JP6670860B2 - 導電性高分子を利用したセルフリーｄｎａ検出用構造体およびその用途 - Google Patents

導電性高分子を利用したセルフリーｄｎａ検出用構造体およびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、導電性高分子を利用したセルフリーＤＮＡ検出用構造体およびその利用に関し、より具体的には、循環腫瘍ＤＮＡなどのセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡを分離し検出するに際して、表面改質した導電性高分子で構成された平面構造体またはナノ構造体を利用することに関する。
ヒトの血漿中の循環セルフリーＤＮＡの存在は、１９４８年にＭａｎｄｅｌとＭeｔａｉｓにより発表された。循環セルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ，ｃｆＤＮＡ）は、炎症性障害、酸化ストレスおよび悪性腫瘍などの多様な生理学的および病理学的病態において研究されている。健康な個体の場合、その血中濃度は、０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、平均的に３０ｎｇ／ｍｌである。正常細胞のＤＮＡ含量を６．６ｐｇであると仮定すると、この数値は、血液１ｍｌ当たりの平均ゲノム当量０〜１５，０００に該当し、ｍｌ当たりのゲノムが平均５０００である。このＤＮＡの大部分が二本鎖であり、外観上、核蛋白質の複合体の形態である。
セルフリーＤＮＡの血流放出に関連した正確な機序は不明確であるが、おそらく細胞自殺、細胞怪死および細胞からの能動的な放出が総合的に作用すると見られる。
循環セルフリーＤＮＡは、潜在的に有用なバイオマーカーであって、ＤＮＡ水準と断片化パターンは、診断および予後予測の目的で興味深い可能性を提示する。最近、バートゥーブ等は、個体の体液サンプルで測定されたｃｆＤＮＡに基づいて男性個体の生殖性の状態を評価する方法を開示した（ＷＯ２００８／０４７３６４）。また、彼らは、生殖力が低下した（ｓｕｂｆｅｒｔｉｌｅ）男性にＤＮａｓｅを投与することにより、男性の低い生殖力を治療する方法も提案した。また、セルフリーＤＮＡは、悪性および陽性増殖と炎症性病態、例えば子宮内膜症に対する非侵襲的モニタリングバイオマーカーとして提案されたことがある。
特に、前記循環セルフリーＤＮＡのうち、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ）を血液中から抽出および分離することにより、癌特異的遺伝子を検出する方法を通じて癌の診断とモニタリングに活用する非侵襲的検査が癌の診断分野に寄与できるものと期待されている。
非侵襲性血液サンプルを用いた癌の診断方法は、現在多くの関心を集めている非常に興味深い分野であって、血液サンプルからＣＴＣおよびｃｔＤＮＡの分離／検出が効果的に行われる場合、診断および治療戦略の樹立に対する根拠となり得、また、抗癌剤の抵抗による腫瘍の遺伝的変化に合わせた治療法の選択などを周期的に施行できるので、既存の癌治療法の効果を最大化させることができる。
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、異なる固形の悪性腫瘍を有する患者の血液に存在する上皮器官の細胞であって、これらは、１次腫瘍のクローンから誘導され、悪性である（フェム（Ｆｅｈｍ）等の文献［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：２０７３−８４，２００２］）。また、ＣＴＣが癌腫の癌の進行に対する独立した診断として考慮され得ることが知られている。
循環腫瘍細胞の検出および算出は、色々な理由で患者の管理において重要である。これらは、１次腫瘍前に検出され得、したがって、初期段階の診断を許容する。これらは、治療に反応して減少するので、ＣＴＣを算出する能力は、与えられた治療レジメンの効果をモニタリングするようにする。これらは、補助剤の環境で推測できない疾病を有する患者の再発をモニタリングするためのツールとして使用され得る。
前記ＣＴＣおよびｃｔＤＮＡは、血中に極めて少ない量で存在するが、例えば、血球成分１０８〜１０９個当たり約１個であり、そのため、いくつかのＣＴＣ分離法が提案されてきた。例えば、分離法には、抗ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）抗体を固定化した磁性粒子、または柱状構造などの樹脂の表面にキャプチャー抗体を結合させたマイクロ流体デバイスを利用する方法、また、ＣＴＣと血球細胞のサイズの差を利用してフィルターを使用して分離する方法などが知られている（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｕｎｉｔｈａ Ｎａｇｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０：１２３５−１２３９）．
ｃｔＤＮＡを抽出するための一般的な方法は、商業化されたキット（ｋｉｔ）を使用する。キアゲン循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ）は、正に帯電したシリカメンブレンを使用してＤＮＡの付着を誘導した後、ｐＨの変化を通じて付着したＤＮＡを分離する。しかし、依然として低い回収効率を有するという問題点がある。
フランスのＬａｕｒｅｎｔグループは、ドロップレット基盤のデジタルＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）を使用して直腸癌患者の血漿に存在するｃｔＤＮＡを発見することによって、ＫＲＡＳ腫瘍形成遺伝子を定量化する技術を紹介した。米国ペンシルバニア大学のダイヤモンド（Ｄｉａｍｏｎｄ）グループは、正に帯電したポリエチレンイミンナノ粒子を使用して負に帯電したＤＮＡを付着する研究を進めたが、これは、ナノ粒子の表面に光分解性リガンドを連結することにより、検出されたＤＮＡに光を照射して効果的に分離する技術である。中国のＤｅｚｈｏｕ大学のＷａｎｇグループでは、磁性ナノ粒子に正に帯電したポリマーを連結した後、ｐＨの変化を通じてゲノムＤＮＡを効果的に付着し分離した。
しかし、現在ｃｔＤＮＡを検出するために使用されている方法は、様々な問題点を有している。まず、時間が長くかかり、処理が複雑であり、高費用および低い回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）などが今後改善すべき問題点である。特に、初期の癌よりは癌が進行した患者にｃｔＤＮＡが発見されるので、超高感度の検出／分離技術の開発が至急である。
よって、本発明者らは、導電性高分子を利用して平面構造体またはナノ構造体を製作し、表面を正電荷に改質することにより、ｃｔＤＮＡの付着力を大きく増大させ、電気的信号により効果的にｃｔＤＮＡを分離させることができることを知見し、本発明を完成した。
本発明の主な目的は、導電性高分子を利用したセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出または分離用構造体およびこれを含むキットを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記導電性高分子を利用してｃｆＤＮＡの検出または分離方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ｃｆＤＮＡの検出または分離結果を通じて癌の発病および予後を診断するための情報を提供する方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ｃｆＤＮＡの検出または分離結果を通じて癌の発病および予後を診断する診断方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、表面改質した導電性高分子を含む、セルフリーＤＮＡ、好ましくは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）の検出および分離用構造体を提供する。
この際、セルフリーＤＮＡが負電荷を帯びるので、前記表面改質した導電性高分子は、正電荷を帯びることが好ましい。
前記ナノ構造体は、ナノロッドまたはナノワイヤーの形態で提供され得るが、これに限らない。
前記導電性高分子は、ポリアセチレン、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンおよびポリ窒化硫黄よりなる群から選択され得るが、最も好ましくは、ポリピロールを使用する。
また、本発明は、他の具体例として、前記説明したセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体を含むセルフリーＤＮＡの検出および分離用キットを提供する。
また、本発明は、さらに他の具体例として、下記の段階を含む、セルフリーＤＮＡを検出または分離する方法を提供する：
（ｉ）平面構造体またはナノ構造体を形成する導電性高分子の表面を正電荷に改質する段階；
（ｉｉ）生物学的試料を処理して前記導電性高分子にｃｆＤＮＡを付着させる段階；および
（ｉｉｉ）電気的信号を加えて前記導電性高分子からｃｆＤＮＡを検出および分離させる段階。
この際、前記生物学的試料は、血液、骨髄、胸水、腹膜液、脊髄液、尿、または唾液が使用でき、好ましくは、血液を使用する。
（ｉｉ）段階で、前記ｃｆＤＮＡを付着させる段階は、０．８〜１．２Ｖで２０〜４０秒間電気を加えて行われることが好ましい。
また、（ｉｉｉ）段階で、前記ｃｆＤＮＡを検出または分離させる段階は、−１．３〜−１．０Ｖで４〜６分間電気的信号を加えて行われることが好ましい。
使用する導電性高分子の種類および検出しようとするＤＮＡの種類に応じて電気的信号のサイズは、当業者が適宜調節できる。
また、本発明は、さらに他の具体例として、前記セルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体を利用してサンプルから循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出／分離して分析する段階を含む、対象者の癌の発病および予後を診断するための情報を提供する方法を提供する。
また、本発明は、さらに他の具体例として、前記セルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体を利用してサンプルから循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出／分離して分析する段階を含む、対象者の癌の発病および予後の診断方法を提供する。
この際、前記癌は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）、芽細胞腫（ｂｌａｓｔｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、神経内分泌腫瘍（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ）、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、悪性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、扁平細胞癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、腹膜癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃腸管癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜または子宮癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｏｒ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、外陰癌（ｖｕｌｖａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌腫（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌（ａｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｌｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胆道癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒａｃｔ）および頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）よりなる群から選択され得、好ましくは、乳癌、肺癌、胃癌、肝癌または膵臓癌である。
前記から、本発明による分析は、サンプルからｃｔＤＮＡの量（濃度）、コピー（ｃｏｐｙ）数または塩基配列を分析できるが、前記ｃｔＤＮＡの量（濃度）またはコピー数が増加する場合、癌が発生または進行するという情報を提供できる。
このように、本発明は、表面改質した導電性高分子よりなる平面構造体またはナノ構造体の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出および分離のための多様な用途を全部含む。
本発明によるセルフリーＤＮＡ検出用構造体は、電気化学的に表面改質した導電性高分子を含むことによって、電圧の調節を通じて導電性高分子の正電荷または負電荷への転換が可能であるので、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などを含むセルフリーＤＮＡの付着および分離が容易であり、検出効率が顕著に向上するため、循環腫瘍ＤＮＡを電気的信号により効果的に検出および分離することによって、究極的に、癌発病の診断および予後予測に非常に有用であると期待される。
本発明のナノ構造体Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを利用して循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出および分離する方法を示す概念的模式図である。 本発明のナノ構造体Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓの上面図を示すＦＥ−ＳＥＭイメージである。 導電性高分子ポリピロールの酸化−還元によるＤＮＡ捕獲および放出（分離）機序を示す式である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 本発明のナノワイヤー構造体を利用して電圧および時間の調節を通じてｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 導電性高分子ポリピロールの平面構造体およびナノ構造体のｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 １．０μｍのナノ構造体を使用してｃｆＤＮＡの濃度別に付着および分離能力を評価した結果である。 多様なサイズのＤＮＡを正常ヒトの血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）にスパイクした後、ｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 多様なサイズのＤＮＡを正常ヒトの血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）にスパイクした後、ｃｆＤＮＡの付着および分離能力を評価した結果である。 正常ヒト、乳癌および肺癌患者の血液内に存在するｃｆＤＮＡを本発明のナノワイヤー構造体と商業用Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いて分離した後に濃度を比較した結果である。 乳癌および肺癌患者の血液内に存在するｃｆＤＮＡを本発明のナノワイヤー構造体と商業用Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いて分離した後に電気泳動を通じてＤＮＡの存在有無を確認した結果である。本発明のナノワイヤー構造体を用いて分離したｃｆＤＮＡは、癌特異的ｃｔＤＮＡの特徴である小断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の形態で存在することを確認し、商業用Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔを用いて分離したｃｆＤＮＡは、濃度が低いため、すべての患者で観察されなかった。 導電性高分子ポリピロールナノ構造体を利用して電気刺激によりｃｆＤＮＡを付着（左側、中間）および分離した場合（右側）を共焦点顕微鏡で観察した結果である。 乳癌および肺癌患者の血液内に存在するｃｆＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ｋｉｔおよびナノ構造体Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを使用して検出した後にＰＣＲ増幅して比較した結果である。 加えられた電圧によって多様な粗度を有するポリピロール平面構造体を用いて血液内循環するｃｆＤＮＡの分離（放出）結果である。
本発明で使用される用語に関する定義は、以下の通りである。
「対象」または「患者」は、ヒト、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ、トリ、昆虫などを含んで治療が要求される任意の単一個体を意味する。また、任意の疾病臨床所見を示さない臨床研究試験に参加した任意の対象または力学研究に参加した対象または対照群として使用された対象が対象に含まれる。本発明の一実施例では、ヒトを対象とした。
「循環腫瘍細胞」（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ，ＣＴＣ）は、対象者のサンプルで発見される任意の癌細胞を意味する。ＣＴＣは、一般的に、進行した癌を有する患者の循環血液で非常に低濃度で発見される固形腫瘍から離脱した上皮細胞である。また、ＣＴＣは、原発性、２次または３次腫瘍から発生する細胞である。「循環腫瘍細胞」（ＣＴＣ）は、癌細胞を含むが、前記用語は、また、循環血液で通常的に発見されない非腫瘍細胞、例えば、循環上皮または内皮細胞を含むものである。したがって、腫瘍細胞および非腫瘍上皮細胞も、本発明のＣＴＣの定義内に含まれる。
「癌」は、異形成、多形性、固形腫瘍および造血幹細胞癌を含めて当該分野に公知となっている多様な癌類型を含み得るが、これに限らない。多くの類型の癌が、例えば、転移した原発性癌から引き起こされた２次癌のように、循環腫瘍細胞を転移させ流したり、または転移性であるものと知られている。また、他の癌としては、次の臓器または器官：脳、心臓、肺、胃腸、泌尿生殖管、肝、骨、神経系、婦人科、血液、皮膚、乳房および副腎の癌を含むことができるが、これに限らない。また、他の類型の癌細胞としては、神経膠腫（神経鞘腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ）、膠芽細胞腫、星状細胞腫）、神経芽細胞腫、褐色細胞腫、傍神経節腫、髄膜腫、副腎皮質癌、髄芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎臓癌、多様な類型の血管癌、骨芽細胞性骨肉腫（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ ｏｓｔｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、卵巣癌、子宮筋腫、唾液腺癌、脈絡叢腫瘍、乳癌、膵臓癌、結腸癌および巨大核細胞性白血病；および、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、カポジ肉腫（Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、異形成母斑（ｍｏｌｅｓ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｎｅｖｉ）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、線維肉腫または血管肉腫のような肉腫、および黒色腫を含む皮膚癌が含まれる。
「サンプル」は、本発明によって提供された方法に適した任意のサンプルのことを言う。サンプルの供給源として、全血、骨髄、胸水、腹膜液、中枢脊髄液、尿、唾液および気管支洗浄液が含まれる。一様態において、サンプルは、例えば、全血またはその任意の分画または成分を含む血液サンプルである。本発明に使用するのに適した血液サンプルは、血液細胞またはその成分、例えば、静脈、動脈、末梢血、組織、臍帯血などを含む公知の任意の供給源から抽出され得る。
また、「蛋白質」は、基準蛋白質と本質的に同じ生物活性または機能を有する、蛋白質の断片、類似体および誘導体を含むものである。
「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という用語は、リボヌクレオチドだけでなく、デオキシリボヌクレオチドなどのあらゆる長さのヌクレオチド重合体を意味する。この用語は、分子の１次的構造のみを意味し、したがって、二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。また、これは、変形の知られた類型、例えば当該分野において知られた標識（ｌａｂｅｌ）、メチル化、「ｃａｐｓ」、類似体の一つあるいはそれ以上の自然発生のヌクレオチド置換、脱結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメートなど）と結合（例えば、 ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリリジンなど）などの付属物を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）を有するもの、キレート（例えば、金属元素、放射性金属元素、ホウ素、酸化金属元素など）を有するもの、アルキル化合物を有するもの、変形した結合（例えば、ａｌｐｈａ ａｎｏｍｅｒｉｃ核酸など）を有するもの、また、ポリヌクレオチドの非変形を含むヌクレオチド間の変形を意味する。
「プライマー」は、相補性ＲＮＡまたはＤＮＡ標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションし、例えばポリメラーゼ連鎖反応で発生するヌクレオチジルトランスフェラーゼの作用によりモノヌクレオチドからポリヌクレオチドの段階的合成のための出発点として機能するオリゴヌクレオチド配列を意味する。
「機能的等価物」という用語は、例えば、基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）配列から一つまたはそれ以上の置換、欠失または付加、基準配列と実験（ｓｕｂｊｅｃｔ）配列との間の多様な機能的非類似性を産まない実際効果（ｎｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）など、変化した突然変異配列のヌクレオチドと核酸配列すべてを意味する。本発明による実質的等価物である、例えば突然変異、アミノ酸配列は、羅列されたアミノ酸配列と、好ましくは、最小限８０％の配列同一性、より好ましくは、最小限９０％の配列同一性を有する。実質的等価物である本発明のヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子暗号の重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）または縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を考慮するとき、さらに低い百分率の配列同一性を有し得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも約６５％の同一性、より好ましくは、最小限約７５％の同一性、最も好ましくは、約９５％の同一性を有し得る。
抗癌剤「耐性」とは、癌細胞が抗癌剤に対応して遺伝子変化を起こすことにより、抗癌剤の攻撃を避けて抗癌治療の効果を弱化させることをいう。前記「耐性」という用語は、「抵抗性」という用語と同じ意味で使用され得る。
「治療」は、臨床結果を含んで有利な、または所望の結果を得るための接近法である。疾患、障害または病態の「治療」または「緩和」は、障害を治療しないことと比較して、病態、障害または疾患状態の程度および／または好ましくない臨床兆候が少なくなり／少なくなるか、経時的な進行推移が遅くなるか、長くなることを意味する。例えば、肥満治療において、体重減少、例えば、少なくとも５％の体重減少は、好ましい治療結果の例である。本発明の目的のために、有利なまたは好適な臨床結果は、検出可能または検出不能であるか否かと関係なく、１種類以上の症状の軽減または改善、疾患程度の縮小、疾患の安定化した（すなわち悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および鎮静（部分的または全体的）を含むが、これに限らない。また、「治療」は、治療を受けない場合に、予想される生存と比較して生存を延長させることを意味する。また、治療は、１回用量の投与によって発生する必要がなく、一連の用量の投与時に頻繁に発生する。したがって、治療上の有効量、緩和に十分な量、あるいは疾患、障害または病態の治療に十分な量が１回以上の投与で投与され得る。
「約」とは、参照量、水準、値、数，頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変わる量、水準、値、数，頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
本明細書において、文脈で別途に必要でない場合、「含む。」および「含む」という用語は、提示された段階または元素、あるいは段階または元素の群を含むが、任意の他の段階または元素、あるいは段階または元素の群が排除されないことを内包すると理解すべきである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、導電性高分子を利用したセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体およびその利用に関する。
特に、循環腫瘍ＤＮＡを含むセルフリーＤＮＡを効果的に検出し分離し得る、表面改質した導電性高分子で構成された平面構造体またはナノ構造体およびその利用に関する。
＜導電性高分子＞
本発明のセルフリーＤＮＡ検出用構造体は、導電性高分子で構成されることを特徴とする。
前記導電性高分子（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ）は、高分子の軟性と、製造容易性の長所を有すると同時に、金属や半導体の電気的、磁気的および光学的性質を同時に有しているので、化学や物理分野の他にも、広範囲な産業的分野において有用な物質として多く使用されている。特に、加工の容易性、高い電気伝導度、優れた生体親和力、環境的安定性および可逆的体積変化などのような色々な長所があるため、バイオセンサー、組織工学、神経プローブ、薬品伝達、バイオ作動器に使用されている。
本発明で使用できる導電性高分子としては、ポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）、ポリアセチレン（ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、ポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）、ポリチオフェン（ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ポリ窒化硫黄（ｐｏｌｙ ｓｕｌｆｕｒ ｎｉｔｒｉｄｅ）およびそれらの誘導体が挙げられる。
最も好ましい導電性高分子として、ポリピロールを使用する。
前記ポリピロールは、優れた生体内安定性および酸化による膨張と還元の反復的な収縮現象に起因して、体内移植用医療用作動器を含むマイクロポンプの薬品伝達体系の材料として選択されている。特に、導電性高分子の電気重合過程でアニオンとのドーピング／ 脱ドーピングメカニズムによる可逆的な体積膨張および収縮現象は、薬物伝達素材として注目されている。また、前記ポリピロールは、電気重合による酸化−還元反応によって導電性フィルムにコーティングされ得、化学／バイオセンサー、スーパーキャパシタの製作など実用的な目的で使用される。
前記ポリピロールは、下記のような方法などにより合成するか、相溶性ポリマーを購入して使用し得る。
特に、前記ポリピロールを使用する場合、電気刺激だけでもポリピロール平面構造体またはナノ構造体の電荷を変化させるため、従来のＤＮＡ分離による前処理過程が不要であり、ポリピロールの表面に付着したＤＮＡも、別途の過程なしに電気刺激により容易に回収できるという長所がある。
以下で別途の説明がない限り、前記化合物は、化合物それ自体、薬剤学的に許容されるその塩、水和物、溶媒化物、異性体およびプロドラッグを全部含む概念として使用される。
前記導電性高分子化合物は、当業界に知られた方法、その変形した方法などで製造して使用し得、商業的に販売するものを購入して使用してもよい。すなわち、公知の方法を参照して当該分野における技術に基づく多様な方法によって適切に変形させて使用し得る。例えば、当該分野の専門家にとって明白な変形により、例えば、干渉物質を適切に保護したり、当該分野に公知となった他の適当な試薬に交換したり、または反応条件を通常的に変化させることにより成功裏に行われ得る。
＜導電性高分子で形成された構造体＞
本発明は、一態様において、前記導電性高分子としてｃｆＤＮＡの検出および分離、好ましくは、ｃｔＤＮＡの検出および分離用構造体およびその用途に関する。
特に、図３に示されるように、前記構造体を構成する導電性高分子を電気化学的に表面改質して循環セルフリーＤＮＡの付着性および特異性を増加させることを特徴とする。
電気化学的表面改質
分析物質を認識するために生体物質を電気的に蒸着された（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）導電性高分子に固定化する技術が必要である。
本発明では、色々な固定化技術のうち電気化学的に表面を活性化させて生体物質を固定する方法を利用し、これは、所望の物質を必要な位置に空間選択的に固定させることができるように正電荷または負電荷に帯電させる方法を意味する。
好ましくは、負電荷を帯びるＤＮＡの分離を容易にするために、電気刺激により前記導電性高分子表面が改質して正電荷を帯びるようにする。
前記導電性高分子よりなるナノ構造体の表面特性を変化させるために使用できる正電荷を帯びた物質は、ＡＰＴＥＳ（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）を含むアミノシラン（ａｍｉｎｏ ｓｉｌａｎｅ）、ナイロン（Ｎｙｌｏｎ）、ニトロセルロース（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）およびポリリジン（Ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）よりなる群から選択される一つ以上であることが好ましいが、前記正電荷を帯びた物質の種類および処理される濃度に応じてナノ構造体の表面が正電荷を帯びる表面特性が変わるため、前記ナノ構造体の表面に処理される正電荷を帯びた物質の種類または処理される密度に応じて調節されるナノ構造体の表面特性の変化の程度に応じて検出できるＤＮＡのサイズが決定され得る。
前記導電性高分子の表面改質は、前記構造体を形成する前に、同時にまたは後に当業者が適切に行うことができることは自明である。
前記表面改質した導電性高分子よりなる、ｃｆＤＮＡの検出および分離用構造体は、平面構造体またはナノ構造体で製作され得る。
一具体例として、本発明は、前記導電性高分子を生体と類似した環境に変形するために、ナノ構造体を形成して利用し得る。
非制限的に、ナノ多孔性構造（ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、ナノワイヤー構造体（ｎａｎｏｗｉｒｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のような３次元の生体模倣型構造体を利用できる。このようなナノ構造体は、生体内の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）と類似した構造を示すことによって、細胞の生長と分化を増進させ、生体組織との相互作用を最大化させる。
前記ナノ構造体は、公知の任意の方法を利用して製作できる。例えば、（ｉ）ナノ粒子合成に用いられるレーザー熱分解や薄膜蒸着に用いられる原子層蒸着などを含む蒸気相粒子成長、（ｉｉ）ナノ粒子を形成するためのコロイド方法と断層磁気結合技術が含まれる液相成長、（ｉｉｉ）金属ナノ粒子を作るための相分離方法のような固相における粒子製造、（ｉｖ）気−液−固相（ＶＬＳ）におけるナノワイヤー成長のようなハイブリッド方法などが利用できる。
本発明は、鋳型上に電気的方法で製作、溶液内で成長、または異方性成長などの方法で作るナノロッドまたはナノワイヤーを使用できる。導電性高分子で製作できるナノ構造体の形態には制限がないが、最も好ましくは、ナノワイヤー（Ｎａｎｏｗｉｒｅ）構造体で製作できる。
前記ナノワイヤーとは、ナノメートルのサイズの直径を有し、且つ、数百ナノメートルから数百マイクロメーターの長さを有する構造をいう。
前記ナノワイヤーは、合成過程でサイズ界面特性および電子的特性を正確に調節でき、このように合成されたナノワイヤーを利用して多量の並列組立てが可能であるという長所を有する構造である。
最近、機能的ナノ材料を作るのにテンプレート（鋳型）重合を多く使用している。テンプレートと蒸着条件に応じて重合されたナノ構造の長さと直径および密度の調節が可能であるからである。
好ましくは、正極酸化で形成されたアルミニウム酸化物（ａｎｏｄｉｃ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｏｘｉｄｅ，ＡＡＯ）でナノ気孔を有する構造をテンプレートとして使用できる。前記気孔が多いＡＡＯは、金属やセラミックよりなるナノワイヤーやナノチューブを生産するための一般的なテンプレートとして主に使用されている。前記ＡＡＯは、熱に非常に安定的であり、高密度（１０９〜１０１１／ｃｍ２）で垂直であり、且つ、整列したナノチャネルを有する。本発明の一実施例でも、正極酸化で形成されたＡＡＯでナノ気孔を有する金（Ａｕ）ナノワイヤーを製作した。
本発明のフリー−スタンディング（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）のナノワイヤー構造体は、それぞれのナノワイヤー柱の表面改質を通じてｃｔＤＮＡの付着力を大きく増大させ、多様な長さおよび直径に応じた広い表面積によって効率が極めて向上した検出効果を有する。
他の具体例として、本発明は、前記導電性高分子にて平面構造体の形態で簡単に製作して利用できる。
前記説明したナノ構造体、具体的にナノワイヤーだけでなく、ポリピロール高分子のコーティング時に、表面を電気化学的に改質することで、平面構造体の形態で簡単に製作して、ｃｔＤＮＡの付着力を大きく増大させ、電圧の調節によりｃｔＤＮＡの検出効率を高めることができることを本発明の一実施例で確認した。
このように、本発明の導電性高分子よりなる構造体は、外部の電気刺激のみにより反応が起こるので、付着したｃｔＤＮＡを電気的信号によってのみ分離でき、ｃｔＤＮＡの特異的および効果的検出が可能である。
＜ｃｆＤＮＡ＞
本発明の導電性高分子よりなる構造体は、循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、特に循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出および分離するのに有用である。
循環セルフリーＤＮＡは、血液中に存在する細胞から遊離したＤＮＡを総称して示すものであり、ＤＮＡの由来およびソース（ｓｏｕｒｃｅ）の種類に制限なく、本発明の検出および分離対象となる。ただし、本発明の最も好ましい例として、ＣＴＣ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）から遊離した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。
癌患者の血液には、アポトーシスおよびネクローシスによる癌細胞の死滅に起因して血流の中に放出された腫瘍のＤＮＡフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、すなわちｃｔＤＮＡが含まれている。一般的に、正常な細胞の血液内の内容物は、大食細胞により瞬間に処理されるが、癌細胞が破壊されて出るｃｔＤＮＡの量は、食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）により処理され得る量を超えるようになるが、１００ｇの腫瘍、すなわち３＊１０１０の癌細胞を有する癌患者において最高３．３％のｃｆＤＮＡが毎日血流の中に放出されていると報告されている。平均的に、７０から２００塩基対の小さいフラグメントから２１ｋｂｐに至る大きいフラグメントのｃｔＤＮＡが存在する。しかし、多くの癌由来ｃｆＤＮＡは、２００ｂｐ以下の小さいフラグメントで存在する。
一般的に、正常ヒトは、血液内に平均的に３０ｎｇ／ｍｌ未満のＤＮＡを有しているが、癌患者の血液には、平均１８０ｎｇ／ｍｌのｃｔＤＮＡが存在し、原発性癌患者の場合、腫瘍部位を除去すると、血液内存在するｃｔＤＮＡの量が正常ヒトの水準に低下するのに対し、転移性癌患者の場合は、依然として高い数値のｃｔＤＮＡ値を示す。
したがって、ｃｔＤＮＡは、初期癌の発見だけでなく、治療過程のモニタリングのためにも非常に重要な役目をする。すなわち、血液内に存在するｃｔＤＮＡを検出する場合、腫瘍の状態を把握できる重要な端緒になり得る。
特に、前記ｃｔＤＮＡの場合、２時間未満の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有するので、腫瘍に対する最新情報、すなわち癌細胞特有の突然変異およびその他の遺伝的変化を提供できるという点も、非常に有利な情報になり得る。
従来の蛋白質マーカーは、血中蛋白質濃度の増加が、癌発生の他にも、正常細胞で他の原因によって上昇し得るため、偽陽性（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と示される短所が存在し、また、多くの蛋白質マーカーが数週にわたって血液内に存在するので、腫瘍の現在の状態を正確に伝達するのに限界があるのに対し、本発明の検出および分離対象であるｃｆＤＮＡ，好ましくはｃｔＤＮＡは、このような問題点を解決する長所もある。
なお、本発明のｃｔＤＮＡの検出および分離に使用するサンプル供給源としては、全血、骨髄、胸水、腹膜液、中枢脊髄液、尿、唾液および気管支洗浄液が含まれる。好ましい一具体例として、前記サンプルは、全血またはその任意の分画または成分を含む血液サンプルである。
本発明に使用するのに適した血液サンプルは、血液細胞またはその成分、例えば、静脈、動脈、末梢血、組織、臍帯血などを含む知られている任意の供給源から抽出され得る。例えば、サンプルは、公知となっており、通常の臨床方法（例えば、全血を採取および処理するための手続）を利用して収得され処理され得る。一態様において、例示的なサンプルは、癌を有する対象者から採取された末梢血であってもよい。
前記サンプルの量（体積）は、当業者が適宜選択して決定できるが、通常、１〜２０ｍＬ、好ましくは、３〜７ｍＬである。
一般的に、サンプルとして使用される体液（特に、血液）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（目的に応じて０．２５１ｍＭのＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）であって、例えば、２〜２０倍で希釈した後に濾過して使用する。特に血液量や血球数が多い場合には、前処理を行ってもかまわない。
＜検出方法＞
したがって、さらに他の観点において、本発明は、前記ナノ構造体を利用する循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出または分離する方法に関する。このような方法に関する概念的な模式図を図１に示した。
前記方法は、一具体例として次の工程を含んで行うことができる：
（ｉ）平面構造体またはナノ構造体を形成する導電性高分子の表面を正電荷に改質する段階；
（ｉｉ）生物学的試料を処理して前記導電性高分子にｃｆＤＮＡを付着させる段階；および
（ｉｉｉ）電気的信号を加えて前記導電性高分子からｃｆＤＮＡを検出または分離させる段階。
前述したように、平面構造体を形成したり、多様な直径および長さの導電性高分子を利用してナノ構造体、例えばナノワイヤー構造体を形成した後、電気化学的方法で導電性高分子の表面を改質する。
この際、使用できる電気化学的方法は、公知の任意の方法が使用できる。検出または分離しようとするＤＮＡの電荷的特性に応じて正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）または負（ｎｅｖａｔｉｖｅ）に導電性高分子の表面を改質させることができるが、好ましい例としては、負電荷を帯びるｃｆＤＮＡの付着および分離を容易にするために正電荷に改質する。
特に、多様な直径および長さの導電性高分子を利用してナノ構造体で形成する場合、構造体の表面を粗くすることによって、表面対体積領域の比率を高めることによって、かなり多くの量のｃｆＤＮＡが付着できるようにする（ＤＮＡ捕獲）。また、このような構造は、前記ｃｆＤＮＡとの相互作用を増進させる効果を有し得る。
次に、このような構造体に生物学的試料サンプル、好ましくは、血液を処理して生物学的試料を処理し、前記導電性高分子にｃｆＤＮＡを付着させる。
この際、前記導電性高分子にｃｆＤＮＡの付着は、０．８〜１．２Ｖで２０〜４０秒間電気を加えて行うことが好ましい。
具体的に、平面構造のポリピロール（Ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ；Ｐｐｙ）フィルムに表面粗度を高めるために、電気重合（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を行うとき、多様な電圧、すなわち０．８Ｖから１．８Ｖを使用した。電気重合の電圧が高くなるほど、表面粗度も高くなって表面積が大きく増加し、ＤＮＡの結合部位が増加して、ＤＮＡ捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）／放出（ｒｅｌｅａｓｅ）効率が増加する。実際に分析結果、０．１Ｍのピロールと０．０１Ｍ のＰＳＳの溶液で１．５Ｖの電圧を５分間加えた後に製作されたＰｐｙ平面構造体フィルムがＤＮＡの捕獲に最大の効率を示すものと確認して、平面構造体Ｐｐｙフィルムを製作するときに、基本条件として使用した。平面Ｐｐｙフィルムを１．５Ｖの電圧で５分間電気重合を通じて製作した後、Ｐｐｙ表面の正電荷を最大化させるために、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで＋１．８Ｖを２分間加えることで、Ｐｐｙの過酸化を誘導した。過酸化された平面Ｐｐｙフィルムを患者の血漿に培養した後、＋１．０Ｖを３０秒間加えてＤＮＡ捕獲を試みた。確認の結果、平面構造体ＰｐｙフィルムのＤＮＡ捕獲効率がナノ構造体を使用したときと類似して示されることを確認した。捕獲されたＤＮＡを１．３Ｖの電圧を３分間加えて効果的に放出することができた。
次に、電気的信号を加えて、前記捕獲されたｃｆＤＮＡを分離して放出させる。
この際、導電性高分子からｃｆＤＮＡを分離させるために、ナノ構造体の場合は、約−１．３〜−１．０Ｖで４〜６分間電気的信号を加えて、前記ｃｆＤＮＡを分離させることができ、１．３〜１．８Ｖ、最も好ましくは、１．３Ｖの酸化電圧（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ）を経る。また、平面構造体の場合は、約−１．３〜−１．０Ｖで４〜６分間電気的信号を加えて、前記ｃｆＤＮＡを分離させることができ、１．３〜１．８Ｖ、最も好ましくは、１．５Ｖの酸化電圧（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ）を行う。
また、前記分離したｃｆＤＮＡは、標識などを通じて確認できる。
検定に使用される特定の標識または検出可能な物質は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能であり、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であってもよい。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。
有用な標識は、アレクサフルオル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）蛍光染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識、その他イメージング剤、例えばマイクロバブル（超音波映像化用）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通用される西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼなど）、および比色標識、例えばコロイド性金または有色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズを含む。
標識検出手段は、当業者に周知である。例えば、標識が蛍光標識である場合、蛍光色素を光の適当な波長で励起させ、生成される蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真用フィルムにより、電子検出器、例えば電荷カップリング素子（ＣＣＤ）または光電増倍管などの使用により顕著に検出され得る。
本発明の前記方法は、例えば、次のような長所がある。
（ｉ）ｃｆＤＮＡの付着および分離が容易である：導電性高分子に正の電圧（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｖｏｌｔａｇｅ）を短時間、例えば、１分程度加え、サンプル内に存在するＤＮＡを処理して、約１Ｖで約３０秒間反応させるだけでも、ｃｆＤＮＡ、好ましくは、ｃｔＤＮＡを容易に付着できる。また、付着したＤＮＡを回収するために、約−１．３Ｖを約５分間加えると、９０％以上の回収が可能である。したがって、従来使用された正に帯電した高分子または他の分子を使用することなく、ＤＮＡをサンプルから付着および分離できる。
（ｉｉ）付着率に優れ、検出方法が効率的である：フリー−スタンディングナノワイヤー構造体の場合は、それぞれのナノワイヤー柱の表面改質が可能であるため、広い表面積によってｃｔＤＮＡの付着力を大きく増大させることができる。また、導電性構造体は、外部の電気刺激のみにより反応が起こるため、付着したｃｔＤＮＡを電気的信号のみにより分離することができる。
（ｉｉｉ）血液内に存在するＤＮＡだけでなく、唾液、尿、大便のような体液内のＤＮＡも、分離可能である。
（ｉｖ）小さいサイズのＤＮＡ（ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ）の検出が可能である。
＜検出キット＞
さらに他の観点において、本発明は、前記構造体を含む循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出または分離用装置、例えばキットに関する。
一具体例として、正電荷を帯びるように表面特性が変化した構造体を有する固体基板と、前記固体基板の構造体に電圧を印加する電極と、前記構造体をＤＮＡを含有する試料が通過するときに発生する電気的信号を測定する測定部とを含むＤＮＡ検出装置（キット）を提供できる。
場合によっては、固体基板と連結され、前記構造体に投入される試料が保管される試料貯蔵チャンバーをさらに含むことができる。
前記ＤＮＡ検出装置（キット）は、生物サンプルでｃｆＤＮＡ水準を測定するための反応試薬を含むが、生物サンプル内ｃｆＤＮＡ水準は、非制限的な例として、任意の核酸染料、例えばインターカレーターなどの当該技術分野に公知となった任意の技法で測定できる。
ｃｆＤＮＡ水準を測定するのに使用され得、本発明によるキットに含めることができる、ＤＮＡインターカレーターに関する非制限的な例としては、ベルベリン（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、臭化エチジウム、プロフラビン、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、 サイバーグリーン（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ）、サイバーゴールド（Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ）およびピコグリーンＰｉｃｏＧｒｅｅｎを含む。
＜その他の用途＞
さらに他の観点において、本発明は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出および分離して分析することを含む、対象者で癌の発病および予後を診断するために情報を提供する方法に関する。
また、本発明は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出および分離して分析することを含む、対象者の癌の発病および予後の診断方法に関する。
本発明で前記「癌」は、哺乳類で典型的に調節されない細胞成長により特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。診断対象となる癌は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）、芽細胞腫（ｂｌａｓｔｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、神経内分泌腫瘍（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、悪性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、扁平細胞癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、腹膜癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌種（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃腸管癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜または子宮癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｏｒ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、外陰癌（ｖｕｌｖａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌腫（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌腫（ａｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｌｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胆道癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒａｃｔ）および頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）よりなる群から選択され得る。好ましくは、前記癌は、乳癌、肺癌、胃癌、肝癌または膵臓癌である。
本発明の方法は、前記癌患者および癌に対する危険があるヒトを評価するために使用され得る。本願に記述された診断または予測方法のうち任意の方法で、一つ以上の癌の指標、例えば、癌細胞、または任意の他の疾患の存在または不在が診断または予後を提供するために使用され得る。このために、サンプルからｃｔＤＮＡの量（濃度）、コピー数または塩基配列を分析し特性化し得る。
ｃｔＤＮＡの分析および特性化は、対象者の進行および病理を評価するために多様な間隔で特定時間の間に行われ得る。例えば、時間の関数で追跡するために、１日、２日、３日、１週、２週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年のように規則的な間隔で行われ得る。
時間の経過に伴うｃｔＤＮＡ量（濃度）またはコピー数において２倍、５倍、１０倍以上になる任意の増加は、患者の予後を低下させ、患者が治療を変更すべき早期指標である。同様に、２倍、５倍、１０倍以上になる任意の増加は、患者が予後および治療に対する反応をさらに評価するためにイメージング化のような追加の検査を受けなければならないことを示す。
時間の経過に伴うｃｔＤＮＡ量（濃度）またはコピー数において任意の減少は、疾患の安定化および治療に対する患者の反応を示し、治療を変更しない指標である。癌の危険があるヒトの場合、検出されたｃｔＤＮＡ量（濃度）またはコピー数の突然の増加は、患者に腫瘍が発生または進行したという早期警告を提供して、早期診断を提供できるようにする。
前記方法において、他の臨床評価を提供するために、他の分析をさらに行うことができる。例えば、映像分析の他に、遺伝子発現分析およびＰＣＲ技術、例えば、ｃｔＤＮＡが由来した腫瘍の類型、転移状態および悪性の程度のような情報を得るための遺伝子チップ分析および特定癌のマーカーに対して特異的なプライマーを使用した多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を利用できる。また、患者の癌の特性化に関する追加の情報を評価するための手段として、細胞のサイズ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析、プロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）分析またはメタボローム（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ）分析を行うことができる。多様な様態において、分析は、次のマーカーのうち一つ以上に特異的なプライマーに対して誘導された抗体または前記プライマーを使用したＰＣＲ多重化を含む：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＣＣ１、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カデリン、ムチン−１、サイトケラチン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＲＭ１、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲストロン受容体、ＩＧＦ１、ｃＭＥＴ、ＥＭＬ４または白血球関連受容体（ＬＡＲ）。
また、本発明は、特定の治療療法に対する対象者の反応性を決定したり、または癌治療において候補薬剤の効果を決定するのに十分なデータを提供できる。
例えば、一旦、薬物治療が患者に施行されると、本発明の方法を利用して薬物治療の効能を測定することが可能である。例えば、薬物治療前に患者から取ったサンプル、および薬物治療と同時にまたは薬物治療に引き続いて患者から取った一つ以上の細胞サンプルを本発明の方法を利用して処理できる。それぞれの処理されたサンプルの分析結果を比較することによって、薬物治療の効能または薬剤に対する患者の反応性が決定できる。このような方式で、失敗した化合物に対する初期確認が行われ得るか、または有望な化合物に対する初期検証が行われ得る。
また、本発明は、特定の臨床試験に対する候補対象者を決定する方法を提供できる。例えば、候補の検出されたｃｔＤＮＡを分析して、臨床試験の特定の治療療法が可能に成功裏であるか否かを決定するために、特定のマーカーが存在するかを決定できる。
また、臨床試験の間に、ｃｔＤＮＡの分析は、患者が実験薬物に反応するかまたは反応しないかに関する情報をも提供できるのであり、この際に確認されたｃｔＤＮＡの実質的な無変化または減少は、反応を示し、確認されたｃｔＤＮＡ増加は、不良な反応を示す。前記情報は、薬物効果に対する初期指標であり、臨床試験で２次エンドポイントとして研究者により利用され得る。
このように、本発明は、表面改質した導電性高分子よりなる３次元ナノ構造体の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出および分離のための多様な用途を全部含み、これにより、特に、循環腫瘍ＤＮＡによる癌発病の診断および予後に関する有用な情報を提供することによって、選択的、個別的抗癌治療に非常に有用である。
［材料および方法］
１．Ｐｐｙ−コーティングされたＡｕ ＮＷｓ（Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓ）の製作
従来、熱蒸着（ｔｈｅｒｍａｌ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）技術を利用して、略１５０ｎｍ厚さのＡｕレイヤーをＡＡＯ鋳型（Ｗｈａｔｍａｎ；ポア直径、１００ｎｍ）の一面にコーティングした。金−プレーティング溶液（Ｏｒｏｔｅｍｐｓ ２４ ＲＴＵ Ｒａｃｋ）を利用してＡｕナノワイヤーを電気化学的にＡｕ−ｂａｃｋｅｄ ＡＡＯメンブレンのポア内に成長させ、循環電圧電流法（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）を適用して１００ｍＶ／ｓ速度で１．１〜０Ｖの電位範囲を使用してＰｐｙをＡｕナノワイヤーの表面に蒸着するようにして、Ｐｐｙ−コーティングされたＡｕ ＮＷｓを製作した。
すべての電気化学的実験は、Ａｇ／ＡｇＣｌ、プラチニウムワイヤーおよび考案されたプラットホームが参考、カウンター、作業用電極としてそれぞれ使用された３電極細胞でポテンショスタット／ガルバノスタット（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＳＰ−１５０）を利用して行われた。導電性炭素ペーストを利用してインジウムスズ酸化物（ｉｎｄｉｕｍ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ，ＩＴＯ）上に固定した後、前記生成されたメンブレンを水溶性ＮａＯＨ溶液（２Ｍ）に４時間溶解させてＡＡＯ鋳型を除去し、究極的に、明確な長さのＡｕ ＮＷｓの垂直に配列されたアレイを生成した。
Ｐｐｙ−コーティングされたＡｕ ＮＷｓを製造するために、０．０１Ｍのピロールおよび０．０１Ｍのポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＰＳ）の水溶性混合物において、０．８Ｖ（ｖｅｒｓｕｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）で２０秒間クロノアンペロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＣＡ）を利用してフリースタンディングＡｕ ＮＷｓ上にＰｐｙの電気化学的蒸着を行った。結果として得られたＰｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを水で数回洗浄し、＋１．８Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）で２分間適用することによって、銀層のＰｐｙの電気化学的過酸化のためにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でインキュベートした。
このように、導電性高分子であるポリピロール（Ｐｐｙ）を多様な長さおよび直径を有するナノワイヤーで製作した後、図１に示されるように、導電性ナノワイヤー構造体の電気的な方法による表面改質を通じて正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）または負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）への転換を可能にすることによって、血液内に存在する負電荷を帯びるｃｆＤＮＡの付着および分離を容易にした。
２．サンプルの収集および製作
ＮＣＣ臨床試験審査委員会により承認を受けた手続を利用して抗凝固剤ＥＤＴＡを含有する真空採血器チューブに全血を収集した。冷蔵遠心分離機（３０００ｘｇ、１０ｍｉｎ）を利用して血漿を分離した。Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓプラットホームの捕獲および放出効率を評価するために、健康な供与者から２００μｌの血漿内にＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）のｅｘ ｖｉｖｏスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）により製作された人工血液サンプルを利用してこれらをテストした。臨床適用のために、３名の健康なボランティアおよび乳癌と肺癌患者１７名から血液サンプルを収集した。
３．ＤＮＡ捕獲（Ｃａｐｔｕｒｅ）および放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）
ＤＮＡ捕獲効率を評価する前に、個別的なナノワイヤーとＤＮＡの相互作用を促進するために、過酸化したＰｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを血液サンプルに３０分間常温で沈漬した：前記サンプルは、（ｉ）ヒト血漿にスパイクしたＤＮＡ分子（２５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する人工サンプル、または（ｉｉ）３名の健康な供与者および１７名の癌患者から収得した未処理の血漿サンプル（２００μＬ〜１ｍＬ）である。
次に、＋１．０Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）で３０秒間即刻のＤＮＡ捕獲を行った。捕獲したＤＮＡを放出するために、Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを−１．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）で５分間刺激した。前記捕獲および放出されたＤＮＡをＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析法を利用して定量化した。
前記収得したＤＮＡを２６０および２８０ｎｍで分光光度法で測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比率を利用して捕獲し放出したＤＮＡの純度を評価した。Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓおよびＤＮＡの間の相互作用をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡の下でＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光を検査することによって可視化した。
４．ＰＣＲおよびゲル電気泳動
すべてのプライマーを合成して使用した（マクロジェン、韓国）
ＤＮＡラダー（ｌｏｗ：１０〜１００ｂｐ；ｍｉｄｄｌｅ：１００ｂｐ〜２ｋｂ；ｈｉｇｈ：３．５〜２１ｋｂ）をバイオニア（韓国）から購入した。すべてのＰＣＲ増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）で、鋳型ＤＮＡ、２オリゴヌクレオチドプライマー（５ｐＭ）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチンおよび１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含有する、最終反応体積２０μＬで行った。
ＰＣＲ増幅は、４５サイクルの変性（９４℃、３０ｓ）、アニーリング（６４℃、３０ｓ）および伸張（７２℃、３０ｓ）で構成した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、Ｅｔｂｒ（臭化エチジウム、ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して、UVトランスイルミネーターの下でその存在を可視化した。
５．ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｋｉｔ）
ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットを利用して１ｍＬの血漿からｃｆＤＮＡを抽出した。簡略に述べると、血漿サンプルをプロテイナーゼＫおよび溶解バッファーを利用して溶解し、循環する核酸を真空圧力を利用してシリカに結合させた。ＤＮＡフラグメントを数回の洗浄段階後に、メンブレンから回収した。
６．デジタルＰＣＲ
ｃｆＤＮＡでＥＧＦＲ突然変異を、ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｄｄＰＣＲ突然変異分析法を利用してＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上でＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒおよびエクソン１９欠失（ｐ．Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ）に対して検出した。水−油エマルジョンドロップレットを８μＬのｃｆＤＮＡ、１０μＬのｄｄＰＣＲスーパーミックス、および２μＬのターゲットプライマーおよびプローブを含有するＰＣＲ混合物から生成した。前記ドロップレットを生成した後、ＰＣＲをサーマルサイクラーで行った。増幅されたＤＮＡの少なくとも一つのコピーを含有する陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ドロップレットを蛍光分析法に対するドロップレットリーダーにより検出することができた。
７．ＥＧＦＲ遺伝子に対する突然変異テスト
一次腫瘍組織でＥＧＦＲ遺伝子位置をＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔシーケンシング方法を利用して検出した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９および２１に対する特異的プライマーを利用して増幅した。ＰＣＲ産物をＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキットを利用してシーケンシングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ ＤＮＡ分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して分析した。
［実施例１：ナノワイヤー構造体を利用してｃｆＤＮＡの付着／分離能力の評価］
電気刺激を用いた効果的なポリピロールの表面改質性質を利用してＤＮＡラダーを血漿にスパイクして、ｃｆＤＮＡの濃縮および分離を試みた。また、扁平な表面よりナノワイヤー構造体に顕著に多くのｃｆＤＮＡが付着／分離し得ることを確認した。
具体的に、ＤＮＡの濃縮および分離のために３段階の過程が必要である。第一に、ポリピロールナノワイヤー構造体に高い電圧を加えて過酸化させて正電荷を表面に誘導した。その後、１．０ＶでＤＮＡ捕獲を試みた後、３回の洗浄過程後に、１．３Ｖを加えて濃縮されたＤＮＡをナノワイヤー構造体の表面から分離して取得した。その結果、過酸化電圧が高くなるほど、ＤＮＡ捕獲効率が増加することを確認し（図４ａ参照）、１．８Ｖを２分間加えたとき、最も高いＤＮＡ捕獲効率を確認した（図４ｂ参照）。また、効率的なＤＮＡ捕獲のための電圧および時間は、１．０Ｖと３０秒が最も適合していることが確認され（図４ｃおよび図４ｄ参照）、捕獲されたＤＮＡをナノワイヤー構造体の表面から分離するための最も効率的な電圧および時間は、１．３Ｖと５分であると評価された（図４ｅおよび図４ｆ参照）。
これに加えて、本発明者らは、多様なサイズのＤＮＡラダーを血漿にスパイクした後、ウェスタンブロッティングおよびＰＩＣＯ ｇｒｅｅｎを使用して付着および分離能力を確認した結果を図５ａ〜図５ｄに示した。また、多様な分子量および多様な濃度のＤＮＡを使用してｃｆＤＮＡ付着／分離能力を測定した。
その結果、分子量や濃度に大きな影響を受けることなく、ＤＮＡ付着および分離能力があることが確認された。すなわち、低分子量、中間分子量、および高分子量のＤＮＡがすべて付着および分離に優れており、一定量以上の濃度のＤＮＡを使用する場合、ＤＮＡ付着および分離能力にも大きな差が示されないことが分かった。
［実施例２：乳癌および肺癌患者の血液内に存在するｃｆＤＮＡの評価］
乳癌患者の血液を利用して導電性ナノ構造体の表面に付着したｃｆＤＮＡを蛍光染料であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＰＩＣＯ Ｇｒｅｅｎを用いて共焦点顕微鏡で観察した。
図７に示されるように、 長さ１．０μｍのナノワイヤーを使用した場合、ワイヤーの表面にｃｆＤＮＡが確実に付着した様子を確認することができ、電気刺激後には、付着したｃｆＤＮＡが分離して蛍光が示されないことを確認した。
また、本発明者らは、乳癌患者および肺癌患者の血液を利用してＱｉａｇｅｎ ｋｉｔおよび導電性ナノ構造体を利用して分離したｃｆＤＮＡの濃度を比較した。
その結果、図６ａおよび図６ｂに示されるように、正常ヒトの血液から検出されたｃｆＤＮＡの量と比較して、癌患者の血液で最高１０倍以上のｃｆＤＮＡが検出された。また、本発明のナノ構造体の場合が商用のＱｉａｇｅｎ ｋｉｔより顕著に多くの量のｃｆＤＮＡの分離に成功した。このことから、本発明の導電性ナノワイヤーが小さいフラグメントＤＮＡを検出するのに効果的な技術であることが分かった。
また、乳癌患者の血液でＱｉａｇｅｎ ｋｉｔまたはナノ構造体Ｐｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを使用してｃｆＤＮＡを検出した後、ＰＣＲ増幅方法を使用して患者サンプルからＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ突然変異を確認し、図８に示した。すなわち、ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ突然変異分析が可能であることを確認することができた。
また、肺癌患者の血液でＱｉａｇｅｎ ｋｉｔまたはＰｐｙ／Ａｕ ＮＷｓを使用してｃｆＤＮＡを検出した後、デジタルＰＣＲを行って、患者サンプルからＥＧＦＲ突然変異の検出頻度を比較して、下記表２に示した。
その結果、現在商業的に使用されているＱｉａｇｅｎ ｋｉｔより顕著に向上したＤＮＡ分離結果を示したのであり、これから、本発明の導電性ナノワイヤーが従来Ｑｉａｇｅｎ ｋｉｔと比較してｃｔＤＮＡを検出するのに顕著に効果的であることが分かった。
特に、既存の商業製品であるＱｉａｇｅｎ ｋｉｔを使用するときに検出されなかった小さいフラグメントＤＮＡ（ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ）が、本発明のポリピロールナノワイヤー構造体では検出されたということは、癌診断用ｋｉｔとしての使用可能性を示唆する。
［実施例３：ポリピロール平面構造体を利用したｃｆＤＮＡの付着／分離能力の評価］
ポリピロールナノワイヤー構造体だけでなく、本発明者らは、追加に、ポリピロール平面構造体の表面においても血液内の循環ｃｆＤＮＡの分離が可能であることを確認した。
これと関連して、図９に示されるように、電圧が高くなるほど、血液内に存在するｃｆＤＮＡの検出量が増加し、特に１．５Ｖのポリピロール表面の酸化過程を経ると、ＤＮＡ検出効率が９４％と増加した。これから、ポリピロール平面構造体に加えられた電圧が高くなるほど、ｃｆＤＮＡの分離効率が増加することを確認した。
これに加えて、平面Ｐｐｙフィルムを０．６〜０．８ Ｖの電圧で製作する場合、表面が非常に滑らかであるので、ＤＮＡ捕獲および放出にあまり役立たないが、電気重合過程を通じて平面Ｐｐｙフィルムを製作するとき、１．５Ｖの高い電圧を適用すると、平面Ｐｐｙ表面の粗度が大きく上昇し、ＤＮＡの回収に役立つことを確認した。前記から、ナノ構造体の表面粗度は、ＤＮＡとの相互作用を増進させると共に、表面対体積領域も向上させて、多量のＤＮＡを付着させることができる場所を提供することが分かった。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は、単に好ましい実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されるわけではない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
本発明によるセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などを含むセルフリーＤＮＡの付着および分離が容易であり、検出効率が顕著に向上するので、循環腫瘍ＤＮＡを電気的信号により効果的に検出および分離することによって、究極的に、癌発病の診断および予後予測に非常に有用なものと期待される。

Claims (14)

  1. 正電荷を帯びるように表面改質した導電性高分子を含む、セルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡの検出および分離用構造体であって、前記導電性高分子はポリピロールであり、前記構造体はナノワイヤーである、セルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体。
  2. 前記セルフリーＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載のセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体。
  3. 請求項１又は２に記載のセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体を含む、セルフリーＤＮＡ検出および分離用キット。
  4. （ｉ）ナノワイヤーを形成するポリピロールの表面を正電荷に改質する段階と；
    （ｉｉ）生物学的試料を処理して前記ポリピロールにｃｆＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）を付着させる段階と；
    （ｉｉｉ）電気的信号を加えて前記ポリピロールからｃｆＤＮＡを検出または分離させる段階と；
    を含むセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  5. 前記生物学的試料は、血液、骨髄、胸水、腹膜液、脊髄液、尿、および唾液よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  6. 前記生物学的試料は、血液であることを特徴とする、請求項５に記載のセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  7. （ｉｉ）段階で、前記ｃｆＤＮＡを付着させる段階は、０．８〜１．２Ｖで２０〜４０秒間電気を加えて行われることを特徴とする、請求項４に記載のセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  8. （ｉｉｉ）段階で、前記ｃｆＤＮＡを検出または分離させる段階は、−１．３〜−１．０Ｖで４〜６分間電気的信号を加えて行われることを特徴とする、請求項４に記載のセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  9. 前記セルフリーＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載のセルフリーＤＮＡを検出または分離する方法。
  10. 請求項１又は２に記載のセルフリーＤＮＡの検出および分離用構造体を利用してサンプルから循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出または分離して分析することを含む、対象者の癌の発病および予後を診断するための情報を提供する方法。
  11. 前記癌は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）、芽細胞腫（ｂｌａｓｔｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、神経内分泌腫瘍（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、悪性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、扁平細胞癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ）、腹膜癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌種（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃腸管癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜または子宮癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｏｒ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、外陰癌（ｖｕｌｖａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌腫（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌腫（ａｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、陰茎癌（ｐｅｎｉｌｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胆道癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒａｃｔ）および頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記癌は、乳癌、肺癌、胃癌、肝癌または膵臓癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記分析は、サンプルからｃｔＤＮＡの量（濃度）、コピー数または塩基配列を分析することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  14. ｃｔＤＮＡの量（濃度）またはコピー数が増加する場合、癌が発生または進行するという情報を提供することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
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