및 표 2). 표 1의 12개의 프라이머를 서열목록 1 내지 12로 본 명세서에 첨부한다.
| 원충 | 프라이머 | 프라이머 염기서열 | 서열목록 | PCR 결과물 크기 |
| 람플편모충 | asp-F | 5’- TTGTAACAAGCGAGGTTGGT -3’ | 제 1 서열 | 339 bp |
| asp-R | 5’- GCTTCGTTAATTGCCATGTC -3’ | 제 2 서열 | ||
| cwp1-F | 5’- CCTAATGTTCTGGTACATGA -3’ | 제 3 서열 | 377 bp | |
| cwp1-R | 5’- GCATGAACTGTTCAAAGAGCC -3’ | 제 4 서열 | ||
| 작은와포자충 | owp-F | 5’- CAGGCACTATACTGGAGAATGC -3’ | 제 5 서열 | 385 bp |
| owp-R | 5’- GCAGACAGGTTGAGTTGGAG -3’ | 제 6 서열 | ||
| hsp70-F | 5’- CGGTATGCCAGGTGGAATG -3’ | 제 7 서열 | 496 bp | |
| hsp70-R | 5’- CTCCATTAACAGTTTGTTCA -3’ | 제 8 서열 | ||
| 이질아메바 | cp5-F | 5’- CTGTTGCTGCTATTGAAGGAAG -3’ | 제 9 서열 | 435 bp |
| cp5-R | 5’- CCATAACCAACTACTGCTACAC -3’ | 제 10 서열 | ||
| ehrab7b-F | 5’- GCTAATCGTGCTGTAAGTTCTG-3’ | 제 11 서열 | 166 bp | |
| ehrab7b-R | 5’- AATGGCTCTGGTTGTGGAAC -3’ | 제 12 서열 |
| 원충 | 유전자 | 단백질 | 유전자 번호 | 서열목록 |
| 람블편모충 | asp | Axoneme-associated protein | XM_001709095 | 제 13 서열 |
| cwp1 | Cyst wall protein 1 | U09330 | 제 14 서열 | |
| 작은와포자충 | owp | Oocyst wall protein | GU904405 | 제 15 서열 |
| hsp70 | Heat shock protein 70 | U69698 | 제 16 서열 | |
| 이질아메바 | cp5 | Cysteine proteinase 5 | DQ899179 | 제 17 서열 |
| ehrab7b | EhRab7B protein | AB186363 | 제 18 서열 |
PCR
의 특이성 조사
총 4종의 원충(람블편모충; ATCC30957, 작은와포자충; PRA-67D, 이질아메바; HM1:IMSS, 파울러 자유아메바(Neagleria fowleri); ATCC30215)을 PCR의 주형(template)으로 사용하기 위하여, 작은와포자충을 제외한 3종의 원충은 각각 TYI-S-33과 변형 TYI-S-33 배지에서 배양한 후 G-DEXTM 지노믹 DNA 추출 키트(INtRON, 한국)을 이용하여 지노믹 DNA(genomic DNA: gDNA)를 분리하여 PCR 주형으로 준비하였다. 준비된 gDNA를 첨가하여 PCR을 수행하였고, 이때 사용된 PCR 반응 완충액 조성, 반응온도 및 반응시간 조건은 다음과 같다.
PCR 반응 완충액 조성은 10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2(pH 9.0), dNTP(각 0.25 mM), Taq DNA 폴리머라제(1.0 Unit), 정방향 프라이머(20 pmoles), 역방향 프라이머(20 pmoles) 및 주형 gDNA(-25 ng DNA)로 구성되어 있으며, PCR 반응조건은 94℃ 2분-30 사이클(94℃ 1분; 56℃ 1분; 72℃ 1분)-72℃ 10분이다.
PCR 결과물을 1.2% 아가로즈 젤에 로딩 후 전기영동하여 이티디움 브로마이드 용액으로 염색하여 UV 하에서 관찰한 결과, 도 1 내지 도 3에서와 같이 각각의 람블편모충, 작은와포자충, 이질아메바 원충의 특이적 DNA가 생성되었으나, 타 원충에서는 이러한 크기의 DNA가 생성되지 않은 것으로 나타났다. 이는 각 프라이머 세트가 람블편모충(도 1), 작은와포자충(도 2), 이질아메바(도 3) 각각의 원충에만 특이적으로 반응함을 의미한다.
3종의 원충에 대한 멀티플렉스
PCR
세트1
,
세트2
앞서 본 표 1의 데이터와 도 1 내지 도 3의 결과에 따라, 3종의 원충을 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. 이때 PCR 결과물인 염기쌍(base pair: bp)의 길이가 비슷하게 되면 각 세균의 식별이 어려워지므로 그 길이를 달리하는 경우로 디자인하는 게 필요하다. 이러한 요인을 감안한 결과, 3종 원충을 동시 탐지하기 위해서는 다음과 같이 6가지의 프라이머 세트 조합이 바람직하다.
1. 세트1: asp 339 bp, owp 385 bp, cp5 435 bp(서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 5 서열, 제 6 서열, 제 9 서열 및 제 10 서열의 조합)
2. 세트2: asp 339 bp, owp 385 bp, ehrab7b 166 bp(서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 5 서열, 제 6 서열 및 제 11 서열 및 제 12 서열의 조합)
3. 세트3: asp 339 bp, hsp70 496 bp, cp5 435 bp(서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 7 서열, 제 8 서열, 제 9 서열 및 제 10 서열의 조합)
4. 세트4; asp 339 bp, hsp70 496 bp, ehrab7b 166 bp(서열목록 제 1 서열, 제 2 서열, 제 7 서열, 제 8 서열, 제 11 서열 및 제 12 서열의 조합)
5. 세트5; cwp1 377 bp, hsp70 496 bp, cp5 435 bp(서열목록 제 3 서열, 제 4 서열, 제 7 서열, 제 8 서열, 제 9 서열 및 제 10 서열의 조합)
6. 세트6 ; cwp1 377 bp, hsp70 496 bp, ehrab7b 166 bp(서열목록 제 3 서열, 제 4 서열, 제 7 서열, 제 8 서열, 제 11 서열 및 제 12 서열의 조합)
발명자들은 그중 표본으로써 세트1번과 6번의 조합에 대해 실험을 수행하였다.
먼저 1 ㎕에 3가지 원충의 gDNA가 각각 약 25 ng씩 존재하도록 준비하여, 3 ㎕를 세 종류의 원충 구분용 3가지 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 이 결과 그래프 4-5의 2열에서와 같이 3가지 원충의 존재를 보여주는 3가지 크기의 DNA 밴드가 동시에 증폭되었다. 이는 1번의 PCR로써 람블편모충, 작은와포선충, 이질아메바의 존재를 동시에 탐지할 수 있음을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (18)
- 서열목록 제 13 서열 또는 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 람블편모충(Giardia lamblia)을 특이적으로 검출하기 위한 키트; 상기 서열목록 제 13 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
- 서열목록 제 15 서열 또는 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 작은와포자충(Cryptosporidium parvum)을 특이적으로 검출하기 위한 키트; 상기 서열목록 제 15 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 5 서열 및 서열목록 제 6 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 7 서열 및 서열목록 제 8 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
- 서열목록 제 17 서열 또는 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)를 특이적으로 검출하기 위한 키트; 상기 서열목록 제 17 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
- (a) 서열목록 제 13 서열 또는 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; (b) 서열목록 제 15 서열 또는 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 (c) 서열목록 제 17 서열 또는 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 람블편모충(Giardia lamblia), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum) 및 이질아메바(Entamoeba histolytica)의 동시 검출용 키트; 상기 서열목록 제 13 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 14 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열이며, 상기 서열목록 제 15 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 5 서열 및 서열목록 제 6 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 16 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 7 서열 및 서열목록 제 8 서열의 뉴클레오타이드 서열이며, 상기 서열목록 제 17 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 서열목록 제 18 서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 11 서열 및 서열목록 제 12 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 7 서열, 서열목록 제 8 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 9 서열 및 서열목록 제 10 서열의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 검출용 키트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭용 키트인 것을 특징으로 하는 검출용 키트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로 어레이 키트인 것을 특징으로 하는 검출용 키트.
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