JP2018535651A - 診断方法および装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための方法であって、i)標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子と、上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子とを含む複数の検出ナノ粒子を提供する工程と、ii)標的アナライトへの特異的プローブの結合に好適な条件下で上記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程とを含み、標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集が、シグナルリザーバからの検出可能なシグナル手段の放出を可能にする、方法を提供する。また、本発明の方法を実施するための関連装置およびシステムもまた提供される。【選択図】図16
Description
発明の技術分野
本発明は、例えば疾患バイオマーカーのようなバイオアナライトの検出のためのナノ粒子技術に基づくシグナル増幅工程を用いる方法および装置に関する。
本発明は、例えば疾患バイオマーカーのようなバイオアナライトの検出のためのナノ粒子技術に基づくシグナル増幅工程を用いる方法および装置に関する。
発明の背景
本発明は、例えば遺伝子変異または非宿主遺伝物質のような、疾患バイオマーカーなどのバイオアナライトの検出のための方法および関連製品およびキットを対象とする。
本発明は、例えば遺伝子変異または非宿主遺伝物質のような、疾患バイオマーカーなどのバイオアナライトの検出のための方法および関連製品およびキットを対象とする。
がんは、2012年だけで約175万人の死者を出したEUで2番目に多い死亡原因であり、同年に345万人のEU市民が、この症状を抱えていると診断されたと推定されている。がん診断のゴールドスタンダードは組織の組織学的検査である。しかしながら、そのような処置は高価であり、患者にとって危険を伴わないものではなく、専門の病理学者による一貫した評価が必要である。その結果、がんの診断および管理のための非侵襲性バイオマーカーを検出する技術の開発に大きな関心が寄せられている。この点に関して特に興味深いのは、変異DNA配列が診断有用性を有しかつ標的療法に対する予後および応答性を予測できるため、それらを検出する技術である。このタイプのバイオマーカーは、概して医療の実施において重要な科学的および臨床的価値があり、疾患および障害の全スペクトルの診断、予後、スクリーニング、およびリスク評価に有用である。このような方法でのバイオマーカーの適用は、「パーソナル化(オーダーメード医療)」に対するますます重要な動きの中で、治療と疾患予防のパーソナル化を達成するために、すでに多くの医療システムに統合されている。
それにもかかわらず、そのようなバイオマーカーの検出を可能にする現在利用可能な技術は、高価な装置を必要とし、労働集約的であり、長い所要時間を有するために限られている。さらに、商業的に利用可能な技術の多くは、限定された量であり得る生試料中の検出には不十分な感度であるため、標的DNAの事前の操作および増幅に依存する。結果として、一般にそれらの使用は特殊な実験室に限定されている。
貴金属ナノ粒子は、いくつかの独自の物理化学的特性を有しており、新しいバイオセンシングプラットフォームの開発におけるそれらの使用についての研究を促してきた。より特異的でかつ高感度の生体分子診断ツールを追求において貴金属ナノ粒子の独特な特性を利用する方法および装置の多くの先行技術の例があるが(Doriaら、Sensors、2012年、Vol.12、pp1657〜1687)、それらの多くは、検出の前に標的DNAの試料操作および増幅を依然として必要とする。
WO2005/118870は、固定されたプローブのオリゴヌクレオチドのマイクロ電極アレイおよび標的DNAの第2の領域に対するプローブで機能化された複数のナノ粒子を使用して目的の標的DNA配列を検出する方法を記載している。試験試料中の標的DNAは、固定されたプローブによって電極に結合し、これが今度は捕捉されたDNAを介してナノ粒子の凝集を生じる。この凝集は、電極部位での電気化学インピーダンスの変化として検出できる。
WO2007/044025は、標的DNAの2つの異なる領域に対する特異的なプローブで機能化されたナノ粒子を用いて目的の標的DNA配列を検出する方法を記載している。試験試料中の標的DNAは、試料の光散乱特性の変化を測定することによって検出できる金ナノ粒子の複合体の形成をもたらす。
Sanroman−Iglesiasら、ACS Appl.Mater.Interfaces、2015年、Vol.7、pp.15692〜15695は、金ナノ粒子の光制御放出のための分子ゲートとしての共役ポリマーを記載している。薄いポリマーの光分解によるナノ粒子の水溶液中への遠隔放出は、裸眼で検出される粒子放出を可能にする。
Sanroman−Iglesiasら、ACS Sens.、2016年、Vol.1、pp.1110〜1116は、ナノ粒子の選択的凝集による一塩基多型(SNP)の検出を記載している。SNPの識別におけるナノ粒子バイオセンサの感度限界に対するナノ粒子サイズの影響が調べられた。一定の金濃度での粒子サイズの5倍の増加は、3桁の検出限界の改善をもたらす。
Zhouら、J Am Chem Soc、2010年、Vol.26、pp.6932〜6934は、バイオミネラリゼーション増幅プロセスを組み込んだ目的の標的DNA配列の検出方法を記載している。この方法において、固定化されたプローブのオリゴヌクレオチドのアレイが、標的DNAの第2の領域に対するプローブとバイオミネラリゼーション可能なシリカテインの両方で機能化された複数のナノ粒子と共に提供される。試験試料中の標的DNAは固定されたプローブに結合し、これが今度は捕捉されたDNAを介してナノ粒子の凝集をもたらす。次いで、ナノ粒子に結合したシリカテインは、第2の金ナノ粒子種を閉じ込めて試料の光散乱特性の検出可能な変化を生じさせることができる、シリカの合成を触媒する。さらなる銀染色工程を用いて、50aMという低濃度で目的の配列の検出を可能にすることもできる。
低コストで迅速かつ高感度に疾患バイオマーカー(遺伝子変異など)を検出するための方法およびキットが依然として必要とされている。携帯性と使いやすさもまた望まれる。特に、検出の前に標的DNAの試料操作および増幅の必要性を回避する方法が望まれる。さらに、便利なオンデバイス読み出しを提供しつつ、疾患バイオマーカーの検出を可能にする方法およびキットが必要とされている。本発明は、様々な標的バイオアナライトの検出に、および様々な生物学的または環境的試験試料中で、迅速かつ容易に適合させることができるシステムにおいて、これらおよび他の必要性を解決する。
本発明は、試験試料中の標的アナライトを検出するための方法および装置を提供する。概して、本発明は、容易に検出可能なシグナルの放出が標的アナライトに誘発されるナノ粒子の凝集に条件付けされている、シグナル増幅法を利用する。
したがって、第1の態様において、本発明は、試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための方法であって、
標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を提供する工程と、
標的アナライトへの特異的なプローブの結合に好適な条件下で、上記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、標的アナライトに誘発される前記検出ナノ粒子の凝集がシグナルリザーバからの検出可能なシグナル手段の放出を可能にする工程と、
を含む方法を提供する。
標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を提供する工程と、
標的アナライトへの特異的なプローブの結合に好適な条件下で、上記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、標的アナライトに誘発される前記検出ナノ粒子の凝集がシグナルリザーバからの検出可能なシグナル手段の放出を可能にする工程と、
を含む方法を提供する。
このようにして、高感度で適応性のある検出事象がシグナル事象に条件付けされ、このシグナル事象は検出事象よりも容易に識別可能であり、したがって事前の試料操作または増幅の必要なしに目的のアナライトの検出を可能にする。検出事象をこのようにしてシグナル事象に結びつけることはまた、単に検出ナノ粒子のプローブを変更することにより、様々なアナライトの検出に容易に適応できる方法を可能にする。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合において、標的アナライトは、核酸、タンパク質または他の生体分子であってよい。第1および第2のプローブは、標的アナライトに特異的である(すなわち選択的結合を示す)ように選択される。標的アナライトが核酸を含む場合、第1および/または第2のプローブは、標的アナライトの配列(のそれぞれの部分)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであってよい。標的アナライトがタンパク質(グリコシル化されたまたは他のもの)を含む場合、第1および第2のプローブは、例えば、それぞれが、タンパク質上に存在するそれぞれのエピトープに選択的に結合する抗体分子(例えば、モノクローナル抗体、FAb、scFV)の形態であってよい。同様の様式で、第1および第2のプローブは、標的アナライトに選択的に結合するアプタマーの形態であってよい。標的アナライト上の異なる領域(例えば、異なるエピトープ)に結合する第1および第2のプローブによって、サンドイッチまたは架橋結合配置がもたらされ、アナライトが媒介する検出ナノ粒子の凝集がもたらされる。
ある場合には、検出可能なシグナル手段の放出は、シグナルリザーバを封じる障壁の破壊を介する。いくつかの好ましい場合において、この障壁は、検出ナノ粒子の凝集体によって導かれる熱伝達によって分解され得る熱応答性ポリマー層である。例えば、シグナルリザーバは、検出可能なシグナル手段を含むコアを包み込む熱応答性ポリマーから形成されるシェルのようなシェルを含む、1つまたは複数のマイクロスフェアを含んでよい。このようにして、マイクロスフェアのシェルが障壁を提供する。いくつかの場合において、この熱伝達は、凝集した検出ナノ粒子を電磁放射源で照射することによって引き起こされる。好ましくは、電磁放射源は、凝集した検出ナノ粒子の共鳴波長でまたはその近傍でエネルギーを提供するように構成される。このようにして、検出可能なシグナル手段の放出は、標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集とそれに続く電磁放射線によるこれらの凝集体の照射の両方に続いて起こり得る。
ある場合には、電磁放射源は赤色レーザーダイオードを含む。赤色レーザーダイオードは、凝集した検出ナノ粒子の共鳴波長で、例えば600〜650nmの範囲において、例えば633nmで光を送達できる。ある場合には、共鳴波長は、血液中に存在するHbおよびHbO2の吸収極大(それぞれ434nmおよび414nm)から離れていてよく、および/または装置の構成要素の吸収波長から離れていてよく、および/または血漿の吸収極大波長からから離れていてよい。ある場合には、電磁放射源は発光ダイオード(LED)である。特定の場合には、このLEDは、415〜425nmの波長でエネルギーを提供するように構成されてよい。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合において、熱応答性ポリマーは、ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリ(アリルアミン)(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含む。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合において、熱応答性ポリマーは、ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)およびポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)またはPSSおよびポリ(アリルアミン)(PAH)の交互層を含む。これにより、単に層の数を変えることにより、ポリマーの厚さを容易に制御できる。
ある場合には、熱応答性ポリマーはポリ(アリルアミン)(PAH)を含む。ある場合には、熱応答性ポリマーはポリ(アルファ)メチルスチレンを含む。
ある場合には、熱応答性ポリマーは60〜100nmの厚さである。本発明者らは、ポリマー隔壁に十分な剛性を与え、かつ照射前のシグナル手段の放出を防止するために、この範囲のポリマー厚さが好ましいことを見出した。
いくつかの特に好ましい場合において、熱応答性ポリマーは、奇数の層を含む。 奇数の層は、補償されない電荷を生じる層間の反発のために、60℃を超える温度において熱応答性ポリマーを膨潤させ破壊させることが知られている。したがって、いくつかの好ましい場合において、凝集した検出ナノ粒子の照射は、少なくとも20℃、40℃、または60℃の局所的な温度上昇を生じる。
ある場合では、熱応答性ポリマーは、ポリ(アリルアミン)(PAH)の表面層を含む。
いくつかの好ましい場合では、検出ナノ粒子凝集体は、凝集後に障壁へ局在する。いくつかの場合、これは特異的な結合対、好ましくは標的アナライトと検出ナノ粒子の第1および/または第2のプローブとを介する。したがって、ある場合には、熱応答性ポリマー(例えば、PAH層)の表面層は、検出ナノ粒子の第1および/または第2のプローブで機能化される。このようにして、凝集した検出ナノ粒子は、検出ナノ粒子の凝集の根底にある同じ結合ストラテジーを使用して、障壁に局在化される。熱応答性ポリマーは、例えば熱応答性ポリマーの表面層に結合または組み込まれる、その中に結合するかまたは組み込まれるプローブ配列(例えば、目的の変異配列に特異的にハイブリダイズする)を有していてもよい。この配置は、凝集したナノ粒子を熱応答性層に近接させるのを助け、これにより照射されたナノ粒子から熱応答性ポリマーへのエネルギーの伝達を増加させる(例えば、溶液中に散逸するエネルギーではなく)。しかしながら、いくつかの場合には熱応答性ポリマーの中または上に結合プローブが存在しなくてもよいことが、本明細書において具体的に企図される。本発明者らは、特定の条件下で、例えばナノ粒子凝集体の沈降速度に依存して、ポリマー内部または表面上にプローブを必要とせずに、凝集したナノ粒子が熱応答性ポリマーに近接することを見出した。
いくつかの場合において、第1および第2の検出ナノ粒子はそれぞれ、上記第1および第2のプローブの両方を含む。特に好ましい場合には、第1および第2の検出ナノ粒子は同一である。
ある場合には、検出ナノ粒子は、金属原子、好ましくは貴金属のコアを含む。特に、金属は銀であってよい。
ある場合には、検出器ナノ粒子のコアの直径は、10〜100nmの範囲、例えば40〜70nmの範囲である。
ある場合には、シグナル手段は、ストレプトアビジン、抗体、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ)、フルオロフォア、色素、1つまたは複数の量子ドット、および1つまたは複数のラテックスビーズからなる群から選択される。
ある場合には、シグナル手段は、複数のシグナルナノ粒子である。本発明者らは、ナノ粒子が、シグナルリザーバを封じる透過性または半透過性の障壁の使用を可能にする、シグナル手段として有用な利点を提供することを見出した。例えば液体染料の漏出を防止するために必要とされるような気密シールは、圧力の差に感受性であり、圧力に誘発される障壁材料の破壊または弱化はしたがって、シグナル手段の望ましくない放出、および偽陽性結果の増加した発生率をもたらし得る。有利なことに、ナノ粒子は、好適なシグナルリザーバに収容されるのに十分に小さいが、リザーバを封じる隔壁が空気圧の均等化を可能にするように透過性にされ得るほど十分に大きい。ある場合には、システムは流れを容易にするために装置内に負圧を提供し得る。したがって、本明細書では、リザーバを封じる障壁が空気に対して透過性でなくてもよいことが具体的に企図される。好ましくは、シグナルリザーバから放出されるシグナルナノ粒子の数は、上記放出を達成するために必要とされる検出ナノ粒子の数を超える(好ましくは、大きく超える)。ある場合には、放出されるシグナル手段(例えば、シグナルナノ粒子)対検出ナノ粒子の比は1000:1または1000:1よりも大きく、例えば10^6:1(すなわち、検出ナノ粒子より1000000倍多いまたはさらに多いシグナル手段(例えばシグナルナノ粒子)である。検出ナノ粒子の数に対する多数のシグナル手段(例えば、シグナルナノ粒子)はシグナル増幅の提供を助け、これが今度はより簡便な検出、例えば高感度の画像化装置を必要としない可視検出を可能にする。
ある場合には、シグナル粒子は、好ましくは貴金属である、金属原子のコアを含む。特に、金属は金であってよい。いくつかの特に好ましい場合において、シグナルナノ粒子の金属コアおよび検出ナノ粒子の金属コアは、異なる金属である。これは、検出ナノ粒子を使用して、シグナルナノ粒子により吸収されない波長での照射によって、熱応答性ポリマーへの熱伝達を導くことを可能にする。
ある場合には、シグナルナノ粒子のコアの直径は、10〜20nmの範囲である。ある場合には、シグナルナノ粒子は球状形態を有する。他の場合には、シグナルナノ粒子は棒状の形態を有する。例えば、ナノチューブ、ナノボックス、およびナノクラスターのような、他のシグナルナノ粒子形態も考えられ、本発明に容易に適用できる。複数の異なるシグナルナノ粒子形態の使用は、シグナルナノ粒子放出後に異なる色シグナルを観察することを可能にする。これは、例えば、この方法から容易に観察可能な色分けされた出力を提供する際に有利であり得る。
ある場合には、シグナルナノ粒子は、チオール末端ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(IgeSH)で機能化される。IgeSHによる機能化は、乾燥および再溶解後でさえ、凝集に対してナノ粒子を安定化させることが見出されている。
ある場合には、シグナルリザーバは、1つまたは複数の上記マイクロスフェア、例えば熱応答性マイクロスフェアを含む。マイクロスフェアの平均直径は、1〜20μmの範囲、例えば5〜10μmの範囲であってよい。
ある場合には、シグナルリザーバは複数の上記マイクロスフェアを含み、上記シェルの表面層は負に帯電しているか、または正に帯電している。
ある場合には、シグナルリザーバは複数の上記マイクロスフェアを含み、マイクロスフェアは、マイクロスフェアよりも大きな直径を有する複数のパッキング(packing)粒子に隣接して、かつ/または接触して、マイクロチャネル内に提供される。特に、パッキング粒子は、ガラス、シリカまたはアガロースビーズを含んでよい。パッキング粒子は、20〜200μmの範囲、任意選択で50〜150μmの範囲の平均直径を有してよい。
ある場合には、シグナルリザーバは、支持材料、好ましくはマクロポーラスシリコン基板中に1つ以上の空洞を含む。ある場合には、空洞はマイクロキャビティ、マイクロウェル、またはマイクロポアである。いくつかの好ましい場合では、例えばナノ粒子が7.5nmの半径を有する球形であり、空洞が半径0.5μmおよび深さ10μmのチューブの形態をとり球形のナノ粒子の比較的密な充填を仮定する場合に、それぞれの空洞は、少なくとも4×105ナノ粒子/μm3の濃度で検出可能なシグナル手段を含み得る。このようにして、潜在的に少数の凝集した検出ナノ粒子によるシグナルリザーバを封じる隔壁の破壊は、比較的大きな容量のシグナル手段の放出をもたらし、それによってシグナルの増幅を生じる。
ある場合には、シグナルリザーバからの検出可能なシグナル手段の放出は、色シグナルとして観察される。いくつかの好ましい場合において、検出可能なシグナル手段の放出は裸眼で観察可能である。さらに好ましいいくつかの場合において、検出可能なシグナル手段は、シグナルリザーバからの放出後に保持ストリップ上に検出のために捕捉される。このようにして、シグナルリザーバからのシグナル手段の解放の視覚化が非常に容易になる。シグナル手段が複数のシグナルナノ粒子である場合、保持ストリップ上でのこれらの捕捉は、ナノ粒子の距離依存光学特性に起因する色の変化として、それらの放出を容易に観察することを可能にする。
本発明のこの態様に従うある場合には、検出ナノ粒子のプローブは、標的核酸の第1および第2の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。ある場合には、オリゴヌクレオチドのプローブの一方または両方が、リンカー基を介して検出ナノ粒子のコアに共有結合される。ある場合には、プローブは修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含む。特に、天然のDNAの可撓性を低下させる、オリゴヌクレオチド骨格に剛性を付加するヌクレオチドの使用が、本明細書において企図される。より剛性のオリゴヌクレオチドはプローブ−標的特異性を増強し、これは特に野生型DNAのバックグラウンドに対する一塩基変異を検出する場合に望ましい。ある場合には、オリゴヌクレオチドは2’−o−メチルヌクレオチドを含み得る。ある場合には、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸(locked nucleic acid:LNA)を含み得る。
いくつかの特定の場合において、リンカー基はチオール基を含み得る。いくつかのさらなる場合において、リンカー基は、C10−C20アルキルおよび/またはグリコールスペーサーを含み得る。スペーサー分子の組み込みは、検出ナノ粒子のコアに結合される場合プローブの標的核酸への結合を容易にする。ある場合には、プローブは、PEGスペーサーに連結されるナノ粒子のコアへのチオール結合を含むか、またはそれからなり、次にC18スペーサーに連結され、次にプローブ配列自体に連結される。スペーサーは、負に荷電したプローブがナノ粒子表面に直接結合するのを制限または防止し得る。
本発明のこの態様に従うある場合には、第1および第2のプローブのオリゴヌクレオチドは、15〜50塩基対離れた標的核酸の領域を結合する。このことは、短い配列の相違が同じナノ粒子上の第1および第2のプローブへの結合を構造的に妨げるので、別個の検出ナノ粒子への標的核酸の優先的な結合に役立つ。いくつかの特に好ましい場合において、プローブのオリゴヌクレオチドは、実施例1、5、9または10に記載される通りである。
ある場合には、各検出ナノ粒子は200〜300個のプローブ分子を有する。
ある場合には、検出可能なシグナル手段は、特異的結合対の第1の構成要素を含む。ある場合には、上記第1の構成要素は、ビオチンまたはストレプトアビジンである。したがって、本発明のこの態様に従うある場合には、シグナルナノ粒子は特異的結合対の第1の構成要素を含み、保持ストリップは対応する特異的結合対の第2の構成要素を含む。いくつかの好ましい場合において、上記第1の構成要素および第2の構成要素は、ビオチンおよびストレプトアビジンから選択される。ある場合には、特異的結合対の第1の構成要素は、リンカー基を介してシグナルナノ粒子のコアに共有結合される。さらなるいくつかの場合では、このリンカー基はチオール基を含み、任意選択でC10−C20アルキルおよび/またはグリコールスペーサーをさらに含む。
ある場合には、それぞれの検出ナノ粒子は、200〜300個の結合要素を有する。
本発明のこの態様に従うある場合には、標的核酸は野生型配列の変異体である配列を有し、第1または第2の検出ナノ粒子のプローブは野生型配列に優先して変異体配列に結合する。いくつかの好ましい場合において、変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み、第一または第二の検出ナノ粒子のプローブはSNP位置を含む標的核酸の一部にハイブリダイズする。第1および第2のオリゴヌクレオチドのプローブで機能化された検出ナノ粒子は、標的核酸における単一塩基の差異を識別するように、特異的に凝集できることが実証された。
本発明のこの態様に従うある場合には、核酸はDNAである。したがって、ある場合には、核酸は疾患に関連すると疑われる遺伝子またはその断片であり、他のいくつかの場合には、核酸は疾患と関連することが知られている遺伝子またはその断片である。いくつかの特に好ましい場合において、核酸は、がんに関連する遺伝子またはその断片である。いくつかの他の場合において、核酸はRNAである。
ある場合には、標的核酸は、遺伝要素を有するがんまたは他の疾患に関連する変異を含む。遺伝要素を有し、本発明による変異の検出が使用できる障害の例は、嚢胞性線維症、血色素症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、クローン病、およびハンチントン病を含む。変異は、一塩基変異、欠失、挿入(トリヌクレオチドリピートを含む)または配列転座からなる群から選択され得る。
特に、変異は、NCBI Gene ID:1956のヒト上皮増殖因子受容体(EGFR);NCBI Gene ID:672のヒト早発型乳がん1(BRCA1);NCBI Gene ID:673のヒトBRAF遺伝子;およびNCBI Gene ID:3845のヒトKRASプロトオンコジーンからなる群より選択される遺伝子中にあってよい。
ある場合には、変異は:
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択されてよい。
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択されてよい。
ある場合には、試験試料は標的アナライトを含む疑いがあり、他の場合には、試験試料は標的アナライトを含むことが知られている。ある場合には、試験試料は環境的試料、特に食品または水の試料であってよい。いくつかの他の場合において、試験試料は生物学的試料であってよい。いくつかの特定の場合において、試験試料は、血液、血漿、尿、または他の生物液およびそれらの誘導体であり得る。
本発明のこの態様に従うある場合には、方法は、試験試料を検出ナノ粒子と接触させる前に、試験試料の熱変性の工程をさらに含む。さらなるいくつかの場合において、方法は、試験試料の熱変性の前に熱安定化剤を提供する工程をさらに含み得る。ある場合には、熱安定剤はグルコースである。熱安定化剤の提供は、そうでなければ試料粘度の望ましくない上昇を引き起こすかもしれない試験試料中のタンパク質変性を制限するのに有用であり得る。代替的または追加的に、方法は、アルブミンを除去する薬剤、例えばシバクロンブルー(Cibacron blue) dye sepharose(例えば、GE Healthcare Life SciencesからのBlue Sepharose 6 Fast Flow)で試料を希釈しおよび/または処理する工程を含んでよい。
本発明のこの態様に従うある場合には、方法は複数のブロッキングプローブを提供する工程をさらに含み、これらのブロッキングプローブは標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる。ある場合には、方法は、上記ブロッキングプローブの過剰量(例えば、検出ナノ粒子のプローブの数と比べて2〜10倍過剰、例えば、5〜7倍過剰またはさらには6倍過剰のブロッキングプローブ)を、標的核酸のアンチセンス鎖へのブロッキングプローブの結合に好適な条件下で試験試料と接触させ、それにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程をさらに含む。このようにして、標的核酸のアンチセンス鎖が系から除去され、検出ナノ粒子と接触する前に、標的核酸のセンス鎖に関して試験試料を高度かつ特異的に濃縮することを可能にする。
ある場合には、ブロッキングプローブは、2’−O−メチルヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出するための方法であって、
試験試料の熱変性の工程と;
標的核酸のアンチセンス鎖へ特異的に結合できる過剰のオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを提供し、標的核酸のアンチセンス鎖への上記ブロッキングプローブの結合に適した条件下で、試験試料とこのブロッキングプローブを接触させ、それにより上記標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程と;
標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび標的核酸のセンス鎖の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
標的核酸への特異的プローブの結合に好適な条件下で上記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、試験試料中の標的核酸の存在が検出ナノ粒子の凝集を生じる工程と;
凝集状態にあるときに検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成される電磁放射源で検出ナノ粒子を照射し、それによってシグナルリザーバを封じる熱応答性ポリマー層の少なくとも部分的な熱分解を生じるのに十分な熱伝達を導く工程と;
シグナルリザーバからの複数のシグナルナノ粒子の放出またはその欠如を観察する工程であって、放出されるシグナルナノ粒子が裸眼で観察可能な保持ストリップ上の検出のために捕捉される工程と、
を含む方法を提供する。
試験試料の熱変性の工程と;
標的核酸のアンチセンス鎖へ特異的に結合できる過剰のオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを提供し、標的核酸のアンチセンス鎖への上記ブロッキングプローブの結合に適した条件下で、試験試料とこのブロッキングプローブを接触させ、それにより上記標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程と;
標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび標的核酸のセンス鎖の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
標的核酸への特異的プローブの結合に好適な条件下で上記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、試験試料中の標的核酸の存在が検出ナノ粒子の凝集を生じる工程と;
凝集状態にあるときに検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成される電磁放射源で検出ナノ粒子を照射し、それによってシグナルリザーバを封じる熱応答性ポリマー層の少なくとも部分的な熱分解を生じるのに十分な熱伝達を導く工程と;
シグナルリザーバからの複数のシグナルナノ粒子の放出またはその欠如を観察する工程であって、放出されるシグナルナノ粒子が裸眼で観察可能な保持ストリップ上の検出のために捕捉される工程と、
を含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出するための方法であって、
i)試験試料の熱変性の工程と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖へ特異的に結合できる過剰のオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを提供し、標的核酸のアンチセンス鎖へのこのブロッキングプローブの結合に好適な条件下で試験試料とブロッキングプローブを接触させ、それにより標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび標的核酸のセンス鎖の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
iv)標的核酸への特異的プローブの結合に好適な条件下で検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、試験試料中の標的核酸の存在が検出ナノ粒子の凝集をもたらす工程と;
v)凝集状態にあるときに検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成される電磁放射源で検出ナノ粒子を照射し、それによってシグナル手段を含む複数のマイクロスフェアの少なくとも部分的な熱破壊(例えば温度誘発の溶解)をもたらすのに十分な熱伝達を導く工程と;
vi)マイクロスフェアからのシグナル手段の放出またはその欠如を観察する工程であって、放出されるシグナルナノ粒子が、裸眼で観察可能な保持ストリップ上の検出のために捕捉される工程と、
を含む方法を提供する。
i)試験試料の熱変性の工程と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖へ特異的に結合できる過剰のオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを提供し、標的核酸のアンチセンス鎖へのこのブロッキングプローブの結合に好適な条件下で試験試料とブロッキングプローブを接触させ、それにより標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび標的核酸のセンス鎖の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
iv)標的核酸への特異的プローブの結合に好適な条件下で検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、試験試料中の標的核酸の存在が検出ナノ粒子の凝集をもたらす工程と;
v)凝集状態にあるときに検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成される電磁放射源で検出ナノ粒子を照射し、それによってシグナル手段を含む複数のマイクロスフェアの少なくとも部分的な熱破壊(例えば温度誘発の溶解)をもたらすのに十分な熱伝達を導く工程と;
vi)マイクロスフェアからのシグナル手段の放出またはその欠如を観察する工程であって、放出されるシグナルナノ粒子が、裸眼で観察可能な保持ストリップ上の検出のために捕捉される工程と、
を含む方法を提供する。
本発明のこの態様に従うある場合には、方法は、試験試料の熱変性の前に熱安定化剤を提供する工程をさらに含む。
本発明のこの態様に従うある場合には、電磁放射源はレーザーダイオードまたは発光ダイオードであり、凝集した検出ナノ粒子の照射は、少なくとも20℃、40℃、または60℃の局所的な温度上昇を生じる。好ましくは、局所的な温度上昇は少なくとも40℃である。
ある場合には、熱応答性ポリマー層の表面は検出ナノ粒子の第1および/または第2プローブで機能化され、それによって検出ナノ粒子の凝集体を熱応答性ポリマー層に局在化させる。
ある場合には、検出ナノ粒子は銀原子のコアを含み、シグナルナノ粒子は金原子のコアを含む。
ある場合には、シグナルナノ粒子はビオチン−ストレプトアビジン結合対の第1の構成要素を含み、保持ストリップは上記ビオチン−ストレプトアビジン結合対の対応する第2の構成要素を含む。
本発明の第2の態様に従うある場合には、ブロッキングプローブおよび検出ナノ粒子プローブは2’−O−メチルオリゴヌクレオチドである。
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の方法において使用するための装置を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のこの態様の装置は、試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するためであって、
標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を含む検出区画と、
障壁によって検出区画から分離され検出可能なシグナル手段を含む、シグナルリザーバであって、上記障壁が標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集後に選択的に破壊可能であるシグナルリザーバと、
を含む。検出事象をより容易に識別可能なシグナル事象に結びつける装置を提供することによって、本発明は、アトモーラー範囲の潜在的感度を有するオンデバイスシグナル増幅および読み出しを可能にする。この装置はしたがって、同一装置上での試料調製から分析読取りまでのすべての要素を有し、かつ事前の試料の操作または高価な検出装置の使用を必要とせずに、ポイントオブケア装置として使用するのに適している。このタイプの装置は、単に検出ナノ粒子プローブを変更することによって、様々な標的アナライトの検出に容易に適合させることができる。さらに、この装置は、生物学的および環境的の両方の、様々な試験試料と共に使用するのに適している。
標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を含む検出区画と、
障壁によって検出区画から分離され検出可能なシグナル手段を含む、シグナルリザーバであって、上記障壁が標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集後に選択的に破壊可能であるシグナルリザーバと、
を含む。検出事象をより容易に識別可能なシグナル事象に結びつける装置を提供することによって、本発明は、アトモーラー範囲の潜在的感度を有するオンデバイスシグナル増幅および読み出しを可能にする。この装置はしたがって、同一装置上での試料調製から分析読取りまでのすべての要素を有し、かつ事前の試料の操作または高価な検出装置の使用を必要とせずに、ポイントオブケア装置として使用するのに適している。このタイプの装置は、単に検出ナノ粒子プローブを変更することによって、様々な標的アナライトの検出に容易に適合させることができる。さらに、この装置は、生物学的および環境的の両方の、様々な試験試料と共に使用するのに適している。
いくつかの実施形態では、本発明のこの第2の態様の装置は、試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するためであり、
i)標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を含む検出区画と;
ii)標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集後に選択的に破壊可能な障壁によるシグナルリザーバに含まれる検出可能なシグナル手段を含むシグナル増幅領域と、
を含む。
i)標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および上記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を含む検出区画と;
ii)標的アナライトに誘発される検出ナノ粒子の凝集後に選択的に破壊可能な障壁によるシグナルリザーバに含まれる検出可能なシグナル手段を含むシグナル増幅領域と、
を含む。
ある場合には、検出区画は、検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源をさらに含み、検出区画とシグナルリザーバを隔てる隔壁は熱応答性ポリマー層である。
ある場合には、シグナル増幅ゾーンは、検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源をさらに含み、隔壁は熱応答性ポリマー層を含む。
ある場合には、シグナルリザーバは、上記シグナル手段を含むコアと上記コアを包み込むシェルとを有する1つまたは複数のマイクロスフェアを含み、上記シェルは上記障壁を提供する。
いくつかの好ましい場合において、熱応答性ポリマーは、本発明の第1の態様に関連して上記で定義した通りである。特に、熱応答性ポリマーは、ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリ(アリルアミン)(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含んでよい。
本発明のこの第2の態様によるいくつかの特に好ましい場合には、熱応答性ポリマーは奇数の層を含み、これは奇数の層が、補償されない電荷を生じる層間の反発のために、60℃を超える温度で熱応答性ポリマーを膨張させ破壊すると知られているからである。
本発明のこの第2の態様に従うある場合には、電磁放射源は、レーザーダイオードまたは発光ダイオード(LED)であってよい。電磁放射源は、凝集状態にあるとき、検出ナノ粒子の共鳴周波数に対応する波長の光を生成するように適合されてよい。例えば、電磁放射源は、600〜650nm(例えば、633nm)の範囲の波長を有する赤色レーザーダイオードであってよい。代替的に、電磁放射源は、好ましくは415〜425nmの波長でエネルギーを提供するように構成されたLEDであってよい。
ある場合には、装置の検出区画をOptidex(登録商標)(CSEM)で機能化して、タンパク質のナノ粒子の凝集への干渉を低減できる。
いくつかの場合において、検出区画とシグナルリザーバとを分離する障壁は、検出ナノ粒子凝集体を障壁に局在化させるために特異的な結合対の構成要素で機能化される。いくつかの特定の場合において、障壁は、検出ナノ粒子の第1および/または第2のプローブで機能化される。このようにして、凝集した検出ナノ粒子を、ナノ粒子凝集の根底にある同じ結合ストラテジーを使用して、障壁に局在化させることができる。プローブのこの二重機能は、装置の設計および製造の点で有利である。
本発明のこの第2の態様に従うある場合には、熱応答性ポリマーは、ポリ(アリルアミン)(PAH)の表面層を含む。したがって、ある場合には、表面PAH層は、検出ナノ粒子の第1および/または第2のプローブで機能化される。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合には、第1および第2の検出ナノ粒子は、各々、第1および第2のプローブの両方を含む。いくつかの特に好ましい場合において、第1および第2の検出ナノ粒子は同一である。
ある場合には、検出ナノ粒子は、好ましくは貴金属である金属原子のコアを含む。特定の場合、金属は銀である。ある場合には、検出ナノ粒子のコアの直径は、10〜100nmの範囲、例えば、40〜70nmの範囲である。
本発明のこの第2の態様によれば、シグナル手段は、本発明の第1の態様に関連して定義されるようであってよい。特に、シグナル手段は、ストレプトアビジン、抗体、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ)、フルオロフォア、色素、1つまたは複数の量子ドット、および/または1つまたは複数のラテックスビーズを含み得る。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合には、シグナル手段は複数のシグナルナノ粒子である。本発明者らは、ナノ粒子が、シグナルリザーバを封じる透過性または半透過性の障壁の使用を可能にする、シグナル手段として有用な利点を提供することを見出した。例えば液体染料の漏出を防止するために必要とされるような気密シールは、圧力の差に感受性であり、したがって、圧力に誘発される障壁材料の破壊または弱化はシグナル手段の望ましくない放出をもたらし、かつ偽陽性結果の危険性を増加させる可能性がある。有利なことに、ナノ粒子は、適切なシグナルリザーバに収容されるのに十分に小さいが、リザーバを閉じる隔壁が空気圧の均等化を可能にするように透過性にされ得るほど十分に大きい。好ましくは、シグナルリザーバから放出されるシグナルナノ粒子の数は、上記放出をもたらすのに必要な検出ナノ粒子の数を超える。
ある場合には、シグナルナノ粒子は、好ましくは貴金属である金属原子のコアを含む。特定の場合、金属は金である。ある場合には、シグナルナノ粒子のコアの直径は10〜20nmの範囲にある。
いくつかの特に好ましい場合において、シグナルナノ粒子の金属コアと検出ナノ粒子の金属コアは、異なる金属である。このようにして、検出ナノ粒子は、シグナルナノ粒子または装置の他の構成要素によって吸収されない波長での照射により熱応答性ポリマーに熱伝達を導くために使用され得る。
ある場合には、シグナルナノ粒子は球状形態を有していてよい。他の場合には、シグナルナノ粒子は棒状の形態を有してよい。他のシグナルナノ粒子形態もまた考慮され、装置内での使用に容易に適用され得る。異なるナノ粒子形態は、シグナルナノ粒子の放出後に観察される異なる色シグナルを可能にし、これは、装置からの色分けされた読み出しを提供するのに有利であり得る。
場合によっては、シグナルナノ粒子は、チオール末端ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(IgeSH)で機能化される。IgeSHでの機能化は、乾燥および再溶解後であっても、凝集に対してナノ粒子を安定化する。
ある場合には、シグナルリザーバは、支持材料、好ましくはマクロポーラスシリコン基板中に1つまたは複数の空洞を含む。マクロポーラスシリコン基板の使用は、大規模にシグナル手段を予めロードすることを可能にし、基板は必要に応じて切断することができ、装置製造に関して相当な利点を提供する。
ある場合には、空洞はマイクロキャビティ、マイクロウェル、またはマイクロポアである。いくつかの好ましい場合において、各空洞は、少なくとも4×105ナノ粒子/μm3の濃度で検出可能なシグナル手段を含んでよい。このようにして、潜在的に少数の凝集した検出ナノ粒子によるシグナルリザーバを封じる隔壁の破壊は、比較的大きな容量のシグナル手段の放出をもたらし、それによってシグナルの増幅を生じる。好ましくは、例えば少数の空洞を開口する隔壁の機械的破壊の場合に擬陽性を最小限に抑えるように、検出可能なシグナルを生成するために複数の空洞を封じる障壁の破壊を必要とする。
本発明の第2の態様に従うある場合には、シグナルリザーバは、発明の第1の態様に関連して定義されるような複数のマイクロスフェアを含んでよい。特に、マイクロスフェアは、1〜20μmの範囲、例えば5〜10μmの範囲の平均直径を有してよい。
ある場合には、シグナルリザーバは複数の上記マイクロスフェアを含み、シェルの表面層は負に帯電しているか、または正に帯電している。
ある場合には、シグナルリザーバは複数の上記マイクロスフェアを含み、上記マイクロスフェアはシグナル増幅領域のマイクロチャネル内に位置し、かつ複数のパッキング粒子に隣接しておよび/または接触している。パッキング粒子は、マイクロスフェアよりも大きな直径であってよい。特に、パッキング粒子は、ガラス、シリカまたはアガロースビーズを含んでよい。パッキング粒子は、20〜200μmの範囲、例えば50〜150μmの範囲の平均直径を有してよい。
ある場合には、マイクロスフェアがパッキング粒子と共に収容されるマイクロチャネルは、マイクロ流体保持チャンバを形成する。
本発明のこの第2の態様に従うある場合には、装置は、例えば検出区画と連通できるシグナル表示領域をさらに含む。好ましい場合には、このシグナル表示領域は、シグナルリザーバからのその放出後に検出可能なシグナル手段を捕捉する保持手段を含む。特定の場合、保持手段は保持ストリップである。装置中にシグナル表示領域を組み込むことにより、便利なオンデバイス読み出しが可能になる。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合には、検出ナノ粒子プローブは、標的核酸の第1および第2の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。ある場合には、オリゴヌクレオチドプローブの一方または両方が、リンカー基を介して検出ナノ粒子のコアに共有結合される。いくつかの特定の場合において、リンカー基はチオール基を含み得る。いくつかのさらなる場合において、リンカー基は、C10−C20アルキルおよび/またはグリコールスペーサーを含み得る。
本発明のこの態様に従うある場合には、第1および第2のプローブのオリゴヌクレオチドは、15〜50塩基対離れた標的核酸の領域を結合する。
ある場合には、各検出ナノ粒子は200〜300個のプローブ分子を有する。ある場合には、プローブのオリゴヌクレオチドは2’−O−メチルオリゴヌクレオチドである。
ある場合には、検出ナノ粒子プローブのオリゴヌクレオチドは、疾患に関連する遺伝子を結合する。いくつかの好ましい場合において、遺伝子はがんに関連する遺伝子である。
ある場合には、第1または第2のプローブのオリゴヌクレオチドは、野生型配列の変異体である標的核酸配列に相補的である。特定の場合には、この変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み、第一または第二のプローブのオリゴヌクレオチドは上記SNP位置を含む標的核酸の一部にハイブリダイズする。ある場合には、変異体配列は、遺伝要素を有するがんまたは他の疾患に関連する変異を含む。遺伝要素を有し、関連する変異が本発明による標的アナライトとして使用できる障害の例は、嚢胞性線維症、血色素症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、サックス病、クローン病、およびハンチントン病を含む。変異は、一塩基変異、欠失、挿入(トリヌクレオチドリピートを含む)または配列転座からなる群から選択され得る。
ある場合には、変異は、NCBI Gene ID:1956のヒト上皮増殖因子受容体(EGFR);NCBI Gene ID:672のヒト早発型乳がん1(BRCA1);NCBI Gene ID:673のヒトBRAF遺伝子;およびNCBI Gene ID:3845のヒトKRASプロトオンコジーンからなる群より選択される遺伝子中にあってよい。
ある場合には、変異は:
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択されてよい。
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択されてよい。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合には、検出可能なシグナル手段は、特異的な結合対の第1の構成要素を含む。好ましい場合には、上記第1の構成要素はビオチンまたはストレプトアビジンである。したがって、いくつかの特に好ましい場合において、シグナルナノ粒子は特異的な結合対の第1の構成要素を含み、シグナル表示領域の保持ストリップはその特異的な結合対の対応する第2の構成要素を含み、上記第1の構成要素および上記第2の構成要素はビオチンビオチンおよびストレプトアビジンから選択される。このようにして、シグナルナノ粒子は、それらの放出後に保持ストリップ上に捕捉され、ナノ粒子の距離依存的光学特性に起因するストリップでの可視色変化として容易に観察される。
ある場合には、特異的な結合対の第1の構成要素は、リンカー基を介してシグナルナノ粒子のコアに共有結合される。いくつかの特定の場合において、リンカー基はチオール基を含み得る。いくつかのさらなる場合において、リンカー基は、C10−C20アルキルおよび/またはグリコールスペーサーを含み得る。ある場合には、各検出ナノ粒子は200〜300の結合構成要素を有する。
本発明のこの第2の態様に従うある場合には、装置は、検出区画と連通する試料注入口をさらに含む。
ある場合には、装置は、試料注入口と検出区画との間に配置される溶解区画をさらに備え、上記溶解区画は加熱要素を含む。好ましくは、加熱要素は、バルク加熱構成要素よりも迅速かつ効率的であるため薄膜加熱要素であり、オンデバイス電源(例えば、ボタン電池)によって容易に給電され得る。
ある場合には、試料注入口は、血液分離手段を含んでよい。好ましくは、これは自己給電型の集積化マイクロ流体血液分析システム(SIMBAS)であり、これは他の膜ベースの血液分離技術よりも効率的でありかつ費用効果が高い。他の場合には、試料注入口は、グルコースまたはシバクロンブルーなどの、熱安定剤を含む。
ある場合には、本発明のこの態様および他の態様の装置は、スタンドアロンの自己給電型マイクロ流体システムの形態を取ることができる、例えば循環DNAの検出のための装置であってよい。装置は、ポリマー材料を含み、および/またはポリマー材料から作製される。装置は、順次ワークフローを可能にするように設計されてよい。特に、以下のワークフロー段階、および対応する装置の特徴が提供され得る:試料上の調製(血漿抽出および標的DNA濃縮)、検出ナノ粒子との試料インキュベーション、検出シグナル粒子放出および裸眼で検出可能なシグナルを生じるラテラルフローアッセイストリップ上での最終的な結合アッセイ。装置は、ある場合には、500マイクロリットル未満の試料容量を保持できる。マイクロ流体システムは、ある場合には、紙のようなマイクロ流体をプラスチックカセット中に統合するハイブリッドデバイスの形態をとってもよい。ある場合には、装置内の試料輸送は、負圧(例えば、カスタマイズされたポリ(ジメチルシロキサン)(「PDMS」)マイクロポンプ)によって駆動されてよい。
本発明のこの第2の態様に従うある場合には、検出区画は、標的核酸のアンチセンス鎖に特異的な複数のブロッキングプローブをさらに含む。ブロッキングプローブは、本発明の第1の態様に関連して定義される通りであり得る。
本発明のこの態様および他の態様に従うある場合には、ブロッキングプローブは2’−o−メチルオリゴヌクレオチドである。
第3の態様において、本発明は、2つまたはそれより多い試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための装置を提供し、同一の装置上の並行経路中に本発明の第2の態様の要素を含む。
第4の態様において、本発明は、試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出するための装置であって、
試料注入口と;
試料注入口と連通する溶解室であって、加熱要素を含む溶解室と;
標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のブロッキングプローブと、標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子と、を具備する検出区画と;
検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源と;
複数のシグナルナノ粒子を含み、熱応答性ポリマー層によって検出区画から分離される、シグナルリザーバと;
検出区画と連通するシグナル表示領域であって、シグナルリザーバからの放出後にシグナルナノ粒子を捕捉するための保持ストリップを含む、シグナル表示領域と;
を含む装置を提供する。
試料注入口と;
試料注入口と連通する溶解室であって、加熱要素を含む溶解室と;
標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のブロッキングプローブと、標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子と、を具備する検出区画と;
検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源と;
複数のシグナルナノ粒子を含み、熱応答性ポリマー層によって検出区画から分離される、シグナルリザーバと;
検出区画と連通するシグナル表示領域であって、シグナルリザーバからの放出後にシグナルナノ粒子を捕捉するための保持ストリップを含む、シグナル表示領域と;
を含む装置を提供する。
第5の態様において、本発明は、試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出するための装置であって、
i)試料注入口と;
ii)試料注入口と連通する溶解区画であって、加熱要素を含む溶解区画と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブと上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子と、任意選択で標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のブロッキングプローブとを具備する検出区画と;
iv)凝集状態の検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源と;
v)シグナル手段を含むコアとコアを包み込むシェルとを具備する複数の熱応答性マイクロスフェアであって、シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
vi)検出区画と連通するシグナル表示領域であって、熱応答性マイクロスフェアからの放出後にシグナル手段を捕捉するための保持ストリップを含む、シグナル表示領域と、
を含む装置を提供する。
i)試料注入口と;
ii)試料注入口と連通する溶解区画であって、加熱要素を含む溶解区画と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブと上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子と、任意選択で標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のブロッキングプローブとを具備する検出区画と;
iv)凝集状態の検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源と;
v)シグナル手段を含むコアとコアを包み込むシェルとを具備する複数の熱応答性マイクロスフェアであって、シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
vi)検出区画と連通するシグナル表示領域であって、熱応答性マイクロスフェアからの放出後にシグナル手段を捕捉するための保持ストリップを含む、シグナル表示領域と、
を含む装置を提供する。
第6の態様において、本発明は、哺乳動物の対象の診断または予後の方法における使用のための、本発明の第2、第3、第4、または第5の態様の装置を提供し、試験試料は上記対象から得られる生物学的試料である。
第7の態様において、本発明は、細菌、寄生生物、または他の生物学的汚染物質の検出の方法における使用のための、本発明の第2、第3、第4、または第5の態様の装置を提供し、試験試料は環境的試料である。
第8の態様において、本発明は、
試料注入口と;加熱要素を含む溶解区画と;組み込まれた電磁放射源と;複数のシグナルナノ粒子を含みかつ熱応答性ポリマー層によって封じられたシグナルリザーバと;シグナルリザーバからの放出後にシグナルナノ粒子を捕捉するための保持ストリップを含むシグナル表示領域とを具備する装置と;
標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できるブロッキングプローブの1つまたは複数の集団と;
上記標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子の1つまたは複数の集団と
を含むキットを提供する。
試料注入口と;加熱要素を含む溶解区画と;組み込まれた電磁放射源と;複数のシグナルナノ粒子を含みかつ熱応答性ポリマー層によって封じられたシグナルリザーバと;シグナルリザーバからの放出後にシグナルナノ粒子を捕捉するための保持ストリップを含むシグナル表示領域とを具備する装置と;
標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できるブロッキングプローブの1つまたは複数の集団と;
上記標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子の1つまたは複数の集団と
を含むキットを提供する。
第9の態様において、本発明は、
i)試料注入口と;
加熱要素を含む溶解区画と;
組み込まれた電磁放射源と;
シグナル手段を含むコアと、コアを包み込むシェルとを含む複数の熱応答性マイクロスフェアであって、シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
マイクロスフェアからの放出後にシグナル手段を捕捉する保持ストリップを含むシグナル表示領域と;
を具備する装置と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できるブロッキングプローブの1つまたは複数の集団と;
iii)上記標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子の1つまたは複数の集団と;
を含むキットを提供する。
i)試料注入口と;
加熱要素を含む溶解区画と;
組み込まれた電磁放射源と;
シグナル手段を含むコアと、コアを包み込むシェルとを含む複数の熱応答性マイクロスフェアであって、シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
マイクロスフェアからの放出後にシグナル手段を捕捉する保持ストリップを含むシグナル表示領域と;
を具備する装置と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できるブロッキングプローブの1つまたは複数の集団と;
iii)上記標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび上記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子の1つまたは複数の集団と;
を含むキットを提供する。
本発明は、そのような組み合わせが明らかに許容できないか、または明示的に回避されると記載されている場合を除いて、記載された態様および好ましい特徴の組み合わせを含む。本発明のこれらおよびさらなる態様および実施形態は、以下に、ならびに添付の実施例および図面を参照してさらに詳細に記載される。
本発明の詳細な説明
本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示すように定義されることが意図される。
本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示すように定義されることが意図される。
ナノ粒子
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、ナノメータースケールを有する粒子を指し、特定の形状の限定を伝えることを意図するものではない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッドなどを包含する。特定の実施形態において、本明細書で企図されるナノ粒子および/またはナノ粒子のコアは、概して多面体または球形の幾何学的形状を有する。ナノ粒子またはナノ粒子のコアの「直径」に対する言及は、一般に、ナノ粒子またはナノ粒子のコアの最長寸法をそれぞれ意味すると解釈される。実質的に多面体または球形の形状を有するナノ粒子の場合、粒子を横切る最短寸法は、典型的には、粒子を横切る最長寸法の50%以内であり、例えば、25%または10%以内であり得る。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、ナノメータースケールを有する粒子を指し、特定の形状の限定を伝えることを意図するものではない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッドなどを包含する。特定の実施形態において、本明細書で企図されるナノ粒子および/またはナノ粒子のコアは、概して多面体または球形の幾何学的形状を有する。ナノ粒子またはナノ粒子のコアの「直径」に対する言及は、一般に、ナノ粒子またはナノ粒子のコアの最長寸法をそれぞれ意味すると解釈される。実質的に多面体または球形の形状を有するナノ粒子の場合、粒子を横切る最短寸法は、典型的には、粒子を横切る最長寸法の50%以内であり、例えば、25%または10%以内であり得る。
本明細書で使用される場合、「コロナ」は、ナノ粒子のコアの露出表面を部分的または完全に覆う層またはコーティングを指す。コロナは、ナノ粒子のコアに共有結合される複数のリガンドを含む。したがって、コロナは、金属コアを取り囲むかまたは部分的に取り囲む有機層であると考えることができる。特定の実施形態では、コロナは、ナノ粒子のコアを不動態化することを提供し、および/またはそれに関与する。したがって、場合によっては、コロナは、実質的にコアを安定化させるのに十分な完全なコーティング層を含み得る。場合によっては、コロナは、ナノ粒子の、水溶性などの溶解性を促進する。
ナノ粒子は、リガンドを固定化するための基質として使用できる、例えば金属または半導体原子のクラスターなどの、小さな粒子である。
本明細書で使用される場合、用語「検出ナノ粒子」は、目的の標的アナライトに特異的な1つまたは複数のプローブで機能化されたナノ粒子を指す。好ましくは、ナノ粒子は、10〜100nmの、より好ましくは20〜60nmの平均直径を有するコアを有する。リガンドがコアに加えて考慮される場合、好ましくは、粒子の全体の平均直径は22〜70nm、より好ましくは30〜60nm、そして最も好ましくは40〜50nmである。平均直径は、透過型電子顕微鏡法のような当技術分野で周知の技術を用いて測定できる。
本明細書で使用される場合、「シグナルナノ粒子」という用語は、シグナル分子として機能することを意図されるナノ粒子を指す。このシグナルは、例えば貴金属ナノ粒子の距離依存的光学特性のようなナノ粒子の固有の特性の結果として、または検出可能な標識の組み込みを介して生じ得る。好ましくは、ナノ粒子は、5〜30nmの、より好ましくは約15nmの平均直径を有するコアを有する。リガンドがコアに加えて考慮される場合、好ましくは粒子の全体の平均直径は7〜40nm、より好ましくは10〜30nm、そして最も好ましくは15〜20nmである。平均直径は、透過型電子顕微鏡法のような当技術分野で周知の技術を用いて測定できる。
コアの材料は、金属または半導体であってよく、2つまたはそれより多いタイプの原子から形成できる。ナノ粒子のコアはまた、合金から形成されてもよい。好ましくは、コアの材料は、AuまたはAgから選択される金属である。ナノ粒子のコアは、ナノメートル範囲でコアの直径を提供するために、少なくとも500個の原子(例えば、金原子)を好ましくは含む。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子またはそのリガンドは、検出可能な標識を含み得る。標識は、ナノ粒子のコアまたはリガンドの要素であってよい。標識は、ナノ粒子のその要素の固有の性質のために検出可能であり得るか、または検出可能なさらなる部分に連結、結合または会合されることによって検出可能であり得る。好ましい標識は、蛍光基または色素である標識を含む。蛍光基は、フルオレセイン、ローダミンまたはテトラメチルローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5などを含み、ラマン散乱分光法を用いる蛍光標識の励起および放出光の検出によって検出できる(YC Cao、R. Jin、CA Mirkin、Science 2002年、297:1536−1539)。
凝集
本明細書で使用される場合、「凝集」は、検出ナノ粒子の凝集体の形成を指す。「凝集体」は、ナノ粒子のプローブと目的の標的アナライトとの間の物理的相互作用によって結合される検出ナノ粒子の集合体である。標的アナライトは別個の検出ナノ粒子間の物理的「ブリッジ」であるので、凝集は、標的アナライトが存在する場合にのみ起こり得る。凝集体は固定された単位ではなく、サイズや形状が変わり得る。例えば、大きな凝集体がより小さい凝集体へと分解し、または小さい凝集体が合体してより大きな凝集体を形成してもよい。
本明細書で使用される場合、「凝集」は、検出ナノ粒子の凝集体の形成を指す。「凝集体」は、ナノ粒子のプローブと目的の標的アナライトとの間の物理的相互作用によって結合される検出ナノ粒子の集合体である。標的アナライトは別個の検出ナノ粒子間の物理的「ブリッジ」であるので、凝集は、標的アナライトが存在する場合にのみ起こり得る。凝集体は固定された単位ではなく、サイズや形状が変わり得る。例えば、大きな凝集体がより小さい凝集体へと分解し、または小さい凝集体が合体してより大きな凝集体を形成してもよい。
熱応答性ポリマー
本明細書中で使用される場合、「熱応答性ポリマー」または「温度応答性ポリマー」は、温度によるそれらの物理的性質の劇的かつ不連続な変化を示すポリマーまたはポリマーの組合せを指す。特に、熱応答性ポリマーは、温度による水中または水溶液中の溶解度の変化を示すポリマーであってよい。具体例は、ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリアリルアミン(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルを含む。
本明細書中で使用される場合、「熱応答性ポリマー」または「温度応答性ポリマー」は、温度によるそれらの物理的性質の劇的かつ不連続な変化を示すポリマーまたはポリマーの組合せを指す。特に、熱応答性ポリマーは、温度による水中または水溶液中の溶解度の変化を示すポリマーであってよい。具体例は、ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリアリルアミン(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルを含む。
以下は、例として提示され、特許請求の範囲の限定として解釈されるべきではない。
実施例
実施例1−BRAF変異検出のためのブロッキングプローブおよび検出プローブの開発
BRAF遺伝子中の変異は、メラノーマの45%以上に認められ、そのうち80%までが一塩基変異T1799A(V600E)である。このBRAF変異状態の検出は、腫瘍検査の信頼できる代替物であると考えられている。
実施例1−BRAF変異検出のためのブロッキングプローブおよび検出プローブの開発
BRAF遺伝子中の変異は、メラノーマの45%以上に認められ、そのうち80%までが一塩基変異T1799A(V600E)である。このBRAF変異状態の検出は、腫瘍検査の信頼できる代替物であると考えられている。
BRAF変異状態を検出するために、2つのプローブが開発された:
1)目的の変異DNA配列のアンチセンス鎖に相補的なブロッキングプローブ;このプローブは、二本鎖DNA(dsDNA)の熱変性の後に変異DNA配列のアンチセンス鎖に優先的に結合する。
結合キネティクスが変異配列dsDNAの再アニーリングではなくブロッキングプローブ:アンチセンス鎖の形成に非常に有利であるように、ブロッキングプローブは短く、過剰に提供される。これは、装置によるその後の検出のための変異DNA配列のセンス鎖の濃縮をもたらす。
1)目的の変異DNA配列のアンチセンス鎖に相補的なブロッキングプローブ;このプローブは、二本鎖DNA(dsDNA)の熱変性の後に変異DNA配列のアンチセンス鎖に優先的に結合する。
結合キネティクスが変異配列dsDNAの再アニーリングではなくブロッキングプローブ:アンチセンス鎖の形成に非常に有利であるように、ブロッキングプローブは短く、過剰に提供される。これは、装置によるその後の検出のための変異DNA配列のセンス鎖の濃縮をもたらす。
2)変異DNA配列のセンス鎖に相補的であり、凝集事象の基礎を形成する検出プローブ。このプローブは、変異DNA配列に選択的に結合するが、野生型DNA配列には結合しない。
変異および野生型のBRAF配列を合成し、野生型および変異のBRAFの検出プローブとのそれらの結合を、PBS緩衝液中で表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。変異BRAF配列は、野生型プローブではなく変異BRAFプローブに優先的に結合することが見出された(図1A)。
変異BRAFプローブ:
5’−TGG TCT AGC TAC AGA GAA ATC TCG−3’(配列番号1);
WT BRAFプローブ:
5’−TGG ATC CAG ACA ACT GTT CAA ACT−3’(配列番号2)(合成配列の最初の24ヌクレオチドに対応する)。
同様に、変異BRAFプローブは、野生型BRAF配列より変異BRAF配列にはるかに強く結合する(図1B)。これらのデータは、設計されたプローブが、目的の変異配列に特異的に結合できることを示している。
変異および野生型のBRAF配列を合成し、野生型および変異のBRAFの検出プローブとのそれらの結合を、PBS緩衝液中で表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。変異BRAF配列は、野生型プローブではなく変異BRAFプローブに優先的に結合することが見出された(図1A)。
変異BRAFプローブ:
5’−TGG TCT AGC TAC AGA GAA ATC TCG−3’(配列番号1);
WT BRAFプローブ:
5’−TGG ATC CAG ACA ACT GTT CAA ACT−3’(配列番号2)(合成配列の最初の24ヌクレオチドに対応する)。
同様に、変異BRAFプローブは、野生型BRAF配列より変異BRAF配列にはるかに強く結合する(図1B)。これらのデータは、設計されたプローブが、目的の変異配列に特異的に結合できることを示している。
それぞれの変異BRAF遺伝子への変異プローブの結合の相対強度を決定するために、いくつかの異なるプローブ化学(DNA、2’−o−MeおよびLNA)が試験された(図1C)。
DNA Exiqonプローブ:
5’−AT CGA GAT TTC TCT GTA GCT AG−3’(配列番号3)
2’−o−メチルプローブ:
5’−AT CGA GAT TTC TCT GTA GCT AG−3(配列番号4)
(両方とも70merの変異DNAのアンチセンス鎖に結合する);
LNA変異プローブ:
5’−TG GTC TAG CTA CAG AGA AAT CTC G−3’(配列番号5)(70−merの変異DNAのセンス鎖に結合する)。
結合曲線の比較により、異なるプローブ化学に対する解離定数(KD)を以下のように決定した:DNA=2.41nM;2’
−o−Me=1.81nM;LNA=7.55nM。これらのデータから、2’−o−メチルプローブ化学が最も好ましいと決定された。
DNA Exiqonプローブ:
5’−AT CGA GAT TTC TCT GTA GCT AG−3’(配列番号3)
2’−o−メチルプローブ:
5’−AT CGA GAT TTC TCT GTA GCT AG−3(配列番号4)
(両方とも70merの変異DNAのアンチセンス鎖に結合する);
LNA変異プローブ:
5’−TG GTC TAG CTA CAG AGA AAT CTC G−3’(配列番号5)(70−merの変異DNAのセンス鎖に結合する)。
結合曲線の比較により、異なるプローブ化学に対する解離定数(KD)を以下のように決定した:DNA=2.41nM;2’
−o−Me=1.81nM;LNA=7.55nM。これらのデータから、2’−o−メチルプローブ化学が最も好ましいと決定された。
実施例2−INDICATE装置の特性のin silicoモデリング。
装置の機能的特性を最適化するために、計算モデリングを使用してINDICATE装置をin silicoでシミュレートした。
装置の機能的特性を最適化するために、計算モデリングを使用してINDICATE装置をin silicoでシミュレートした。
第一に、個々の成分のそれぞれに関与する個々の数学的方程式を定義し、遺伝的アルゴリズム(GA)を用いて結合した(Goldberg and Deb、1991年、Foundations of Genetic Algorithms In Foundations of Genetic Algorithms、G.J.E.Rawlins、Ed. Morgan Kaufmann、San Mateo、CA)。このような技術は、プラズモン装置の設計を最適化する上で既に十分に確立されている(Sukharev and Seideman、Nano Lett、2006年、Vol.6、No.4、pp715〜719)。
シミュレーションは、(1)高感度(すなわち、低い偽陰性率);2)高いシグナル/ノイズ比;および3)入力シグナルの高い増幅率、に関して装置を最適化するために使用された。解析は、Matlab数値計算(MathWorks)およびComsol Multiphysics(Comsol AB)ソフトウェア内のマルチフィジックス手法を使用して実行された。
試料モジュール中の赤血球からの血漿の分離を、ろ過プロセスのための確率論的手法を用いてモデル化した(Rousselら、Phys Rev Lett、2007年、Vol。98、pp114502)。溶解モジュールにおけるDNAのアニールおよび再アニールの電熱溶融を、熱力学の2相モデルを用いてシミュレートした(Owczarzyら、Biopolymers、1997年、Vol.44、No.3、pp217〜239)。シグナル増幅領域におけるプローブへの変異DNA結合に関連する結合エネルギーを、Berg von Hippel法(Berg and von Hippel、J Mol Biol、1987年、Vol.193、pp 723〜750)を用いてモデル化し、一方でレーザーと凝集した検出ナノ粒子との間から熱応答性ポリマーへの熱伝達は、古典的な熱伝達理論によってモデル化した(BaffouおよびQuidant、Laser Photonics Rev、2013 Vol 7、pp 171−187; Hohenester andTruler、Comput Phys Commun、2012、Vol.183、pp 370−381)。
装置の初期性能範囲を提供するために、変異したセンス鎖DNAが検出ナノ粒子に結合する場合に形成される凝集体のサイズを以下のようにモデル化した:
ここで、SはいくつかのDNA結合プローブナノ粒子を含む凝集体(NpNP)によって覆われた表面を表し、ΦAgNPは銀ナノ粒子の直径を表し、pは粒子間距離である。
これを、以前の理論的および実験的研究(Baffouら、Appl Phys Lett、2009年、Vol.94 pp153109〜153103)に基づく、均一照射のモデルと組み合わせた。
ここで、σabs、I、κ、S、およびpは、それぞれ、プローブNPの吸収係数、LED光源によって提供される出力強度、凝集体の熱伝導率、凝集体の横方向のサイズおよび粒子間距離である。
図2Aは、100mWのLEDレーザー(1×107W/m2の強度)で均一に照射された場合の、プローブ粒子の数(NpNP)に対する検出ナノ粒子(塩基対の数における)間の距離の関数としてΔTを示す。この分析から、dpNP−pNPが>50nm(すなわち>15塩基対)である50NPの凝集体が、室温より40℃を超える温度上昇をもたらすことが決定された。
10−5〜5×10−5mol/Lのシグナルナノ粒子の濃度範囲について、固定された寸法(直径10μm×500μm)を有する円筒状マイクロポアをモデル化することにより、〜凝集体中に含まれるプローブのナノ粒子の数に対して開放される必要のある最小限のマイクロポアの数をプロファイルできる。図2Bは、マイクロポア中のシグナルナノ粒子の濃度および凝集した検出ナノ粒子の数の両方の関数として、開放される必要のあるマイクロポアの数を示す。マクロポーラスシリコン基板のマイクロウェルの場合、空洞は、約1μmの直径および約10μmの深さを有することに留意すべきである。この場合、正のシグナルに対して開かれたポアの数を計算するために上記のアプローチを適用すると、7の数字(ナノ粒子濃度0.1mol/L、ポアあたりのナノ粒子の数4×109)が得られる。したがって、上記の図は、特定の実施形態を例示するが、本明細書でさらに定義されるような本発明を限定するものではない。
各マイクロポアが0.2〜1×109個のシグナルナノ粒子を含み得るということに基づいて、可視シグナル(8×109シグナルナノ粒子)を生じるために少なくとも8個のマイクロポアが誘発される必要があると決定された。可視シグナルのこの閾値は、単一のポアが開いた場合の装置上の誤検出を防止するのに役立つ。しかし、上に見られるように、1μm×10μmの寸法の空洞の場合、対応する閾値は、7個のポアの開口であると計算され得る。
これが起こるためには、マイクロポア毎に凝集体あたり少なくとも50個のプローブのナノ粒子が必要である。これは、可視シグナルに対して合計400コピーの変異したセンス鎖DNAに対応する。25%の装置の効率を仮定すると、1,600個の変異DNAコピーまたは16,000コピー/血液1mlの理論上の検出限界(LOD)が得られる。これは、がん患者の血液中における変異KRASのDNAコピーまたは変異BRAFのコピーの報告されたレベル(50〜180,000の間であると報告されている;Spindlerら、Clin Cancer Res、2012年、Vol.18、pp 1177−1185)の範囲内である。
このタイプのモデリングは、特定の検出または市場の要求を満たすために装置の製造を調整するためにも使用できる。例えば、診断目的のための装置は高感度を必要とするが、高価な標的療法の投与に関する臨床的意思決定を容易にするものは、高い特異性(すなわち、低い偽陽性率)から利益を得るであろう。
実施例3−マイクロ流体の血液分離の検証。
血漿を得るための全血試料のろ過は自己給電型の集積化マイクロ流体血液分析システム(SIMBAS)(Dimovら、Lab Chip、2011年、Vol.11、pp 845〜850)により、これは他の膜ベースの血液分離技術よりも効率的でかつ費用効果が高い。
血漿を得るための全血試料のろ過は自己給電型の集積化マイクロ流体血液分析システム(SIMBAS)(Dimovら、Lab Chip、2011年、Vol.11、pp 845〜850)により、これは他の膜ベースの血液分離技術よりも効率的でかつ費用効果が高い。
SIMBASシステムは、設計変更により、より大きな体積(100μl)を受け入れるようにされた。元の設計(すなわち、上記のDimovら、2011年の参考文献に記載されているもの)への主な変更は以下の通りであった。
異なる製造技術を用いてチップを製造した。この場合、迅速かつ簡単なマルチプラスチック薄膜ラミネーション(PMMA、PSA、COP)技術を採用した。
プールの寸法は、100マイクロリットルの全血試料から40マイクロリットルの血漿を得るために、60マイクロリットルの体積に拡大された。
チャネルアスペクト比は、製造プロセスの制限に適合させた。
最終的なチャネルの寸法は、チップの水圧抵抗を低減するように設計された。
側壁において、ブレンドされた(blended)エッジに変更された鋭いエッジが存在しないという形で特別な改良が施された。提供される経路のすべてのエッジは、流れを容易に阻止する可能性のある血小板の凝集および血餅の形成を避けるために、ブレンドされている。
最後に、プールの注入口および出口に配置されるチャネルのセグメントが、ディフューザおよびノズルの形状にそれぞれ修正された。一方で、ディフューザがプールのエッジに近づいているときに流れを減速して、滑らかな充填プロセス(プールを満たす際の均質性)を得る。一方、ノズルは、プールの出口で血漿を加速し、分離された血漿の流れを改善し、実際に分離効率を向上させる。
図3は、全血試料からの透明な血漿の分離を経時的に示し、血液のオンデバイスの分離能力を実証している。
実施例4−検出ナノ粒子の合成および機能化。
Turkevich法(Turkevichら、Discuss Faraday Soc、1951年、Vol. 11、pp.55〜75)に従って金ナノ粒子(AuNP)を合成して、13.3±1.2nmの平均直径(100を超えるナノ粒子の分析による)を有する粒子を生成した。UV−Visの分析は、519nmに位置する局在した表面プラズモンバンドを示した(図4)。それらの安定な表面化学のために、金の検出ナノ粒子が装置のプロトタイプ開発中に使用された。最終的な装置では、銀の検出ナノ粒子が使用され得る。
Turkevich法(Turkevichら、Discuss Faraday Soc、1951年、Vol. 11、pp.55〜75)に従って金ナノ粒子(AuNP)を合成して、13.3±1.2nmの平均直径(100を超えるナノ粒子の分析による)を有する粒子を生成した。UV−Visの分析は、519nmに位置する局在した表面プラズモンバンドを示した(図4)。それらの安定な表面化学のために、金の検出ナノ粒子が装置のプロトタイプ開発中に使用された。最終的な装置では、銀の検出ナノ粒子が使用され得る。
最近のプロトコル(Mirkinら、Anal Chem、2006年、Vol.7、pp 8313〜8318)に従って、クエン酸安定化AuNPを一本鎖DNA(ssDNA)で機能化した。DNAで安定化されたAuNPは、UV−Vis分光法によって確認されるように、陰イオン界面活性剤−ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)0.01wt%を含む水溶液中でコロイド安定性を示す。プラズモンバンドは、DNA結合後、すべての試料において〜3nm赤方偏移し、ナノ粒子表面の周りの分子シェルの形成を示唆している。TEM分析は、〜1.4nmの厚さの分子シェルの形成を確証する(図5)。
実施例5−変異標的DNAの存在下での検出ナノ粒子の凝集の確認。
図6は、様々な濃度の標的DNAアナライトを調べるために使用される、15〜50bp離れた2つのプローブの「サンドイッチ」結合の概略図を示す。両方のプローブが検出ナノ粒子に共役されると、それらは、変異のセンス鎖DNAのそれらのそれぞれの相補的領域とハイブリダイズして、別個のナノ粒子間のブリッジを形成し、それによって浮遊性の検出ナノ粒子の凝集を誘発する。
図6は、様々な濃度の標的DNAアナライトを調べるために使用される、15〜50bp離れた2つのプローブの「サンドイッチ」結合の概略図を示す。両方のプローブが検出ナノ粒子に共役されると、それらは、変異のセンス鎖DNAのそれらのそれぞれの相補的領域とハイブリダイズして、別個のナノ粒子間のブリッジを形成し、それによって浮遊性の検出ナノ粒子の凝集を誘発する。
凝集を、経時的に色シフトおよびAbsの比(620/520)によって測定した(図7)。完全に相補的な配列(図7A〜7C)と比較して、一塩基ミスマッチDNA(図7D〜7F)を用いるハイブリダイゼーションは、あまり顕著でない凝集および長いハイブリダイゼーション時間をもたらし、オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子は特異的な様式で凝集して一塩基変異間を識別できることを実証した。図7G〜図7Iは、マッチした(すなわち変異)およびミスマッチ(すなわち野生型)の標的DNAの異なる濃度に関する比較キネティクスを示し、マッチした配列およびミスマッチした配列のキネティクスプロファイル間に明確な差異が存在する。
「1トリプレックス」(HS−3’−T10−CTT GTT TTC−5’)(配列番号6)および「2トリプレックス」(HS−5’−T10−GAT TTT CTT C−3’)(配列番号7)と名付けた2つのタイプのプローブと共役したAuNPを調製し、ストック溶液として使用した。2つの相補的な粒子を、10mMのPBS、pH7.4、0.137MのNaClおよび2.7mMのKCl、および追加のNaCl(0.2M)を含む緩衝液中で混合した。我々は、3つの異なる濃度のマッチおよびミスマッチのDNA、すなわち5、25および50nMを使用し、合計6回の実験を行った。アナライトの濃度にかかわらず、一塩基のミスマッチを有するDNAは、マッチする配列と比較して、あまり顕著でない凝集およびより長いハイブリダイゼーション時間を示した。
DNAのアナライトの濃度を50から25nMへと半減させると、ハイブリダイゼーション時間は9分から12分に増加する。両方の濃度のマッチ配列について、ThでのAbs620/520比(0.4)の比較的大きな値は、センサの良好な性能を示唆する。アナライトの濃度を5nMまでさらに低下させると、Thにほとんど影響がないが、ThでのAbs620/520=0.18の小さな値は、この実施例の特定の条件における予想以下の効果を示唆する。したがって、プラズモンセンサは、15分未満で25nMのアナライトの濃度で一塩基多型を識別することができた。
マッチ配列の検出限界をさらに向上させる目的で、塩濃度を変化させて性能を評価した。1トリプレックスおよび2トリプレックスと共役した2種類のAuNPを調製し、ストック溶液として使用した。2つの相補的な粒子を、10mMのPBS、pH7.4、および50nMのマッチおよびミスマッチ配列を含有する緩衝液中で混合した。NaClの3つの異なる濃度、すなわち0.2、0.3および0.4Mを用いて、合計6回の実験を行った。NaClの濃度が増加すると、ハイブリダイゼーション時間が減少する。高濃度のNaCl(0.4M)は確かにTh(6分)を短くするが、ミスマッチ配列のハイブリダイゼーションが顕著になるので、センサの特異性に影響がある。可能な限り短いハイブリダイゼーション時間で、マッチとミスマッチの可能な限り大きな差を維持することを望んでいることに留意すべきである。したがって、この特定の実施例の条件下での塩濃度の上限は、0.3Mであることが判明した。
結論と展望:
プラズモンセンサは、15分未満で、25nMまたはそれを超える濃度で一塩基変異を識別できる。
プラズモンセンサは、15分未満で、25nMまたはそれを超える濃度で一塩基変異を識別できる。
検出実験における最適な塩濃度は約0.2Mであることが判明した。
検出実験における最適粒子濃度[NPs]は1.5nMであることが判明した。
サンドイッチシステムを用いる、より長いssDNA分子(100および250mer)の検出のさらなる評価が意図される。
検出時間(ハイブリダイゼーション時間)および感度(検出限界)の点で性能の改善を可能にする、より大きい吸収係数を有する粒子(ナノロッド)の使用が企図される。
実施例6−シグナルナノ粒子合成および機能化。
Turkevich法(Turkevichら、Discuss Faraday Soc、1951年、Vol.11、pp55〜75)に従い金シグナルナノ粒子を合成し、チオール末端ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(IgeSH)で機能化した。この分子は両親媒性であり、ナノ粒子を凝集に対して安定にする。
Turkevich法(Turkevichら、Discuss Faraday Soc、1951年、Vol.11、pp55〜75)に従い金シグナルナノ粒子を合成し、チオール末端ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(IgeSH)で機能化した。この分子は両親媒性であり、ナノ粒子を凝集に対して安定にする。
これらのシグナルNPは、顕著な凝集なしに水中で乾燥および再溶解することができる。図8は、チオール末端ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(IgeSH)の化学構造、IgeSH機能化シグナルナノ粒子の可逆的乾燥/水和プロセスの概略図、および乾燥前および乾燥後のIgeSH機能化シグナルナノ粒子の水中のUV−Visスペクトルを示す(Maoら、Anal.Chem.、2009年、Vol.81、pp.1660〜1668を参照できる)。
金ナノ粒子は、一端においてチオール基で修飾された、他端においてビオチン分子で修飾されたポリ(エチレングリコール)の直鎖によって構成される第2のリガンドで機能化できる(Liら、J Phys Chem B.、2006年、Vol.110(32)、pp.15755〜15762)。したがって、チオール基は金表面に強く結合し、二重リガンド機能化を可能にする。ビオチン分子は、ストレプトアビジンで機能化される保持ストリップ上での固定に使用される。ナノ粒子を安定化し非特異的相互作用を避けるために、2つのリガンドIgeSHおよびビオチンの適切な比率が必要である。
実施例7−シグナルリザーバ中のシグナルナノ粒子の充填および熱応答性ポリマーフィルムの合成。
マクロポーラスシリコン基板をシグナルリザーバとして使用するために選択した。これらはp型シリコンウェーハの電気化学的エッチングによって製造される。図9は、マクロポーラスシリコン基板の走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示し、マイクロピラーのおおよその寸法が示される。これらの中空マイクロピラーは、約8μm3(r=0.5μm、h=10μm)の容積を有する。
マクロポーラスシリコン基板をシグナルリザーバとして使用するために選択した。これらはp型シリコンウェーハの電気化学的エッチングによって製造される。図9は、マクロポーラスシリコン基板の走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示し、マイクロピラーのおおよその寸法が示される。これらの中空マイクロピラーは、約8μm3(r=0.5μm、h=10μm)の容積を有する。
シグナルナノ粒子を上から基板のマイクロピラー中に装填してシグナルリザーバを形成した。図10は、様々な倍率でシグナルナノ粒子が充填されたリザーバ基板のSEM画像を示し、金のシグナルナノ粒子は白色の領域として観察される。
シリコン基板は酸化されて表面にSiO2を有する。したがって、正に帯電したポリマーで表面を包むことが可能である。ポリ(スチレンスルホネート)(PSS)とポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)の交互層から熱応答性フィルムを開発するために、層毎の手法を用いた。これらの高分子電解質は、静電的相互作用により自己集合し、補償されない電荷を生じる層間の反発のため、フィルム内の層の数が奇数である場合60℃を超えると膨潤して破壊することが知られている。
犠牲基板の除去によるマクロポーラスシリコン基板上へのフィルムの層毎の転写の概略図を図11Aに示す。第一に、シリコン基板をフィルム1(PEI(PSS/PAH)10PSS)でコーティングし、一方でフィルム2(PEI(PSS/PDADMAC)12)をポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)の犠牲基板上に形成した。次いで、両フィルムを静電的相互作用および圧力によって付着させた。最後に、犠牲基板を、有機溶媒(CH2Cl2)による溶解または機械的に剥離することのいずれかによって除去した。
図11Bは、フィルム1の堆積、フィルム2の付着、およびPMMA基板の除去の3つのステップ中に取得されたSEM画像を示す。このようにして製造されるフィルムは、単に、層の数および高分子電解質溶液のイオン強度などを制御することにより、異なる厚さで形成できる。これらの画像から測定したフィルムの厚さは約60〜100nmである。
実施例8−照射によるポリマー破壊の検証。
熱/光に対するフィルムの応答性を試験するために、マクロポーラスSi基板の空洞にシグナルナノ粒子を堆積させ、空洞を金ナノロッドでドープした(PSS/PDADMAC)12フィルムで覆った。
熱/光に対するフィルムの応答性を試験するために、マクロポーラスSi基板の空洞にシグナルナノ粒子を堆積させ、空洞を金ナノロッドでドープした(PSS/PDADMAC)12フィルムで覆った。
次いで、これを980nmレーザー(0.3w/cm2)で照射し、結果としてフィルムに穴が形成された。図12は、レーザー照射の前後の金ナノロッドをドープした(PSS/PDADMAC)12フィルムを示し、フィルム中の照射に誘発された破壊がはっきりと見られる。同様に、図13は、ポア内に蓄積されたシグナルナノ粒子および表面に熱応答性フィルム2を有するSi基板のSEM画像を示す。フィルムの破壊がレーザー照射後に見られる(DおよびE)。
実施例9−検出プローブおよびSNP識別
EGFR配列によるAuNPの機能化
この研究では、NSCLCに関連するEGFR変異に焦点を当てた。変異したアナライト標的を検出するために、直径63nmのAuNPを、対応するチオール末端−ssDNA(捕捉プローブ)で機能化した。2つのバッチのAuNPを調製し、以下の配列:
を含むMUTおよびWTの捕捉プローブで安定化した。
捕捉プローブの標的への親和性を増加させるために、我々は、MUT捕捉プローブの3つの塩基に2’−OMe修飾を導入した。WTおよびMUTのいずれかの捕捉プローブで安定化されたAuNPは、緩衝溶液中で長期間にわたってコロイド的に安定である(結果は示されていない)。
EGFR配列によるAuNPの機能化
この研究では、NSCLCに関連するEGFR変異に焦点を当てた。変異したアナライト標的を検出するために、直径63nmのAuNPを、対応するチオール末端−ssDNA(捕捉プローブ)で機能化した。2つのバッチのAuNPを調製し、以下の配列:
捕捉プローブの標的への親和性を増加させるために、我々は、MUT捕捉プローブの3つの塩基に2’−OMe修飾を導入した。WTおよびMUTのいずれかの捕捉プローブで安定化されたAuNPは、緩衝溶液中で長期間にわたってコロイド的に安定である(結果は示されていない)。
感度と選択性の研究−23塩基アナライト
23塩基の長さのアナライト配列をアッセイに使用した:
感度および選択性のアッセイを、マッチおよびミスマッチを用いて一塩基変異に対して実施した。2つのタイプのNPを、UVマイクロキュベット中の追加の0.2MのNaClを含むPBS中で混合した。全ての実験において[Au0]の濃度は0.1mMであった。次いで、アナライトのアリコートを溶液に添加した。UV−Vis分光法により粒子の凝集を追跡した。凝集度は、620nmと538nmにおける吸光度の比として計算した。アナライト配列の濃度範囲は50〜0.05nMであった。
23塩基の長さのアナライト配列をアッセイに使用した:
マッチおよびミスマッチを50pMまで検出できたが、マッチおよびミスマッチの選択性は観察されなかった。UV−Visの結果を確認するために、動的光散乱測定もまた、凝集体のサイズを知るために実施した。
最初のNPのサイズは、AuNP@MUTおよびAuNP@WTのそれぞれについて86.3nmおよび72.9nmであった。凝集の30分後に、凝集体のサイズは、マッチおよびミスマッチの配列について、およそ250nmであった。
感度と選択性の研究−70塩基と140塩基のアナライト
上記の研究と並行して、70塩基のDNAの長い配列の検出に対するアッセイ性能を調べた。
上記の研究と並行して、70塩基のDNAの長い配列の検出に対するアッセイ性能を調べた。
標準的な方法
AuNPs@WTおよびAuNPs@MUTを、PBSおよびNaClを含むUVマイクロキュベット中で混合した。最後に、2.5μLの[アナライト]=1μM溶液を混合物に添加して、5nMの濃度にした。UV−Vis分光法によりハイブリダイゼーションプロセスを追跡した。
AuNPs@WTおよびAuNPs@MUTを、PBSおよびNaClを含むUVマイクロキュベット中で混合した。最後に、2.5μLの[アナライト]=1μM溶液を混合物に添加して、5nMの濃度にした。UV−Vis分光法によりハイブリダイゼーションプロセスを追跡した。
このアッセイは、長い配列を検出できない。我々は、ハイブリダイゼーションプロセスが、マッチおよびミスマッチの配列の二次構造のために阻害されると推測する。
プレインキュベーション法
マッチおよびミスマッチの二次構造が粒子凝集を阻害するかどうかを調べるために、我々は次に、ナノ粒子の第2のバッチの添加前にDNA−AuNPプローブとの長い配列のハイブリダイゼーションを促進するようにアッセイを再設計した。その際、70塩基アナライトを、振盪しながらエッペンドルフ中で1種類のAuNPプローブとプレインキュベート(5nM)した。インキュベーションの1時間後に、他のタイプのAuNPを添加し、再びローラーミキサー上に放置した。ハイブリダイゼーションプロセスをUV−Vis分光法によって調べた。混合条件での粒子の安定性を確認するために、アナライトを含まない対照実験を行った。3時間のインキュベーションの後で、マッチ、ミスマッチおよび対照実験の間で色の差異が裸眼ではっきりと見られた。
マッチおよびミスマッチの二次構造が粒子凝集を阻害するかどうかを調べるために、我々は次に、ナノ粒子の第2のバッチの添加前にDNA−AuNPプローブとの長い配列のハイブリダイゼーションを促進するようにアッセイを再設計した。その際、70塩基アナライトを、振盪しながらエッペンドルフ中で1種類のAuNPプローブとプレインキュベート(5nM)した。インキュベーションの1時間後に、他のタイプのAuNPを添加し、再びローラーミキサー上に放置した。ハイブリダイゼーションプロセスをUV−Vis分光法によって調べた。混合条件での粒子の安定性を確認するために、アナライトを含まない対照実験を行った。3時間のインキュベーションの後で、マッチ、ミスマッチおよび対照実験の間で色の差異が裸眼ではっきりと見られた。
UV−Visによる観察をさらに確認するために、ハイブリダイゼーションプロセス中の凝集体のサイズを評価するためのDLS測定を行った。
異なる実験ステップでの凝集体の平均直径を決定した。凝集体のサイズは、マッチ配列が存在する場合にのみ経時的に増加することが見出された。しかし、ミスマッチについては、3時間においてのみわずかな増加が見られ、そして対照実験では、粒子が実験時間全体にわたって安定なままであることが観察された。
プレインキュベーション法を用いて低濃度(0.1nM)の70塩基アナライトを検出することが可能かどうかを、さらに調べた。検出は確かに可能であり、マッチとミスマッチとの選択性ははっきりしていた。しかし、アナライトの濃度を下げると、検出時間が長くなった。
次のステップは、さらに長いDNA配列を検出することであった。プレインキュベーション法を用いて、140塩基のアナライト配列で実験を行った。アナライトの濃度は5nMであった。
我々は、インキュベーションの2時間後に、マッチとミスマッチの配列の間に明確な差異があることを観察した。マッチの存在下では、NPは完全に凝集し、ミスマッチの存在下でNPは安定なままである。
dsDNA23塩基の検出−熱変性
dsDNAの熱変性およびssDNAの検出を調べた。熱処理の前に、アナライトとしてdsDNAを用いてキネティクス研究を行った。凝集度のわずかな増加が観察された。次に、恒温槽中で、溶液を5分間70℃で加熱した。その後、ハイブリダイゼーションプロセスをUV−Visによって記録し、凝集度を計算した。
dsDNAの熱変性およびssDNAの検出を調べた。熱処理の前に、アナライトとしてdsDNAを用いてキネティクス研究を行った。凝集度のわずかな増加が観察された。次に、恒温槽中で、溶液を5分間70℃で加熱した。その後、ハイブリダイゼーションプロセスをUV−Visによって記録し、凝集度を計算した。
熱変性後に凝集度は増加するが、ssDNA検出の場合ほど高くはない。DNA再ハイブリッド形成プロセスは、捕捉プローブとのハイブリダイゼーションと競合することが見出された。
dsDNA23塩基の検出−ブロッキングプローブ
ssDNA配列の1つが変異を有するdsDNA中の一塩基変異を検出するために、さらなる研究を行った。したがって、PCRの概念に従うことにより、dsDNAを脱ハイブリダイズさせ、次いで、変異のないssDNA(アンチセンスアンチセンス)に相補的な短いssDNA配列(ブロッキングプローブ)を使用することにより、再生を阻害することが必要である。このシナリオでは、ブロッキングプローブ配列はまた、ナノ粒子の表面に固定された捕捉プローブ(WTおよびMUT)に相補的であることに留意されたい。BP1およびBP2と呼ぶ、以下のブロッキングプローブ配列:
BP1:5’GCG GGC CAA AC−3’(配列番号14)
BP2:5’CAC AGA TTT TGG−3’(配列番号15)
を選択した。
ssDNA配列の1つが変異を有するdsDNA中の一塩基変異を検出するために、さらなる研究を行った。したがって、PCRの概念に従うことにより、dsDNAを脱ハイブリダイズさせ、次いで、変異のないssDNA(アンチセンスアンチセンス)に相補的な短いssDNA配列(ブロッキングプローブ)を使用することにより、再生を阻害することが必要である。このシナリオでは、ブロッキングプローブ配列はまた、ナノ粒子の表面に固定された捕捉プローブ(WTおよびMUT)に相補的であることに留意されたい。BP1およびBP2と呼ぶ、以下のブロッキングプローブ配列:
BP1:5’GCG GGC CAA AC−3’(配列番号14)
BP2:5’CAC AGA TTT TGG−3’(配列番号15)
を選択した。
最初に、AuNPsがdsDNA(アナライト==アンチ−アナライト)の存在下で安定なままであり、かつssDNA(アナライト−マッチまたはミスマッチ)の存在下で凝集することを確認した。次いで、ブロッキングプローブ配列がdsDNA(アナライト==アンチ−アナライト)の形成を阻害する能力を試験した。アンチ−アナライト配列を、BP1またはBP2のいずれか一方と、ならびにその両方の混合物とともにインキュベートした。次いで、アンチ−アナライトに相補的なアナライト配列を添加した。インキュベーションの15分後に、AuNPs@WTおよびAuNPs@MUTを添加し、ハイブリダイゼーションキネティクスをUV−Visにより追跡した。ブロッキングプローブ、アンチ−アナライトおよびアナライトの濃度は5nMであった。
我々は、アナライトによるブロッキングプローブの置換および、が、次に粒子凝集を阻害するであろうdsDNAの形成を観察することを期待した。しかし、結果はそうではないことを示している。BP1とBP2の混合物はアンチ−アナライトを効率的にブロックでき、アナライトにAuNPs@WTとAuNPs@MUTを凝集させる。興味深いことに、BP2は、マッチとミスマッチの両方について、BP1よりも効率的にアンチ−アナライトをブロックする。
結果は、ブロッキングプローブがアンチ−アナライトに強く結合し、その後のアナライトの添加はブロッキングプローブを置換しないことを示した。ブロッキングプローブおよびアナライトを含む混合物に添加されたアンチ−アナライトが短いブロッキングプローブまたは長いアナライトにより速く結合するかどうかを調べるために、5nMのブロッキングプローブ、アンチ−アナライトおよびアナライトの濃度で、マッチおよびミスマッチの配列について実験を実施した。
この競合的方法で実験を行ったところ、マッチとミスマッチの間でわずかな凝集度の差が観察された。最良のブロッキング戦略は、短いオリゴヌクレオチドの使用であることが判明した。BP2のブロッキング能はBP1より良好であることが判明した。
次に、温度が低下するときにブロッキングプローブがdsDNAの形成を阻害できるかどうかを調べるために、熱処理を伴うdsDNAへのブロッキングプローブの添加を調べた。我々は、まず、アナライト(マッチおよびミスマッチ)とアンチ−アナライトを混合してdsDNAを形成した。次いで、ブロッキングプローブをPBS/NaCl中に添加した。この溶液を恒温槽内で65℃に加熱した。加熱10分後に、この溶液をAuNPと混合し、UV−Vis記録を実施した。我々は、BPの存在下および非存在下での粒子の凝集が、マッチおよびミスマッチ配列について非常に類似していることを観察した。
ブロッキングプローブの滴定
上述のように、ブロッキングプローブはdsDNAの形成をブロックし、変異の検出を容易にすることができる。この観察の後、ブロッキングプローブが高濃度でさらに良好に機能するかもしれないと推察できる。しかしながら、我々はブロッキングプローブがアナライト配列の非存在下で金ナノ粒子の凝集を誘導することを観察した。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、ナノ粒子の表面上の捕捉プローブに結合した場合、ブロッキングプローブはナノ粒子間の静電/立体反発力を低下させ、それによって非特異的凝集を促進すると考えている。ナノ粒子(WRまたはMUT)の表面上のオリゴヌクレオチドの濃度は20nMであり、これはナノ粒子あたり1500ssDNAに相当すると推定される。したがって、捕捉プローブの濃度を下回る、その全濃度でのおよびそれを上回るBP濃度を調べるために、ブロッキングプローブの濃度範囲を1〜100nMに及ぶように選択した。
上述のように、ブロッキングプローブはdsDNAの形成をブロックし、変異の検出を容易にすることができる。この観察の後、ブロッキングプローブが高濃度でさらに良好に機能するかもしれないと推察できる。しかしながら、我々はブロッキングプローブがアナライト配列の非存在下で金ナノ粒子の凝集を誘導することを観察した。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、ナノ粒子の表面上の捕捉プローブに結合した場合、ブロッキングプローブはナノ粒子間の静電/立体反発力を低下させ、それによって非特異的凝集を促進すると考えている。ナノ粒子(WRまたはMUT)の表面上のオリゴヌクレオチドの濃度は20nMであり、これはナノ粒子あたり1500ssDNAに相当すると推定される。したがって、捕捉プローブの濃度を下回る、その全濃度でのおよびそれを上回るBP濃度を調べるために、ブロッキングプローブの濃度範囲を1〜100nMに及ぶように選択した。
我々は、ブロッキングプローブの濃度を増加に伴い、ナノ粒子のコロイド安定性が減少することを観察した。興味深いことに、20nMのブロッキングプローブで、粒子表面上の捕捉プローブの全濃度に対応する変曲点を観察した。ブロッキングプローブのさらに高い濃度では、非特異的凝集が支配的である。したがって、これらの条件下では、5nMまでのブロッキングプローブの濃度が最適であると選択された。
ブロッキングプローブによって誘発される選択性
最後に、一塩基変異に対するアッセイの選択性に対するブロッキングプローブの濃度の影響を調べた。捕捉プローブでコーティングしたAuNPを、0.5〜5nMの濃度範囲でブロッキングプローブ配列とハイブリダイズさせた。
最後に、一塩基変異に対するアッセイの選択性に対するブロッキングプローブの濃度の影響を調べた。捕捉プローブでコーティングしたAuNPを、0.5〜5nMの濃度範囲でブロッキングプローブ配列とハイブリダイズさせた。
ブロッキングプローブの存在は、一塩基変異検出に対するアッセイの選択性を改善する。我々は、3nMまでのBP濃度の増加により選択性は改善するが、BPのさらなる増加はより乏しい特異性をもたらすことを観察した。3nMの最適濃度は、捕捉プローブ当たり〜6のブロッキングプローブに対応する。本発明によると、ブロッキングプローブが使用される場合、捕捉プローブに対するブロッキングプローブの比は、場合によっては2〜10の範囲、例えば約5〜7、特に約6であり得る。
実施例10−さらなる標的およびプローブ配列
変異BRAFの検出のための例示的なプローブが、実施例1に記載される。本発明に従って標的アナライトとしての機能を果たし得る遺伝子配列のさらなる例は、がん関連遺伝子EGFR(NCBI Gene ID:1956)およびBRCA1(NCBI Gene ID :672)を含む。特に、プローブは、EGFR変異体L858RまたはT790Mの検出用であり得る。EGFRのL858Rの検出プローブの例を以下に示す(配列番号16〜22)。
変異BRAFの検出のための例示的なプローブが、実施例1に記載される。本発明に従って標的アナライトとしての機能を果たし得る遺伝子配列のさらなる例は、がん関連遺伝子EGFR(NCBI Gene ID:1956)およびBRCA1(NCBI Gene ID :672)を含む。特に、プローブは、EGFR変異体L858RまたはT790Mの検出用であり得る。EGFRのL858Rの検出プローブの例を以下に示す(配列番号16〜22)。
図14に示すように、70塩基および140塩基EGFRプローブの両方は、1時間以内に変異−アナライト特異的ナノ粒子凝集(Abs620/Abs538比によって評価した)を達成できた。これは、その長さのDNA配列が、血漿DNA(例えば、循環腫瘍DNA)の150〜165ヌクレオチド平均長(Underhillら、PLoS Genet.、2016年、12(7):e1006162;その内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる)を反映するため、実用上の利点のさらなる実証を提供する。さらに、観察されたアナライト特異的凝集は、熱誘導変性によって二本鎖DNA試料を検出する実現可能性を実証する(図15参照)。
ある場合には、検出プローブは、Sanroman−Iglesiasら、ACS Sens.、2016年、Vol.1、pp.1110〜1116(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されるようなものであってよい。これらの検出プローブは、乳がんおよび卵巣がんの発症リスクの増加の重要な指標であるBRCA1遺伝子のSNPを検出する(配列番号23〜26)。
実施例11−試料調製ユニット(SPU)
SPUは、マイクロトレンチシステムによって血漿に分離される前に全血が充填される場所である。プローブ配列への効率的な結合のために、プラズマをナノ粒子プローブ(NPプローブ)と混合してから1本鎖(ss)DNAへと熱的に分離する。SPUは、試料ローディング装置、SIMBAS血漿精製システム、加熱要素、およびナノ粒子プローブリザーバの構成要素を含む。
SPUは、マイクロトレンチシステムによって血漿に分離される前に全血が充填される場所である。プローブ配列への効率的な結合のために、プラズマをナノ粒子プローブ(NPプローブ)と混合してから1本鎖(ss)DNAへと熱的に分離する。SPUは、試料ローディング装置、SIMBAS血漿精製システム、加熱要素、およびナノ粒子プローブリザーバの構成要素を含む。
試料ローディング装置
装置を作動させるために、患者は隆起したブリスター球の試料領域を親指または指で押し下げる。試料領域は、主装置デッキから1.6mm突出した中空ボア針を含み、これを押圧することで、糖尿病者がブドウ糖検査のために日常的に使用する穿刺装置と同様の方法で指を穿刺する。装置内のサンプル針を隠すことにより、患者に引き起こされる苦痛を最小限に抑え、偶発的な針刺し損傷を減らし、かつ医療従事者の汚染の懸念を減らすことができる。
装置を作動させるために、患者は隆起したブリスター球の試料領域を親指または指で押し下げる。試料領域は、主装置デッキから1.6mm突出した中空ボア針を含み、これを押圧することで、糖尿病者がブドウ糖検査のために日常的に使用する穿刺装置と同様の方法で指を穿刺する。装置内のサンプル針を隠すことにより、患者に引き起こされる苦痛を最小限に抑え、偶発的な針刺し損傷を減らし、かつ医療従事者の汚染の懸念を減らすことができる。
装置は負圧で詰め込まれ、生じる部分的な真空は、患者に著しい不快感を抱かせることなく、または血液試料それ自体を見ることなく、装置への血液の引き込みを容易にし200〜300μlの試料体積をもたらすのに役立つ。
SIMBAS血漿精製システム
血液試料はマイクロトレンチシステムに入り、そこで赤血球が除去されて、自己給電型の集積化マイクロ流体血液分析システム(SIMBAS)のシステムを用いて血漿を形成する(上記実施例3参照)。このシステムは、現在の膜に基づく血液分離技術よりも効率的で費用効果に優れている(図3参照)。
血液試料はマイクロトレンチシステムに入り、そこで赤血球が除去されて、自己給電型の集積化マイクロ流体血液分析システム(SIMBAS)のシステムを用いて血漿を形成する(上記実施例3参照)。このシステムは、現在の膜に基づく血液分離技術よりも効率的で費用効果に優れている(図3参照)。
加熱要素
DNAは二本鎖(dsDNA)であり、したがってプローブを結合するのにあまり効率的でないので、血漿を加熱する。熱はdsDNAを変性させて一本鎖(ss)DNAを形成するが、これはPCRと同じプロセスである。また、PCRに類似して、目的の変異配列を含むssDNAは、NPに結合した過剰の短い相補的配列特異的プローブに優先的に結合する。
DNAは二本鎖(dsDNA)であり、したがってプローブを結合するのにあまり効率的でないので、血漿を加熱する。熱はdsDNAを変性させて一本鎖(ss)DNAを形成するが、これはPCRと同じプロセスである。また、PCRに類似して、目的の変異配列を含むssDNAは、NPに結合した過剰の短い相補的配列特異的プローブに優先的に結合する。
加熱を、マイクロチャネル内に埋め込まれた単純な薄膜加熱要素を用いて行う。 薄膜発熱体は、バルク加熱よりもはるかに迅速かつ効率的であり(8℃s−1、例えば1〜3℃s−1)、ボタン電池により装置上で簡単に給電できる。
フラッシュ加熱は、DNA変性よりも遅いキネティクスを有するタンパク質変性の可能性を最小化するために使用されるが、いくらかのタンパク質変性が起こる可能性があり、その結果、血漿の粘度が上昇する。我々は、SIMBASモジュール後にマイクロ流体チャネルに吸収される可能性があるタンパク質吸収色素であるシバクロンブルーの存在下で、血漿を50%希釈することによって、この現象を大幅に克服できることを示した。我々は、シバクロンブルー処理が血漿からDNAを阻害または除去しないことを示した。
NPプローブリザーバ
得られた血漿(100〜150μl)はマイクロ流体チャネルに入り、そこで予め充填された金プローブナノ粒子と混合される。我々は、Biacore 3000マシン(図1参照)を用いる表面プラズモン共鳴研究(SPR)によって示されるように、一塩基変異型配列および野生型配列を区別する能力に関して、核酸プローブの配列設計を最適化した。
得られた血漿(100〜150μl)はマイクロ流体チャネルに入り、そこで予め充填された金プローブナノ粒子と混合される。我々は、Biacore 3000マシン(図1参照)を用いる表面プラズモン共鳴研究(SPR)によって示されるように、一塩基変異型配列および野生型配列を区別する能力に関して、核酸プローブの配列設計を最適化した。
DNAプローブは、チオール結合を介して金NPに結合され、金表面へのプローブの非特異的結合を避けるためにC18スペーサー分子を含む。各NPプローブは200〜300のプローブを含む。
2つの異なるタイプのプローブ配列(およびNPプローブ)が存在し、一方は正常(または野生型)配列に相補的であり、他方は検出される変異を含む下流(または上流)配列に相補的である(図6C)。患者ssDNA(アナライト)は、2つのプローブの間にブリッジを形成し、NPを一緒にして凝集体を形成する。NP間の距離は、プローブの設計を変更することによって制御できる。
WT配列DNAも上流のプローブに結合できるが、それは変異プローブを結合できず、したがって凝集体を形成しない(図6Aおよび6Bの比較)。我々は、このシステムがWTと一塩基変異とを10.8fmolの濃度まで区別する能力を実証した(Sanroman−Iglesiasら、ACS Sens.、2016年、Vol.1、pp.1110〜1116を参照できる)。
アナライトに誘発されるナノ粒子−プローブ凝集をさらに最適化するために、血漿タンパク質によって誘発される凝集阻止を緩和するための防汚剤溶液を使用してもよい。全血および/または血漿由来のタンパク質は検出ナノ粒子をコーティングし得、これによりナノ粒子プローブへのアナライトの結合およびその後の凝集を阻害する傾向がある。防汚剤溶液の一例はOptodex(登録商標)である。OptoDex(登録商標)プラットフォームはCentre Suisse d’Electronique et de Microtechnique(CSEM)によって開発された表面工学技術であり、材料科学、表面化学、および生化学の技術を統合し、そして新規材料、ならびに生体分子付着および表面不動態化について制御可能であり十分に特徴付けられた表面化学を含む。
実施例12−シグナル増幅領域
上記の実施例7および8に記載される、マイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出に基づくシグナル増幅の代わりに、本発明者らは、熱応答性マイクロスフェアに基づくシグナルリザーバを用いることにより、シグナル放出の効率を大幅に高めることを追求した。特に、マイクロスフェアの使用は、マイクロポア開口部を覆う熱応答性フィルムの破壊後のマイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出の問題を解決する。本発明者らは、特定の条件下で、マイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出が、マイクロポア中に充填された合計の5%未満であることを見出した。対照的に、マイクロスフェアシェルの熱に誘発される破壊に続く熱応答性マイクロスフェアからのシグナル手段の放出は、マイクロスフェア中に充填された総量の>80%であると推定される。
上記の実施例7および8に記載される、マイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出に基づくシグナル増幅の代わりに、本発明者らは、熱応答性マイクロスフェアに基づくシグナルリザーバを用いることにより、シグナル放出の効率を大幅に高めることを追求した。特に、マイクロスフェアの使用は、マイクロポア開口部を覆う熱応答性フィルムの破壊後のマイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出の問題を解決する。本発明者らは、特定の条件下で、マイクロポアからのシグナルナノ粒子の放出が、マイクロポア中に充填された合計の5%未満であることを見出した。対照的に、マイクロスフェアシェルの熱に誘発される破壊に続く熱応答性マイクロスフェアからのシグナル手段の放出は、マイクロスフェア中に充填された総量の>80%であると推定される。
シグナルナノ粒子を充填したアルギン酸塩/アガロースビーズは、高分子電解質、特にPHH/PSS二重層に基づくマイクロスフェアよりも著しく漏出しやすいことが判明した。したがって、後者が、シグナル手段用のシグナルリザーバのための最適な選択として選択された。
シグナル増幅ゾーンの概略図を図16に示す。検出ナノ粒子の凝集体は、増幅ゾーン中の熱応答性マイクロスフェア(図16の左側に示す)に遭遇するまで、装置内のマイクロチャネルに沿って流れる。
熱応答性マイクロスフェア(〜10μm直径)は、マイクロ流体チャネルの保持チャンバ(図16の右側に示されているシリカビーズ)中ではるかに大きなシリカビーズ(〜100μm直径)に隣接して詰め込まれる。クロマトグラフィーに見られるのと同様のこの配置は、流れが妨害なく装置を通じて続く一方で、無傷で維持される熱応答性マイクロスフェアに検出ナノ粒子凝集体を近接させることを確実にする。
凝集体は、共振波長(すなわち、633nm)で光を送達するオンデバイスの赤色レーザーダイオードによってエネルギー供給される。レーザーダイオード(市販の1mW)は、薄膜ヒーターと同一のボタン電池で給電される。
凝集した金ナノ粒子による633nmでのレーザー光の吸収は、プラズモン共鳴のような局所的なエネルギー放出をもたらす。これらのナノヒーターは、40〜50℃を超えて温度を十分に上げることができ、熱応答性マイクロスフェアの破壊を引き起こす。
浮遊するプローブナノ粒子も光を吸収できるが、このエネルギーは凝集したナノ粒子に吸収されるエネルギーの1%未満である。マイクロ流体デバイスのプラスチックまたは血漿そのものまたはHbやHbO2の吸収極大がそれぞれ434nmと414nmである混入した血液など他の成分による吸収はほとんどない。
熱応答性マイクロスフェアは、〜109分子のシグナル分子(例えば、ストレプトアビジン)をカプセル化するミセル共沈CaCO3を使用する5×二重層PSS/PAHから構成される。この配置は、シグナルの大規模な増幅をもたらす。
破壊されたマイクロスフェア(および非凝集プローブ−NP)によって放出されたシグナル分子は、シリカビーズを通って試験シグナルゾーンに向かって移動する。
試験されたシグナル負荷マイクロスフェアの例は、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)が充填されたPSS/PAH二重層マイクロカプセルおよびデキストラン−FITCが充填されたPSS/PAH二重層マイクロカプセルを含む。シグナル充填のレーザーに誘発される放出が実証された(結果は示されていない)。さらに、マイクロカプセルの表面における凝集ナノ粒子の存在が、電子顕微鏡によって可視化された。
マイクロカプセル製造およびマイクロチャネル中の充填
熱応答性マイクロスフェアを、本質的に、Ambrosoneら、ACS Nano、2016年、Vol.10(4)、pp.4828〜4834(補足資料S2参照)に記載されているように製造し、このすべての内容は参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
熱応答性マイクロスフェアを、本質的に、Ambrosoneら、ACS Nano、2016年、Vol.10(4)、pp.4828〜4834(補足資料S2参照)に記載されているように製造し、このすべての内容は参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
ポリ(ナトリウム4−スチレンスルホネート)(PSS、Mw≒70kDa、#243051)、ポリ(アリルアミンヒドロクロリド)(PAH、Mw≒56kDa、#283223)、塩化カルシウム二水和物(CaCl2、#223506)、炭酸ナトリウム(Na2CO3、#S7795)、およびポリ(スチレン)−ブロック−ポリ(アクリル酸)(PSS−b−PAA、Mn≒8700、#735892)をSigma−Aldrichから購入した。
シグナル手段として、PSS/PAH CaCO3マイクロスフェア(直径5〜10μm)にHRP、デキストラン−FITCまたはストレプトアビジンを充填した。多層ポリ電解質シェル(例えば、PSSおよびPAHの5〜8交互層)は、最外層に正または負の電荷を提供できる。
保持チャンバの設計
マイクロ流体保持チャンバは、装置を通じた流れを保持しながら、全ての構成要素(すなわち凝集体およびマイクロスフェア)をいかに一緒にするかという問題に対処する。保持チャンバは、より大きなシリカ/ガラスビーズ(〜50〜100μm)で充填されたマイクロチャネルを含み、これらは次いで無傷のマイクロスフェア(〜5〜10μm)を保持し、流れは凝集体をマイクロスフェアにもたらし、一方で浮遊のNPを、破壊されたマイクロスフェアから放出されたシグナル分子と一緒に装置を通じて流れ続けさせる。
マイクロ流体保持チャンバは、装置を通じた流れを保持しながら、全ての構成要素(すなわち凝集体およびマイクロスフェア)をいかに一緒にするかという問題に対処する。保持チャンバは、より大きなシリカ/ガラスビーズ(〜50〜100μm)で充填されたマイクロチャネルを含み、これらは次いで無傷のマイクロスフェア(〜5〜10μm)を保持し、流れは凝集体をマイクロスフェアにもたらし、一方で浮遊のNPを、破壊されたマイクロスフェアから放出されたシグナル分子と一緒に装置を通じて流れ続けさせる。
環状オレフィンポリマー(COP)チャネルにおけるマイクロスフェアパッキングを調べた。直径75μmのガラスビーズを使用してマイクロチャネルをブロックし、それによってマイクロスフェア(5〜10μm)を所定の位置に保持した(図18A参照)。負の最外層で終結する8層マイクロスフェアを使用して、マイクロスフェアは少なくとも3ヶ月間安定であり(デキストランFITCシグナルを漏出せず)、定位置に保持された。COPチャネルを詰まらせるための別の溶液も試験した:直径150μmのアガロースビーズ。
マイクロスフェアからのデキストラン−FITCシグナル手段のレーザーに誘発される放出を、図18Bに示す。
実施例13−試験シグナルゾーン
シグナルリザーバ(例えば、マイクロスフェア)からシグナル手段が放出された後、シグナル手段は試験シグナルゾーン(例えばニトロセルロースストリップ)に流れ、ここでシグナル手段は特異的結合相互作用によって保持ストリップ上に捕捉され、目に見える線を生じる。試験シグナルゾーンは、市販のラテラルフロー試験キット(例えば、妊娠試験キット)で使用されるような標準の構成要素を使用できる。一例において、シグナル手段はストレプトアビジンを含み、保持ストリップはビオチンを含み得る。
シグナルリザーバ(例えば、マイクロスフェア)からシグナル手段が放出された後、シグナル手段は試験シグナルゾーン(例えばニトロセルロースストリップ)に流れ、ここでシグナル手段は特異的結合相互作用によって保持ストリップ上に捕捉され、目に見える線を生じる。試験シグナルゾーンは、市販のラテラルフロー試験キット(例えば、妊娠試験キット)で使用されるような標準の構成要素を使用できる。一例において、シグナル手段はストレプトアビジンを含み、保持ストリップはビオチンを含み得る。
実施例14−集積化装置および診断アプリケーション
いくつかの実施形態では、本発明は、別個であるが機能的に接続される以下のモジュールを含む集積化装置を提供する。
1.試料調製ユニット(SPU)。全血はSPU上に充填され、そこでマイクロトレンチシステムによって血漿に分離される。血漿は、プローブ配列への効率的な結合のために1本鎖(ss)DNAに熱的に分離される前にナノ粒子プローブ(NPプローブ)と混合される。
2.増幅ゾーン。2つの相補的架橋DNAプローブへの変異ssDNA配列の特異的結合は、それらの特異的凝集をもたらす。凝集はNPをお互いに接近させ、レーザーダイオードによってエネルギー供給されるとプラズモン共鳴を生じ光エネルギーを局部的な熱エネルギーに変換する。この熱エネルギーは、シグナルの大規模な増幅に対応する数千万のシグナル分子をカプセル化する熱応答性マイクロスフェアを破壊する。
3.試験シグナル。放出されたシグナル分子は、試験ストリップによって捕捉されるまでニトロセルロースストリップに沿って移動し、目に見える線を生じる。
いくつかの実施形態では、本発明は、別個であるが機能的に接続される以下のモジュールを含む集積化装置を提供する。
1.試料調製ユニット(SPU)。全血はSPU上に充填され、そこでマイクロトレンチシステムによって血漿に分離される。血漿は、プローブ配列への効率的な結合のために1本鎖(ss)DNAに熱的に分離される前にナノ粒子プローブ(NPプローブ)と混合される。
2.増幅ゾーン。2つの相補的架橋DNAプローブへの変異ssDNA配列の特異的結合は、それらの特異的凝集をもたらす。凝集はNPをお互いに接近させ、レーザーダイオードによってエネルギー供給されるとプラズモン共鳴を生じ光エネルギーを局部的な熱エネルギーに変換する。この熱エネルギーは、シグナルの大規模な増幅に対応する数千万のシグナル分子をカプセル化する熱応答性マイクロスフェアを破壊する。
3.試験シグナル。放出されたシグナル分子は、試験ストリップによって捕捉されるまでニトロセルロースストリップに沿って移動し、目に見える線を生じる。
集積化装置の概略図が図19に示される。装置はハイブリッドマイクロ流体ラテラルフローデバイスであり、SPUと増幅ゾーンからなるマイクロ流体セクションは、負圧下で充填されたデバイスの結果として特別に設計されたマイクロポンプを介して、脱気の流れにより動力供給される。ラテラルフロー試験シグナル領域は、リザーバ装置を介してマイクロ流体セクションを出る液体の毛細管力によって動力を供給される。ボタン電池は、オンデバイスのレーザーダイオードと発熱要素に給電する。SPUは交換可能なNPプローブモジュールを含み、それは標準化された試験筐体内で異なるバイオマーカー配列を試験して製造コストを最小限に抑えることができる。
NSCLC患者におけるEGFR変異の検出は例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ブリガチニブおよびラパチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する患者らの応答の指標である。主要な変異は、EGFR変異NSCLC症例の90%もに存在するL858R変異、および症例の〜40%に存在するエクソン19欠損症である。両方の変異は、本発明の装置によって検出され得る。現在認可されているEGFR変異検査のためのコンパニオン診断技術はPCRベースであり、患者および臨床医の便宜のために最適ではない侵襲的に得られる生検に頼っている。
NSCLCの場合、最新のESMOガイドラインでは、TKIベースの治療への耐性の出現とその結果の第二選択療法(オシメルチニブ)への切り替えの指標としてT790M変異の出現のモニタリングを推奨している。NSCLC患者のための現在のフォローアップ手順は、病院の訪問およびCTスキャンなどの画像技術の使用を必要とする。本発明の装置は、ローカルヘルスケアセンターの設備で実現され得る、より簡単な代替案を提供する。
本明細書中に引用されたすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられ、各個々の刊行物または特許または特許出願が、その全体が参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、同じ目的に対し同じ程度に組み入れられる。
本明細書に記載の特定の実施形態は、限定ではなく例として提供される。本明細書中のいずれのサブタイトルも、便宜のためにのみ含まれており、決して開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
Claims (69)
- 試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための方法であって、
i)標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および前記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
ii)前記特異的プローブの前記標的アナライトへの結合に好適な条件下で前記検出ナノ粒子を試験試料と接触させる工程であって、標的アナライトに誘発される前記検出ナノ粒子の凝集がシグナルリザーバからの検出可能なシグナル手段の放出を可能にする工程と、
を含む方法。 - 前記検出可能なシグナル手段の放出が前記シグナルリザーバを封じる障壁の破壊を介する、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルリザーバが前記シグナル手段を含むコアと前記コアを包み込むシェルとを備える1つまたは複数のマイクロスフェアを含み、かつ前記シェルが前記障壁である、請求項2に記載の方法。
- 前記障壁が熱応答性ポリマー層でありかつ凝集した検出ナノ粒子が前記熱応答性ポリマー層の少なくとも部分的な熱破壊を引き起こすのに十分な熱伝達を導き、これによって前記検出可能なシグナル手段を放出する、請求項2または3に記載の方法。
- 前記熱伝達が電磁放射源による凝集した検出ナノ粒子の照射によって引き起こされる、請求項4に記載の方法。
- 前記電磁放射源が前記検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギー供給をするよう構成される、請求項5に記載の方法。
- 前記標的アナライトが核酸である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記熱応答性ポリマーがポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリ(アリルアミン)(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含む、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記凝集した検出ナノ粒子の照射が少なくとも20℃、40℃、または60℃の局所的な温度上昇を生じる、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記電磁放射源がレーザーダイオードまたは発光ダイオード(LED)である、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レーザーダイオードまたはLEDが600〜650nmの範囲または415〜425nmの範囲における波長でエネルギーを供給するよう構成される、請求項10に記載の方法。
- 検出ナノ粒子の凝集体が凝集に続いて障壁へ局在化する、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1および第2の検出ナノ粒子のそれぞれが前記第1および第2のプローブの両方を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出ナノ粒子が金属原子のコアを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出ナノ粒子のコアの直径が10〜100nmの範囲、任意選択で40〜70nmの範囲である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナル手段がストレプトアビジン、抗体、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ)、フルオロフォア、色素、1つまたは複数の量子ドット、1つまたは複数のラテックスビーズを含む、または複数のシグナルナノ粒子である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記マイクロスフェアの平均直径が1〜20μmの範囲、任意選択で5〜10μmである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記シェルの表面層が負に帯電されるか正に帯電される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記マイクロスフェアがマイクロスフェアよりも大きな直径を有する複数のパッキング粒子に隣接してかつ/または接触してマイクロチャネル中に提供される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記パッキング粒子が20〜200μmの範囲、任意選択で50〜150μmの範囲の平均直径を有するガラス、シリカまたはアガロースビーズを含む、請求項19に記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法であって、前記シグナルリザーバからの前記検出可能なシグナル手段の放出が、
(a)色シグナルとして観察されるおよび/または(b)裸眼で見ることができる、方法。 - 前記検出可能なシグナル手段が前記シグナルリザーバからの放出後に保持ストリップ上に検出のために捕捉される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出ナノ粒子プローブが前記標的核酸の第1および第2の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項7〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1および第2のプローブのオリゴヌクレオチドが15〜50塩基対離れた標的核酸の領域を結合する、請求項7〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸が野生型配列の変異体である配列を有し、かつ前記第1または第2のプローブが野生型配列よりも優先して変異配列に結合する、請求項7〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異配列が一塩基多型(SNP)を含みかつ前記第1または第2の検出ナノ粒子プローブが前記SNP位置を含む標的核酸の一部分にハイブリダイズする、請求項25に記載の方法。
- 前記変異配列ががんと関連した変異を有し、任意選択で前記変異が一塩基変異、欠失、挿入または配列転座からなる群より選択される、請求項25または26に記載の方法。
- 前記変異がNCBI Gene ID:1956のヒト上皮増殖因子受容体(EGFR);NCBI Gene ID:672のヒト早発型乳がん1(BRCA1);NCBI Gene ID:673のヒトBRAF遺伝子;およびNCBI Gene ID:3845のヒトKRASプロトオンコジーンからなる群より選択される遺伝子中にある、請求項27に記載の方法。
- 前記変異が:
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。 - 前記試験試料が血液または血漿を含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験試料を検出ナノ粒子と接触させる前に試験試料の熱変性の工程をさらに含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 複数のブロッキングプローブを提供する工程をさらに含み、前記ブロッキングプローブが標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる、請求項7〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法であって、
i)試験試料の熱変性の工程と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のオリゴヌクレオチドブロッキングプローブを提供しかつ標的核酸のアンチセンス鎖へのブロッキングプローブの結合に好適な条件下で試験試料と接触させ、それによって標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の再アニーリングを防止する工程と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび前記標的核酸のセンス鎖の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子を提供する工程と;
iv)前記標的核酸への前記特異的プローブの結合に好適な条件下で前記検出ナノ粒子を前記試験試料と接触させる工程であって、前記試験試料中の前記標的核酸の存在が前記検出ナノ粒子の凝集をもたらす工程と;
v)凝集状態にあるときに前記検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された電磁放射源で前記検出ナノ粒子を照射し、それによってシグナル手段を含む複数のマイクロスフェアの少なくとも部分的な熱破壊をもたらすのに十分な熱伝達を導く工程と;
vi)前記マイクロスフェアからの前記シグナル手段の放出またはその欠如を観察する工程であって、放出されたシグナルナノ粒子が裸眼で観察できる保持ストリップ上の検出のために捕捉される工程と、
を含む、方法。 - 試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための装置であって、
i)標的アナライトの第1の領域に特異的な第1のプローブで機能化された第1の検出ナノ粒子および前記標的アナライトの第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された第2の検出ナノ粒子を含む複数の検出ナノ粒子を含む、検出区画と、
ii)標的アナライトに誘発される前記検出ナノ粒子の凝集の後に選択的に破壊可能である障壁によってシグナルリザーバ中に含まれる検出可能なシグナル手段を含むシグナル増幅ゾーンと、
を含む、装置。 - 前記シグナル増幅ゾーンが前記検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成された組み込まれた電磁放射源をさらに含み、かつ前記隔壁が熱応答性ポリマー層を含む、請求項34に記載の装置。
- 前記シグナルリザーバが前記シグナル手段を含むコアと前記コアを包み込むシェルとを有する1つまたは複数のマイクロスフェアを含み、かつ前記シェルが前記障壁である、請求項35に記載の装置。
- 前記熱応答性ポリマーがポリ(スチレンスルホネート)(PSS)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(PDADMAC)、ポリ(アリルアミン)(PAH)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)およびポリビニルメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含む、請求項35または36に記載の装置。
- 前記電磁放射源がレーザーダイオードまたは発光ダイオード(LED)である、請求項34〜37のいずれか1項に記載の装置。
- 前記レーザーダイオードまたはLEDが600〜650nmの範囲におけるまたは415〜425nmの範囲における波長でエネルギーを供給するよう構成される、請求項38に記載の装置。
- 前記検出区画がOptodex(登録商標)で機能化されてナノ粒子凝集体とのタンパク質の干渉を低減する、請求項34〜39のいずれか1項に記載の装置。
- 前記第1および第2の検出ナノ粒子のそれぞれが前記第1および第2のプローブの両方を含む、請求項34〜40のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出ナノ粒子が金属原子のコアを含む、請求項34〜41のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出ナノ粒子のコアの直径が10〜100nmの範囲、任意選択で40〜70nmである、請求項42に記載の装置。
- 前記シグナル手段がストレプトアビジン、抗体、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ)、フルオロフォア、色素、1つまたは複数の量子ドット、1つまたは複数のラテックスビーズを含む、または複数のシグナルナノ粒子である、請求項34〜43のいずれか1項に記載の装置。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記マイクロスフェアの平均直径が1〜20μmの範囲、任意選択で5〜10μmである、請求項34〜44のいずれか1項に記載の装置。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記シェルの表面層が負に帯電されるか正に帯電される、請求項34〜45のいずれか1項に記載の装置。
- 前記シグナルリザーバが複数の前記マイクロスフェアを含み、かつ前記マイクロスフェアが前記シグナル増幅ゾーン中のマイクロチャネル中に位置しかつマイクロスフェアよりも大きな直径の複数のパッキング粒子に隣接してかつ/または接触している、請求項34〜46のいずれか1項に記載の装置。
- 前記マイクロスフェアと前記パッキング粒子を収容する前記マイクロチャネルがマイクロ流体保持チャンバを形成する、請求項47に記載の装置。
- 前記パッキング粒子が20〜200μmの範囲の、任意選択で50〜150μmの範囲の平均直径を有するガラス、シリカまたはアガロースビーズを含む、請求項47または48に記載の装置。
- 前記検出可能なシグナル手段を前記シグナルリザーバからのその放出後に捕捉する保持ストリップを含むシグナル表示領域をさらに含む、請求項34〜49のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出ナノ粒子プローブが前記標的核酸の第1および第1の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項34〜50のいずれか1項に記載の装置。
- 一方または両方のプローブのオリゴヌクレオチドがリンカーを介して検出ナノ粒子のコアに共有結合され、このリンカーが任意選択でスペーサーを含む、請求項51に記載の装置。
- 前記第1および第2のプローブのオリゴヌクレオチドが15〜50塩基対離れた標的核酸の領域を結合する、請求項51または52に記載の装置。
- それぞれの検出ナノ粒子が200〜300個のプローブ分子を有する、請求項51〜53のいずれか1項に記載の装置。
- 前記第1または第2のプローブオリゴヌクレオチドが野生型配列の変異体である標的核酸配列に相補的である、請求項51〜54のいずれか1項に記載の装置。
- 前記変異配列が一塩基多型(SNP)を含みかつ前記第1または第2のプローブオリゴヌクレオチドが前記SNP位置を含む標的核酸の一部分にハイブリダイズする、請求項55に記載の装置。
- 前記変異配列ががんと関連した変異を有し、任意選択で前記変異が一塩基変異、欠失、挿入または配列転座からなる群より選択される、請求項55または56に記載の装置。
- 前記変異がNCBI Gene ID:1956のヒト上皮増殖因子受容体(EGFR);NCBI Gene ID:672のヒト早発型乳がん1(BRCA1);NCBI Gene ID:673のヒトBRAF遺伝子;およびNCBI Gene ID:3845のヒトKRASプロトオンコジーンからなる群より選択される遺伝子中にある、請求項57に記載の装置。
- 前記変異が:
EGFR c.2573T>G(L858Rをコードする)変異;
EGFR c.2369C>T(T790Mをコードする)変異;
EGFRエクソン19欠失変異、および
結腸直腸がんに関連するKRAS変異、
からなる群より選択される、請求項58に記載の装置。 - 前記装置が前記検出区画と連通して試料注入口をさらに含む、請求項34〜59のいずれか1項に記載の装置。
- 前記装置が前記試料注入口と検出区画の間に配置される溶解区画をさらに含み、前記溶解区画が加熱要素を含む、請求項60に記載の装置。
- 前記試料注入口が血液分離手段を含む、請求項60または61に記載の装置。
- 前記試料注入口および/または溶解区画がシバクロンブルーを含む、請求項60〜62のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出区画が標的核酸のアンチセンス鎖に特異的な複数のブロッキングプローブをさらに含む、請求項34〜63のいずれか1項に記載の装置。
- 2つまたはそれより多い試験試料中の標的アナライトの存在または非存在を検出するための装置であって、同一装置上の並行する経路中に請求項34〜64のいずれか1項に記載の装置の構成要素を含む、装置。
- 試験試料中の標的核酸の存在または非存在を検出するための装置であって、
i)試料注入口と;
ii)前記試料注入口と連通する溶解区画であって、加熱要素を含む溶解区画と;
iii)標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブと前記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子と任意選択で標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できる過剰のブロッキングプローブとを有する検出区画と;
iv)凝集状態の検出ナノ粒子の共鳴波長でエネルギーを提供するように構成される組み込まれた電磁放射源と;
v)シグナル手段を含むコアとこのコアを包み込むシェルとを有する複数の熱応答性マイクロスフェアであって、前記シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
vi)前記検出区画と連通するシグナル表示領域であって、熱応答性マイクロスフェアからの放出後のシグナル手段を捕捉するための保持ストリップを含むシグナル表示領域と、
を含む装置。 - 哺乳動物の対象の診断または予後の方法における請求項34〜66に記載の装置の使用であって、前記試験試料が前記対象から得られた生物学的試料である、使用。
- 細菌、寄生生物、または他の生物学的混入物質の検出方法における請求項34〜66に記載の装置の使用であって、前記試験試料が環境的試料である、使用。
- i)試料注入口と;
加熱要素を含む溶解区画と;
組み込まれた電磁放射源と;
シグナル手段を含むコアとこのコアを包み込むシェルとを有する複数の熱応答性マイクロスフェアであって、シェルが熱応答性ポリマーを含む複数の熱応答性マイクロスフェアと;
マイクロスフェアからの放出後のシグナル手段を捕捉する保持ストリップを含むシグナル表示領域と;
を有する装置と;
任意選択で、ii)標的核酸のアンチセンス鎖に特異的に結合できるブロッキングプローブの1つまたは複数の集団と;
iii)前記標的核酸のセンス鎖の第1の領域に特異的な第1のプローブおよび前記標的核酸の第2の領域に特異的な第2のプローブで機能化された複数の検出ナノ粒子の1つまたは複数の集団と;
を含むキット。
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