JP2022516442A - 増幅産物を検出するための方法および組成物 - Google Patents

増幅産物を検出するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供するシステム、装置、キットおよび方法の実施形態のいくつかは、標的核酸の増幅および検出に関する。これらの実施形態のいくつかは、水性反応混合物および油を含む液滴と検出ユニットとを含む。いくつかの実施形態は、前記液滴を輸送するように構成された流路または導管を含む。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットは、電場発生ユニットおよび電気検知素子を含む。

Description

関連出願
本出願は、2018年12月20日に出願された「増幅産物を検出するための方法および組成物」という名称の米国仮特許出願第62/783051号の優先権を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、ALVEO023WOSEQLISTINGのファイル名で2019年12月7日に作成された約3kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書で提供するシステム、装置、キットおよび方法の実施形態のいくつかは、標的核酸の増幅および検出に関する。これらの実施形態のいくつかは、水性反応混合物および油を含む液滴と検出ユニットとを含む。
特定のゲノム物質（DNAまたはRNA）を検出することにより、試料中に存在する病原体を同定できる可能性がある。病原体の検出の域を越えて、がんを早期に発見したり、出生前の重大な情報を得たり、患者の微生物叢についての理解を深めたりするための分子を含む、数多くのその他のバイオマーカーを試験に利用することもできる。従来の核酸増幅検査（「NAT」）では、試料中に存在するゲノム物質はまず、試料中に存在するDNAが十分に測定可能な量になるまで、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）として知られている分子増幅方法を使用して、指数関数的に複製されることがある。多くのウイルスのゲノム物質であるRNAの場合には、PCRによる増幅に先立ってまずRNAをDNAに転写するための別の工程が含まれることもある。
いくつかの実施形態は、鋳型核酸の増幅産物の検出用システムであって、
液滴形成ユニットと温度制御ユニットと検出ユニットとを含み、
前記液滴形成ユニットが、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を含む試料リザーバーと、
油および界面活性剤（非イオン界面活性剤など）を含む油相リザーバーと、
前記試料リザーバーおよび前記油相リザーバーと流体連通しており、かつ前記油と前記水性反応混合物を混合することにより、該水性反応混合物と該油を含む液滴を形成するように構成されている混合チャンバーと
を含み、
前記温度制御ユニットが、加熱ユニットを含み、かつ所望の温度で所望の時間にわたり前記液滴を加熱するように構成されており、
前記検出ユニットが、
前記液滴を輸送するように構成されており、かつ前記混合チャンバーと流体連通している流路または導管と、
前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
を含み、
前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される、
システムを含む。
いくつかの実施形態において、前記混合チャンバーに前記温度制御ユニットが含まれており、該混合チャンバーにより前記油と前記水性反応混合物が混合されると同時に、または該混合チャンバーにより前記油と前記水性反応混合物が混合された後に、前記温度制御ユニットが、前記液滴を所望の温度に加熱するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記混合チャンバーは、前記加熱ユニットと分離されている。いくつかの実施形態において、前記混合チャンバーは、振盪または攪拌により前記液滴を形成または維持する。
いくつかの実施形態において、前記液滴形成ユニットは、前記試料リザーバーから前記水性反応混合物を押し出すように構成されているポンプ、または前記油相リザーバーから前記油を押し出すように構成されているポンプを含む。いくつかの実施形態において、前記ポンプは、シリンジポンプまたは空気ポンプを含む。いくつかの実施形態において、前記ポンプは、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力を印加するように構成されている。
いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットは、加熱された反応チャンバー、加熱されたパッド、加熱された支持体などの加熱チャンバーを含む。
いくつかの実施形態において、前記加熱された反応チャンバーは、前記検出ユニットの前記流路または導管を含むか、または前記検出ユニットの前記流路の一部を含む。いくつかの実施形態において、前記加熱された反応チャンバーまたは前記混合チャンバーは、前記液滴を選択的に押し出すように構成されている。
いくつかの実施形態において、各液滴の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、ナノチューブ、ナノチャネル、ウェル、マイクロチューブまたはマイクロチャネルを含む。いくつかの実施形態において、前記流路または導管の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
いくつかの実施形態において、前記電場発生ユニットおよび／または前記電気検知素子は、前記流路または導管に付属または接触している単一もしくは複数の電極パッドまたはアレイを含む。いくつかの実施形態において、前記単一もしくは複数の電極パッドまたはアレイは、前記流路または導管に蒸着もしくは印刷されているか、または前記流路または導管に接触している。
いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、壁面を含むか、または壁面に囲まれており、これらの壁面からなる断面が、正方形、長方形、円形または別の形状を含む。
いくつかの実施形態において、前記検出ユニットは、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の追加の流路または導管をさらに含む。いくつかの実施形態は、前記追加の流路および／または導管のそれぞれに付属または接触している追加の電場発生ユニットまたは電気検知素子をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、該流路または導管から分枝または分岐した流路または導管を備える分枝形状または分岐形状を含み、前記分枝または分岐した流路または導管が、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成されている。いくつかの実施形態は、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の、前記流路または導管から分枝または分岐した追加の流路または導管をさらに含む。いくつかの実施形態は、前記分枝または分岐した流路または導管のそれぞれに付属または接触している追加の電場発生ユニットおよび／または電気検知素子をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記システムは、前記液滴形成ユニット、前記温度制御ユニットおよび前記検出ユニットの全体またはその一部を収容したカートリッジを含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸増幅試薬は、PCR試薬、等温増幅試薬、ループ媒介等温増幅（LAMP）試薬、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）試薬またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅試薬は、等温核酸増幅法に適合した試薬を含み、該等温核酸増幅法は、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などである。
いくつかの実施形態は、核酸増幅産物の検出用装置であって、
ナノリットルウェルと、流路または導管と、検出ユニットとを含むカートリッジを含み、
前記ナノリットルウェルのそれぞれが、鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物と油とを含む液滴を収容するように構成されており、
前記流路または導管のそれぞれが、前記ナノリットルウェルの少なくとも１つと流体連通しており、かつ前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成されており、
前記検出ユニットが、
各流路または各導管に付属しており、
前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
を含み、
前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される、
装置を含む。
いくつかの実施形態において、前記ナノリットルウェルは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、１～10個、１～100個、10～25個、25～50個、48個、約48個、25～75個、50～100個、100～250個、250～500個またはそれ以上の個数のナノリットルウェルを含む。
いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、１～10本、１～100本、10～25本、25～50本、48本、約48本、25～75本、50～100本、100～250本、250～500本またはそれ以上の本数の流路または導管を含む。
いくつかの実施形態において、各液滴は、前記油と前記水性反応混合物を混合することにより形成される。
いくつかの実施形態は、前記ナノリットルウェル内および／または前記流路内もしくは前記導管内に前記液滴が存在する場合に、該液滴を所望の温度に加熱または維持するように構成された温度制御ユニットまたは加熱ユニットをさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸増幅試薬は、等温核酸増幅法に適合した試薬を含み、該等温核酸増幅法は、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などである。
いくつかの実施形態は、
鋳型核酸の増幅産物を検出する方法であって、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を含む油性液滴を加熱チャンバーに導入する工程；
前記油性液滴中の前記水性反応混合物に対して核酸増幅反応を行うことによって、前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程；ならびに
対照との比較により、電界を印加したときの前記油性液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定することによって、該油性液滴中の前記鋳型核酸の増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される工程
を含む方法を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸増幅反応は、PCR、等温増幅法、LAMP法、RPA法またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅反応は、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などの等温核酸増幅法を含む。
いくつかの実施形態において、前記水性反応混合物は、前記鋳型核酸を含むビーズまたは粒子を含み、該ビーズまたは粒子は、解放可能に該鋳型核酸に結合されているか、または解放不能に該鋳型核酸に結合されている。いくつかの実施形態において、前記ビーズまたは粒子は、金属、ポリマー、プラスチックもしくはガラスを含むか、または磁気を帯びている。
いくつかの実施形態において、前記液滴はエマルションを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、圧力下で、例えば、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力下で、油に前記水性反応混合物を導入することにより前記エマルションを形成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記エマルションを形成するように構成されている反応チャンバー、または前記液滴を選択的に押し出すように構成されている反応チャンバーにおいて行われる。
いくつかの実施形態において、前記液滴は、非イオン界面活性剤と油を含む油相を含む。いくつかの実施形態において、前記液滴は、オレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80、Triton X-100または鉱油を含む油相を含む。いくつかの実施形態において、前記液滴の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
いくつかの実施形態は、流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程をさらに含み、該流路内または該導管内に該液滴が存在する場合に、該液滴に電界が印加される。
いくつかの実施形態において、前記流路または導管の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、ナノチューブ、ナノチャネル、マイクロチューブまたはマイクロチャネルを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、カートリッジ内において実施されるか、または本明細書に記載のシステムもしくは装置において実施される。
いくつかの実施形態は、鋳型核酸の増幅産物を検出する方法であって、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を提供する工程；
エマルションに封入された前記水性反応混合物の液滴を形成する工程；
核酸増幅反応を行うことによって、各液滴内に前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程；
流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程；ならびに
対照との比較により、電界を印加したときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定することによって、各液滴中の前記増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記増幅産物の存在が示される工程
を含む方法を含む。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のシステムまたは装置を含むキットを含む。
いくつかの実施形態は、核酸増幅試薬、油または界面活性剤をさらに含む。
図１Ａ～図１Ｄは、標的を検出するためのカートリッジの一例を示す。
標的を検出するためのカートリッジの別の一例を示す。
図３Ａおよび図３Ｂは、標的を検出するためのカートリッジの別の一例を示す。
図４Ａ～図４Ｇは、図１Ａ～図３Ｂのカートリッジの試験ウェル内または本明細書に記載の別の適切な標的検出カートリッジの試験ウェル内もしくはチャネル内で使用することのできる様々な電極の例を示す。
図１Ａ～図３Ｂのカートリッジの試験ウェル内または本明細書に記載の別の適切な標的検出カートリッジの試験ウェル内もしくはチャネル内で互いに間隔を空けて配置されてもよい、第１の電極すなわち励起電極と第２の電極すなわち信号電極を示す。
図５Ａの信号電極から抽出することのできる信号の一例を示す。
例示的な陽性試験に基づいて生成された図５Ｂに示すような信号から抽出した抵抗成分およびリアクタンス成分を示す。
陽性対照および陰性対照の例示的な試験から得られた図５Ｂに示すような信号から抽出した抵抗成分およびリアクタンス成分を示す。
別の例示的な陽性試験に基づいて生成された図５Ｂに示すような信号から抽出された抵抗成分およびリアクタンス成分を示す。
本明細書に記載のカートリッジとともに使用することのできる読取装置の一例の略ブロック図を示す。
本明細書の記載に従って試験中に読取装置を作動させるためのプロセスの一例のフローチャートを示す。
本明細書の記載に従って、標的を検出するために試験データを分析するためのプロセスの一例のフローチャートを示す。
増幅免疫測定法のスキームを示す。
ビーズを用いた増幅免疫測定法のスキームを示す。
磁気ビーズを用いた増幅免疫測定法のスキームを示す。
チャネルに沿って互いに間隔を空けて配置されてもよい、第１の電極すなわち励起電極と第２の電極すなわち信号電極を示す。
信号のインピーダンスが、励起周波数に依存し、かつチャネルでLAMP反応が生じた後に変化することを示すグラフであり、左側の平らでない部分から、特定の周波数領域が定義されうることを示す。
両側の極値領域ではインピーダンスがコンデンサ様となり、励起電圧とは異位相である（９０°に近づく）ことを示すグラフである。
測定された試料チップのインピーダンスを、励起周波数に対して示すグラフである。
無次元の導電率に対してプロットした同期検出器の応答を示すグラフである。
あるモデルにおける検出器の出力が、広範な導電率および所定の段階の周波数において一致することが示された結果を示すグラフである。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、試料中の特定の核酸および／または特定のヌクレオチドの有無を検出するために使用してもよい検出システムの一実施形態を示す。図１７Ａはこのシステムの上面図であり、図１７Ｂはこのシステムの側断面図である。
標的を検出するための装置の一実装を示すプロセスフローチャートである。
標的を検出するための装置の一実装を示すプロセスフローチャートである。
流体工学カートリッジの一例を示す。
図２０の流体工学カートリッジの一例の平面図である。
電極の形状の一例を示す。
チャネルの一例を示す。
センサ電圧の経時変化を増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
センサ電圧の経時変化を、０％全血の増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
センサ電圧の経時変化を、１％全血の増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
センサ電圧の経時変化を、５％全血の増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
ろ過していない０％全血試料を用いた場合のセンサ電圧の経時変化を、増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
ろ過した０％全血試料を用いた場合のセンサ電圧の経時変化を、増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）に関して示すグラフである。
標的のロード量に対する閾値時間を標準偏差のエラーバーとともに示したグラフである。
増幅前（陰性対照）のバイアルおよび増幅後（陽性対照）のバイアルから得た様々な試料の導電率を示すグラフである。
HBs抗原を検出するための、磁気ビーズを用いた増幅免疫測定法のスキームを示す。
HBs抗原の検出を示すグラフである。
低イオン緩衝液（T10）を用いたHBs抗原の検出を示すグラフである。
流体工学カートリッジのインピーダンス特性を示すグラフである。
６５℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の異位相信号のグラフを示す。
６５℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の同位相信号のグラフを示す。
６７℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の異位相信号のグラフを示す。
６７℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の同位相信号のグラフを示す。
６７℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の異位相信号のグラフを示す。
６７℃のカートリッジ上で実施したLAMP法の同位相信号のグラフを示す。
本明細書に記載のシステム、装置または方法の一例を示す概略図である。
本明細書に記載のシステム、装置または方法の一例を示す概略図である。
いくつかの実施形態による方法を示すフローチャートである。
本明細書に開示される態様は、試料中に存在する標的を検出するための、デジタル増幅または液滴増幅および非接触電気的検知の使用に関する。このような診断プラットフォームは、光学検出に使用される複雑な光学システムや高価な蛍光標識、および一般的な電子部品を使用した既存の電気化学技術およびFET技術において使用される電極や電気活性剤の代替となりうる。いくつかの態様において、前記増幅は等温増幅であってもよく、例えば、LAMP法を併用してもよいリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）を利用した増幅であってもよい。本明細書に記載のプラットフォームは、安価、堅牢かつ携帯可能であり、従来の診断システムと比べて消費電力も少ない。いくつかの態様において、この診断プラットフォームは、使用者の手のひらに収まるほど小さく、また、例えば診療所、家庭、医療設備から遠く離れた場所などの診断現場などの分野で実施することができる。
本明細書で提供する特定の実施形態は、「等温増幅反応における非特異的な増幅を低減するための方法および組成物」という名称で2018年12月20日に出願された米国特許出願第62/782610号；「インピーダンスに基づく分析物検出用の携帯型診断検査システム」という名称で2018年12月20日に出願された米国特許出願第62/783104号；および「電気的検出を利用した等温増幅」という名称で2018年12月20日に出願された米国特許出願第62/783117号に開示されている態様を含み、これらの文献の内容はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。また、本明細書で提供する特定の実施形態は、米国特許第2016/0097740号、米国特許第2016/0097741号、米国特許第2016/0097739号、米国特許第2016/0097742号、米国特許第2016/0130639号および米国特許第2019/0232282号に開示されている態様を含み、これらの文献の内容はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
市販されている多くの核酸検出プラットフォームは、従来のPCRを利用するものであり、よって温度サイクル、蛍光標識および光学的検出機器を必要とする。このような要素により、高価な、検査室に設置された機器が必要となり、振動の影響を受けやすい繊細な検出器、高価な蛍光マーカーおよび大きな設置面積を使用することとなる。この装置は、高度に訓練された人員による操作および頻繁な較正を必要とする。
このような大型で扱い難いプラットフォームによって、従来のNATを診療所で日常的に使用することは難しく、ましてや家庭での使用はさらに困難である。NATは、依然として、集中型検査施設と密接に関連付けられた高価かつ時間のかかる方法に留まっている。これに対して、本明細書において開示される技術は、そのような問題を克服するものである。
臨床現場即時（「POC」）試験を行う際の障壁として、全血や粘液のような処理されていない生の臨床試料において、阻害物質により増幅の阻害が頻繁に起こることが挙げられる。増幅阻害物質を抑制することによって、臨床的に意義のある生物試料から標的核酸を直接検出することが可能になる可能性がある。
従来の検出方法は、一般に、蛍光検出技術に依存している。そのような技術は、複雑であったり、費用がより多くかかったり、精密な光学システムを必要としたりする場合がある。しかしながら、本発明の開示は、概して電気的検出システムを利用するものである。このような電気的検出システムは、比較的消費電力が低く、かつ大量生産によりコストを抑えて製造することが可能なマイクロエレクトロニクスを活用することができる。したがって、ゲノム物質を電気的に検出できれば、コンピュータ産業の進歩をバイオアッセイによる検知へと移行できると考えられる。
増幅をモニタリングするための既存の電子的な方法では、電気化学的に活性な標識を表面に結合したり、増幅された物質を選択的に表面に結合したりすることが必要となることがある。しかしながら、これらの技術を実際の臨床応用において使用する場合には、応答時間が長いこと、電極や結合表面の生物付着により信号対雑音比が悪くなること、ならびに装置の寿命および信頼性に限界があることなどの問題がしばしば発生する。電気化学的検出または電界効果トランジスタ「FET」による検出は、高い感度を得られる可能性はあるものの、検出がさらに複雑なものとなる。これは、POCや、その他の民生用アプリケーションと比べて高価かつ脆弱な戦略となりうる。したがって、さらなる診断装置が必要とされていることは明らかである。
本明細書において開示されるプラットフォームは、核酸増幅中に生じる導電率の変化の測定を利用する。要するに、ヌクレオチド三リン酸からDNAが生化学的に合成される際に、電荷を帯びた分子の数および移動度は変化する。その結果、増幅の進行とともに溶液の導電率が変化することとなる。溶液の導電率におけるこの変化を、周波数に依存した容量結合型の非接触式導電率検出（「fC4D」）を使用して検知できる可能性がある。
いくつかの実装において、fC4Dは、増幅チャンバー内の流体のごく近くに、ただし接触はしないように配置された１対の電極を使用して、溶液の電気的特性を測定する。このようにして、直接的に接触することなく溶液の特性を測定できることで、その他の電気的測定法に共通の問題としての表面への付着が回避される。
いくつかの実装では、fC4Dを利用して、励起電極に高周波の交流（「AC」）信号が印加される。この信号は、溶液を介して容量結合され、信号電極において検出される。励起信号と信号電極の信号とを比較することによって、溶液の導電率を測定することができる。
高分解能有限要素モデルおよび実証研究から得た情報によれば、fC4Dを用いた技術において許容差を特定の値とすることで、プラットフォームの特定の実装に最適な検出感度および検知のダイナミックレンジを達成してもよい。マイクロ流体のサイズ、容量結合特性および印加周波数のパラメータをそのように計算し、実証的に決定することで、溶液の導電率の変化の検出に有効なパラメータを決定することが可能である。いくつかの実施形態において、最適な検出に相当するパラメータは、相互依存変数でありうる。以下の等式によれば、インピーダンスの測定値は、溶液の抵抗、静電容量および印加周波数の関数である。
Z = R－(1/pi*f*C)*j
電極不動態化層の厚さが増すほど、この層による寄生容量は増加する。したがって、fC4Dによって溶液の導電率を測定する際の最適なAC周波数は、不動態化層の静電容量に基づいて選択することができる。
カートリッジ、読取装置および信号処理の一例の概要
いくつかの態様において、試料中に存在する標的を検出するためのシステムは、併用する読取装置に連結することのできる取り外し可能な流体工学カートリッジを含む。ユーザは、カートリッジに試料を導入し、次いで該カートリッジを読取装置に挿入することができる。この読取装置は、カートリッジを用いて試験の手順を実施し、試験データを分析することによって、試料中の標的の有無の判定や標的の量の測定を行うように構成されている。例えば、試料中に当初から存在する標的を増幅するための増幅プロセスを目的として、カートリッジに所望の物質、タンパク質またはその他の化学物質を供給することができる。具体的に言えば、いくつかのカートリッジには、核酸試験のための所望の化学物質を供給することができ、このカートリッジにおいて、試料中のゲノム物質は、本明細書で述べるように、分子増幅プロセスを用いて指数関数的に複製される。カートリッジはさらに、増幅プロセスを行うための試験ウェルを含みうる。この試験ウェルは、ウェル、チャンバー、チャネル、または試験液と増幅プロセスの構成要素とを含む（もしくは実質的に含む）ように構成された別の形態を指す。読取装置は、カートリッジにおいて増幅プロセスが促進されるような所望の温度またはその他の試験環境パラメータを維持してもよく、増幅プロセスの全体またはその一部において、カートリッジの試験ウェルを電子的にモニターすることができる。このようにして、読取装置は、増幅プロセスにおいて試験ウェルのインピーダンスを示す信号データを経時的に収集し、本明細書で述べるように、このインピーダンスを分析して、試料中の標的の有無またはその量を確認することができる。一例において、増幅プロセスは５分～６０分であってもよく、別のいくつかの例では、１０分～３０分であってもよい。いくつかの実施形態では、増幅産物は、ウェルに結合されたり捕捉されたりすることなく、また、ウェルもしくは該ウェル内の粒子に結合されたプローブに固定されたり結合されたりすることなく、ウェル内の流体に懸濁された状態または遊離した状態で検出されることが好ましい。別の実施形態では、増幅産物は、ウェルまたは該ウェル内の粒子に結合または捕捉された状態で、例えば、ウェルまたは該ウェル内の粒子に結合されたプローブに固定または結合された状態で検出される。
このようなシステムは、試料を増幅および分析のために検査室へ送ることを必要とせず、臨床現場において、さらにはユーザの家庭においても標的の検出を行うことが可能であるという点で有益である。これによって、臨床現場では、従来の核酸試験の遅れを回避することができ、臨床医は、患者が診療所を訪れる定型的な時間枠内で診断を確定できるようになる。したがって、本明細書で開示されるこのようなシステムによれば、臨床医は、検査室から戻って来る試験結果を受け取るまで何時間も、あるいは何日間も待つ必要はなく、患者の最初の来院時に、その患者の治療計画を立てることができるようになる。例えば、患者が診療所を訪れた際に、看護師またはその他の医療関係者が患者から試料を採取し、本明細書に記載のシステムを用いて試験を開始することができる。患者が医師または臨床医の診察を受けて治療計画を決定する時間までに、本明細書に記載のシステムにより試験結果を得ることができる。特に、急速に進行する病状の診断に使用される場合、本明細書で開示するシステムは、患者の治療および帰結に悪影響を及ぼしうる、臨床検査結果に関連する遅延を回避することができる。
別の利点として、本明細書で開示するシステムは、臨床現場以外の場所（例えば、常設の診療所に容易にアクセスできない野外やへき地など）で、接触性伝染病（例えばエボラなど）のような健康状態を検出するために使用することができ、それによって、接触伝染病の拡散を予防または緩和を目的として適切な人員が直ちに行動を取ることが可能となる。同様に、本明細書で開示するシステムは、野外や危険な汚染（例えば、炭疽菌など）の疑われる場所で、試料がこのような危険な汚染物質を含有しているか否かを迅速に判定するために使用することができ、それによって、汚染物質の人への曝露を予防または緩和を目的として適切な人員が直ちに行動を取ることが可能となる。さらに、本明細書で開示するシステムは、供給される血液もしくは血漿または食品産業において汚染物質を検出するために使用することができる。離れた場所にある検査室へ試料を送ることにより検出が遅れることと比較して、標的をリアルタイムで検出することにより有効な行動が可能となるようなその他の状況においても、本明細書で開示するシステムが同様の利点を提供できることは、容易に理解されるであろう。
このようなシステムの別の利点は、廉価な使い捨てのカートリッジを、再使用可能な読取装置とともに使用することである。この読取装置は、カートリッジを替えて、かつ／または様々な標的を試験するために、何度も使用することができる。
図１Ａ～図１Ｄは、標的を検出するように構成されたカートリッジ100の一例を示す。本明細書で述べるように、この標的は、ウイルス標的、細菌標的、抗原標的、寄生虫標的、マイクロRNA標的または農業分野の分析種であってもよい。カートリッジ100のいくつかの実施形態は、単一の標的の試験を行うように構成することができ、カートリッジ100の別のいくつかの実施形態は、複数の標的の試験を行うように構成することができる。
図１Ａは、ベース部125の上にカバー105を備えたカートリッジ100を示す。使用時、カバー105によって、供給された試料をカートリッジ100内に密封することで、試料の操作者への曝露を防止し、かつ付随する読取装置の電子部品へと液体が流出することを防止することができる。カバー105は、ベース部125に恒久的に取り付けられていてもよく、また特定の実施形態では、取り外し可能であってもよい。カバー105は、プラスチックのような適切な材料から形成することができ、図に示したように不透明であってもよく、別の例では、半透明であってもよく、透明であってもよい。
カバー105は、ベース部125の試料導入部120の上方に配置された貫通孔115を含む。ここで、「上方」とは、貫通孔115を含むカバー105の平面と直交するようにカートリッジ100を上から見下ろした場合に、試料導入部120の上方に貫通孔115が位置することを指す。カバー105は、貫通孔115を通じて試料が供給される前後に貫通孔115を流体密封するように構成されたキャップ110をさらに含む。キャップ110は、キャップ110が貫通孔115で密封される際に貫通孔115を塞ぐ円柱状突起111と、キャップ110が貫通孔115で密封された際にユーザが貫通孔115からキャップ110を引くことを補助するように構成された開放つまみ113と、キャップ110をカバー105に固定された状態に維持しつつ、キャップ110を貫通孔115から分離して試料供給路から外すことが可能になるように構成されたヒンジ112とを含む。貫通孔115を密封するために、その他の様々な形状のキャップ110も同様に使用可能であり、また、いくつかの実施形態では、ヒンジ112および／または開放つまみ113の変形や省略が可能であることは容易に理解されるであろう。図示した実施形態において、カバー105とキャップ110は同じ材料から一体形成されているが、別の実施形態では、キャップ110とカバー105は別の構造体であってもよい。
使用時、ユーザはキャップ110を開き、カバーに設けられた貫通孔115を通じて、標的を含む可能性のある試料をベース部125の試料導入部120へと導入する。例えば、ユーザは、自分の指を穿刺した後に、例えば毛細管を通じて全血試料を試料導入部120へと導入することができる。カートリッジ100は、１つ以上の液体、半固体および固体の試料を収容できるように構成することができる。試料を導入した後、ユーザは、キャップ110を閉じて、貫通孔115を密封することができる。ベース部125の流路への入口を密封することによって、試料（およびその他の液体）がベース部125の流路を通って試験ウェルへと移動することができるという利点がある。例えば、ユーザは、本明細書で述べるように、試料を含む密封したカートリッジ100を読取装置に挿入することができ、試料を試験ウェルへと移動させるために設けられていてもよい空気インターフェースを読取装置より作動することができる。流路および試験ウェルについては、図１Ｂおよび図１Ｃを参照してより詳細に説明する。また、読取装置の一例は、図６を参照して説明する。
カバー105は、ベース部125の電極インターフェース135を露出させるための凹部130を含む。これについては、以下でより詳細に説明する。いくつかの実施形態において、カバー105は、使用時まで電極インターフェース135を保護するための可動フラップまたは取り外し可能なシースを含んでいてもよい。
図１Ｂは、図１Ａのカートリッジ100を、ベース部125の特徴が分かるようにカバーを除去して示す。ベース部125は、液体不透過性材料から形成することができ、例えば、射出成形されていてもよく、切削したアクリルまたはプラスチックであってもよい。ベース部125は、試料導入部120、ブリスターパック140、空気インターフェース160、試験ウェル175を含む試験領域170Aおよび流路150を含み、流路150は、導入された試料をブリスターパック140に収容された液体と混合し、この混合された液体を試験ウェル175へと運ぶように構成されている。これらの特徴を構成する特定の幾何学的形状や相対的配置は、その他の実施形態において様々に変更してもよいことは容易に理解されるであろう。
ブリスターパック140は、フィルム、例えば熱成形されたプラスチックフィルムを含み、このフィルムは、導入された試料と混合される液体を収容する密封チャンバーを形成している。この液体は、増幅試薬、緩衝液、水、または試験プロセスのためのその他の所望の液体成分を含みうる。また、この液体の選択およびその化学的性質は、カートリッジ100を用いて試験を行う特定の標的または複数の標的に適合させることができる。ブリスターパック140のいくつかの実施形態では、封入されている液体に溶解または懸濁された液体以外の化合物がさらに含まれていてもよい。ブリスターパック140はベース部125に固定することができ、例えば空気流路161を有する流体密封チャンバー内のベース部125に固定することができ、空気流路161は、チャンバーおよび貫通孔141へと続いており、チャンバーから出た後は流路150へと続いている。例えば、ブリスターパック140を所定の位置に固定するために、ブリスターパック140の一面または両面の外縁に沿って粘着剤を環状に配置することができる。
使用時、ユーザまたは読取装置は、鋭利な部分（例えば、鋭い先端を有する針など）を機械的に作動させることによって、ブリスターパック140を穿刺し、その液状内容物を、貫通孔141を通じて流路150の第１のセグメントへと放出させることができる。この鋭利な部分はカートリッジ100に組み込まれていてもよく、例えば、ブリスターパック140を含み、かつ流路の第１のセグメント151と流体連通しているチャンバー内に配置してもよい。本明細書において、「流体連通」とは、流体（例えば、液体や気体）が移動可能であることを指す。別の一実施形態において、ユーザまたは読取装置は、ブリスターパック140の下側表面（図１Ｂでは示されていないが、図示した表面の裏側に下側表面がある）を鋭利な部分に食い込むよう押し上げることにより、この鋭利な部分でブリスターパック140を穿刺することができる。別の実施形態において、鋭利な部分を省略することもでき、ユーザまたは読取装置は、ブリスターパック140がその液状内容物の圧力によって破裂するまで、ブリスターパック140を圧縮することができる。破裂可能なブリスターパックについて説明したが、別の実施形態においては、機械的に開けることのできるチャンバーを備え、封入されている液体を同様に流路150の第１のセグメント151へと放出するように構成することもできる。
前述したように、試料を導入した後、ユーザはカバーの貫通孔115を密封することによって、カートリッジ100内の流路150を密封する。空気インターフェース160は、流路150に沿って試験ウェル175に至る所望の方向への流体の流れを促進するために、ブリスターパックチャンバーを介して、密封された流路150内へと空気などの流体または培地を供給するように構成されている。空気インターフェース160は、空気流路161と接続されかつ該空気流路161と流体連通した貫通孔であってもよく、該空気流路161は、ブリスターパック140またはブリスターパック140を含むチャンバーと接続されかつ該ブリスターパック140または該チャンバーと流体連通している。いくつかの実施形態において、空気インターフェース160は、圧縮されると外気を強制的に空気流路161へと送り込み、圧縮を解放すると周囲から外気を取り入れる圧縮可能な一方向弁であってもよい。このような実施形態では、空気インターフェース160を繰り返し圧縮することによって、カートリッジ内の流体を流路に沿って強制的に流すことができる。
流路150は、各セグメント151、152、153、154、155および156、試料導入部120、試験ウェル175、試験ウェルへの流入路176ならびに試験ウェルからの流出路177を含む。流路150の第１のセグメント151は、ブリスターパック140から出て試料導入部120へと通じている。流路150の第２のセグメント152は、試料導入部120から出て混合チャンバー153へと通じている。混合チャンバー153は、流路150の第３のセグメントであり、第２のセグメント152および第４のセグメント154よりも広くなっている。流路150の第４のセグメント154は、混合チャンバー153から出て該流路の第５のセグメント155へと通じている。流路150の第５のセグメント155は、試験領域170A内に形成されている。流路150の第５のセグメント155は、第１の試験ウェルへの流入路176と、流路150の第６のセグメント156のいずれにも通じている。流路150の第６のセグメント156はそれぞれ、隣り合う試験ウェルへの流入路同士をつないでおり、最後の試験ウェルの流入口176までつながっている。試験ウェルへの流入路176は、試験ウェル175と流路150を流体連通させており、例えば、試験ウェル間の交差増幅を防止するために、バルブ174により閉鎖されていてもよい。試験ウェルからの流出路177は、試験ウェル175から出て、排出孔178へと通じており、これによって、気体が試験ウェル175から出て、カートリッジ100の外部へと出ることが可能となる。
ブリスターパック140から放出された液体と導入された試料とを均一あるいは均質に混合することにより、いくつかの実施形態での試験結果がより正確なものとなる。これを達成するため、混合チャンバー153は、ブリスターパック140から放出された液体と導入された試料の均一な混合を容易に行えるように構成されており、例えば、混合チャンバー153内での液体の流れが層流ではなく乱流となるように、湾曲した領域および／または湾曲した断面形状を備えている。「乱流」とは、流体力学における流動様式の１つであり、流体の圧力および流速の無秩序な変化を特徴とする。乱流は層流と対照をなすものであり、「層流」とは、流体が平行な層状に流れ、層間に乱れがないものを指す。
流路150の各セグメント151、152、153、154は、ベース部125の材料で完全に覆われていてもよく、３つの表面がベース部125の材料から形成され、カバー105がこれらのチャネルを密封する上面を形成していてもよい。流路150の各セグメント155、156と、試験ウェルへの流入路176および試験ウェルからの流出路177は、ベース部125の材料で完全に覆われていてもよく、３つの表面がベース部125の材料から形成され、カバー105がこれらの流路を密封する上面を形成していてもよく、あるいは２つの表面がベース部125の材料から形成され、回路基板179がこれらの流路の下面を形成し、カバー105がこれらの流路の上面を形成していてもよい。
図１Ｃは、流路150に沿った流れの方向を示し、丸で囲んだ数字は、流路に沿った特定の箇所を示すものである。丸で囲んだ数字については、カートリッジ100内の流路150を通って移動する流体180の進行工程の一例として、以下で説明する。工程ごとに、その工程における流体の移動の方向を示す矢印が付されている。
工程（１）に先立ち、ユーザは試料導入部120に試料を導入する。図１Ｃを簡便かつ明瞭に示すため、図１Ｂにおいて参照番号を付した構成部品に関しては、図１Ｃではその番号を表示していない。さらに、工程（１）に先立ち、ブリスターパック140を破裂させ、その液状内容物を事前に密封したチャンバーから放出させる。
工程（１）において、空気インターフェース160から流れて来た空気またはその他の流体は、図示した方向に空気流路161に沿って移動し、破裂したブリスターパック140へと向かう。
工程（２）において、破裂したブリスターパック140から放出された液体（本明細書中、「マスターミックス」と称する）は、貫通孔141を通って、図示した方向に移動し、流路150の第１のセグメントへと入る。このマスターミックスは、第１のセグメント151に沿って流れ進み、工程（３）において試料導入部120に入り、この時点から、マスターミックスは試料を搬送しながら、流路に沿ってさらに流れる。
工程（４）において、マスターミックスと試料は試料導入部120を離れ、流路150の第２のセグメント152に沿って、図示した方向に流れる。マスターミックスの量は、導入された試料を試料導入部120から完全にもしくは実質的に完全に搬出できるように、かつ／または少なくとも試験ウェル175およびそれらへの流入路176を充填できるように、あらかじめ選択することができる。
工程（５）において、マスターミックスと試料は図示した方向に流れ、流路150内で幅が広くなっている第３のセグメント153に通じる入口に入り、工程（６）において、マスターミックスと試料が混合されて、試料がマスターミックス全体に均一に分配された均質な溶液となる。前述したように、第３のセグメント153は、マスターミックスと試料の混合を促すように構成された湾曲したセグメントと平坦な混合チャンバーとを含む。いくつかの実施形態において、空気インターフェース160によって供給される流体の流速は、この混合をさらに促進するように選択することができる。
工程（７）において、混合されたマスターミックスと試料（「試験液」と称する）は、混合チャンバー153を離れ、試験領域170Aへと続く流路150の第４のセグメント154に入る。
工程（８）において、試験液は流路150の第５のセグメント155に沿って図示した方向に移動し、試験領域170Aを通って試験ウェル175に向かう。
工程（９）において、試験液は第１の試験ウェルへの流入路176に到達し、工程（９）の流路の矢印から三叉に示された３つの流入可能な流路に沿って流れるように誘導される。
工程（１０）の流路は、流路150のセグメント156に沿ってさらに次の試験ウェルへの流入路176へと進む試験液の流れを示す。試験ウェルへの流入路176のバルブ174は、工程（１０）へと進む試験液の流れを阻止するために閉鎖されていてもよい。
工程（１１）の流路は、バルブ174を通る試験液の気体部分の流れを示しており、この流れは設けなくてもよい。いくつかの実施形態において、バルブ174は、試験液が試験ウェル175に入る前に、バルブ174を通して試験液中に存在する気体を排出するため、液体不透過性かつ気体透過性のフィルタを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、バルブ174は、気体を排出するように構成されていなくてもよい。
工程（１２）の流路は、試験ウェル175へと入る試験液の流れの方向を示す。いくつかの実施形態において、所定のトリガが発生した際、バルブ174を閉鎖して試験ウェル175を密封する。このトリガは、少なくとも試験ウェル175（さらには、流入路176および流出路177）の容量に相当する所定量の液体が工程（１２）の流路に沿って流れた際に生じうる。バルブを閉鎖するトリガの別の例として、この所定量の液体が工程（１２）の流路に沿って流れるのに要すると見込まれる時間に相当する所定時間が経過した際に生じうる。別の一実施形態において、このトリガは、流体が図示した流路に沿って逆方向に流れ始め、別の試験ウェルでの増幅プロセスに対して交差汚染が起こりうる時点で発せられるトリガであってもよく、このトリガによって空気インターフェース160が停止する。いくつかの実施形態において、バルブ174の位置は、図に示した箇所にはなく、液体不透過性かつ気体透過性のフィルタで覆われていてもよい気体排出孔であってもよく、このバルブは、試験ウェルへの流入路176または流路セグメント156に沿って配置されていてもよい。
工程（１３）の流路は、流出路177を通って試験ウェル175から出ていく試験液またはその気体成分の流れの方向を示す。流出路177は、試験ウェル175から出ていくチャネルであってもよく、空気インターフェース160によって付与される圧力によって試験液を流出路177に流し込むことができる。いくつかの実施形態において、試験液の気体成分のみが流出路177を通って流れるように、試験ウェル175と流出路177の間のインターフェースに液体不透過性かつ気体透過性のフィルタを備えることができる。
工程（１４）において、試験液から放出された気体は、排出孔178を通ってカートリッジ100から放出される。液体不透過性かつ気体透過性のフィルタで排出孔178を覆うことによって、カートリッジ100から気体を逃がしつつ液体の漏出を阻止することができる。試験液から気体の放出を可能にし、これを促進することによって、試験ウェルに残存する気体の量を最小限に抑え、試験ウェル内の液体の量を最大限に高めることでき、有益である。後述するように、電極間の流路に気泡が生じる可能性を最小限に抑えることによって、信頼性がより高い信号およびより正確な試験結果が得られるという点で有益である。
図１Ｂに戻ると、試験領域170Aは、流路150の各セグメント155、156、試験ウェル175、試験ウェルへの流入路176、試験ウェルからの流出路177、貫通孔／バルブ176、178および回路基板179を含む。回路基板179は、各試験ウェルの電極171A、171B、電流およびその他の電気信号を運ぶためのコンダクタ172、ならびに電極インターフェース135を含む。電極インターフェース135は、接点パッド173を含み、接点パッド173の半数は、読取装置の電圧源または電流源と各試験ウェルの励起電極とを接続するように構成されており、接点パッド173の残りの半数は、各試験ウェルの信号電極と試験装置の信号読取コンダクタとを電気的に接続するように構成されている。図１Ｂを明確に示すため、試験領域170Aにおいて同じ構成要素が繰り返し示されないように、特定のものにのみ参考番号を付している。
回路基板179は、プリント回路基板、例えば、多層のスクリーン印刷回路基板またはシルクスクリーン印刷回路基板などであってもよい。回路基板179は、柔軟性のあるプラスチック基板上または半導体基板上に印刷することができる。回路基板179は、少なくとも部分的に、ベース部125とは別の材料から形成して、重なり領域126を有するベース部125の下側に固定することができ、ベース部125の重なり領域126は、流路150の各セグメント155、156、試験ウェル175、試験ウェルへの流入路176、試験ウェルからの流出路177、貫通孔／バルブ176，178を含む。例えば、回路基板179は、重なり領域126のアクリル樹脂に接着、固定または積層された多層のプリント回路基板であってもよい。電極インターフェース135は、重なり領域126の端部から延びていてもよい。試験ウェル175は、重なり領域126の材料に設けられた穴として形成し、回路基板179の電極171A、171Bを試験ウェル175内に露出させることができる。したがって、電極171A、171Bは、ウェル175内に流入する流体と直接的に接触することができる。回路基板179は、その上面を樹脂でコーティングすることにより、試験ウェルの底面となる滑らかな平面を形成することができる。
試験ウェル175に、固体の乾燥成分、例えばプライマーやタンパク質などを供給することによって試験プロセスを行うことができる。これらの乾燥成分の選択およびその化学的性質は、カートリッジ100の設計の際に試験対象として設定された特定の標的または特定の複数の標的に適合させることができる。試験ウェル175のそれぞれに供給される乾燥成分は、同一であってもよく、それぞれ異なっていてもよい。これらの乾燥成分は、試験ウェルに流入する液体（例えば、ブリスターパック140から放出された後、導入された試料と混合される液体）で湿潤し、試験操作を行うために活性化することができる。ブリスターパック140内の液体成分と、試験ウェル175内の乾燥固体成分とを別々に供給することで、増幅プロセスに必要とされる成分をカートリッジ100に収容したままの状態で、使用前のカートリッジ100を使用時まで保管することが可能となり、また試料が導入されるまで増幅の開始を遅らせることが可能となり、有益である。
試験ウェル175は、円形のウェルとして示されており、電極インターフェース135からの距離が異なるように互いに少しずらして配置された２列の円形ウェルが繰り返し配置されている。試験ウェル175は、通常は円筒形状であってもよく、例えば、重なり領域126の材料内に形成された円形の穴であってもよく、その上側と下側の境界が平面によって規定されていてもよい（例えば、上側の境界がカバー105または重なり領域126の一部によって規定され、下側の境界が回路基板179によって規定されていてもよい）。各試験ウェル175は、２つの電極171A、171Bを含む。一方の電極は、試験ウェル175に収容された試料に電流を印加するように構成された励起電極であり、他方の電極は、励起電極から液体試料を通って流れて来た電流を検出するように構成された信号電極である。いくつかの実施形態において、カートリッジ100内の流体の温度をモニタリングするために、１つ以上の試験ウェルが電極の代わりにサーミスタを備えていてもよい。
試験ウェルはそれぞれ、その他の試験ウェルから独立してモニタリングすることができるため、試験ウェルごとに異なる試験を構成することができる。各試験ウェル内の電極171A、171Bは、互いに平行に配置された線状電極である。図示した試験ウェル175の配置であれば、流路150から各試験ウェル175にアクセス可能な、コンパクトな試験領域170Aを構成することができる。いくつかの実施形態では、単一の試験ウェルのみが含まれることもあるが、様々な実施形態において、その他の構成で配置された２つ以上の試験ウェルが含まれることもある。さらに、試験ウェルの形状は、別の実施形態では変更することができ、また電極の形状は、図４Ａ～図４Ｇに示す電極のいずれであってもよい。
いくつかの実施形態において、試験ウェル175内の気泡が、特に電極171Aと電極171Bの間の電流路に沿って位置する場合、この気泡によって信号電極が取得する信号にノイズが生じることがある。このノイズは、信号電極から得られる信号に基づいて決定される試験結果の精度を低下させる可能性がある。電流路に沿って液体しか存在しない場合、あるいは電流路に沿って存在する気泡が極めて小さい場合、所望の高品質な信号が得られる可能性もある。前述したように、流路150に沿って流れる流体中に当初存在する空気はすべて、排出孔178を通って押し出すことができる。さらに、電極171A、171Bおよび／または試験ウェル175は、液体試料中に生じた空気泡または気泡が電極に沿って集まることによる核生成を軽減または防止することができる形状にすることができる。
例えば、電極171A、171Bは、試験ウェル175の底部に配置される。これにより、空気または気体を試験ウェルの流体の上部へと上昇させ、電極間の経路から離すことができる。本明細書中、「試験ウェルの底部」とは、重さの重い液体が重力により沈み込む試験ウェルの部分を指し、また「試験ウェルの上部」とは、重さの軽い気体が重さの重い液体の上方に位置する試験ウェルの部分を指す。さらに、電極171A、171Bは、気泡の核形成が通常生じる部分である試験ウェルの周縁または端部から離れて配置される。
さらに、電極171A、171Bは、試験ウェルの底部を形成している下方の回路基板層からの高さが最小限になるように薄く平坦な材料層で形成することができる。いくつかの実施形態において、電極171A、171Bは、例えば、電着およびパターニングを使用して、高さが約300nmの金属フィルムの薄層として形成することができる。このように高さを最小限に抑えることによって、電極と下部層との間のインターフェースに沿って気泡がトラップされることを防止または軽減することができる。いくつかの実施形態において、各電極の頂部に導電材料層を設けることによって、電極の端部から試験ウェルの底部への遷移をより滑らにすることができる。例えば、薄いポリイミド層（例えば、高さ約５ミクロン）を電極の頂部に設けたり、回路基板を肉盛りコーティングしたりすることができる。それに加えて、あるいは別法として、電極の高さとほぼ等しい深さを有する溝を備えた下部層の溝の中に、電極を配置することができる。これらの方法およびその他の適切な方法によって、ほぼ平坦またはウェルの底部とほぼ同じ高さにある電極を得ることができる。
前述の特徴は、電極171A、171Bを液体に囲まれた状態に保ち、かつ電極171A、171Bの間の電流路に沿って気泡が位置することを阻止または抑制することができるという点で有益である。
図１Ｄは、カートリッジ100の試験領域170Bの平面図を線画で描いたものである。図１Ｂと同様に、図１Ｄを簡便かつ明確に示すため、同じ構成要素が繰り返し示されないように、それぞれ１箇所のみに参照番号を付している。
試験領域170Bは、試験領域170Aの別の一実施形態であり、これら２つの実施形態は、試験ウェル175内の電極の構成が異なるという点で異なる。試験領域170Bの実施形態において、試験ウェルには、環状電極171Cおよび171Dが備えられている。試験領域170Aの線状電極171A、171Bにおいて、いずれか一方の電極が励起電極または信号電極となりうる。試験領域170Bのこの実施形態では、内側電極171Dが励起電極であり、外側電極171Cが信号電極である。
内側電極171Dは、電流を供給するコンダクタ172Bに接続された円板形状または円形状の電極であってもよく、コンダクタ172Bは、読取装置から内側電極171Dへと電流（例えば、特定周波数のAC電流）を伝える電極インターフェース135の電流供給パッド173に接続されている。内側電極171Dは、試験ウェル175の中心に配置することができる。外側電極171Cは、内側電極171Dと同心になるよう形成され、間隙によって内側電極171Dから隔てられた半円形の電極である。外側電極171Cの半円の切れ目は、導電性リードが内側電極171Dを電流供給コンダクタ172Bに接続する箇所に位置している。外側電極171Cは、電流を検知するコンダクタ172Bに接続されており、コンダクタ172Bは、検知された電流を読取装置へと伝える電極インターフェース135の電流検知パッド173に接続されている。
図１Ａ～図１Ｄのカートリッジ100は、増幅に基づく標的の試験、例えば、分子増幅プロセスを用いて試料中のゲノム物質を指数関数的に複製する核酸試験を行うための、容易に使用可能な自己完結型の装置を提供する。いくつかの実施形態において、増幅プロセスの液体成分と固体成分がカートリッジ内にあらかじめ備えられ、自動的に試料と混合されることから、ユーザは、試料を導入し、読取装置にカートリッジ100を挿入するだけで試験結果を得ることができるため、有利である。いくつかの実施形態において、カートリッジおよび読取装置の一方または両方が、カートリッジを増幅に望ましい温度に維持するために、ヒーターと、ヒーターを操作するように構成されたコントローラとを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、カートリッジおよび読取装置の一方または両方が、トラップされている気体を液体の上部へと上昇させて試験ウェルから排出するために、カートリッジに振動を与えるか、あるいはその他の方法でカートリッジを振盪するためのモータを含んでいてもよい。
図２は、標的を検出するための、別のカートリッジ200の一例の写真を示す。カートリッジ200は、本明細書に記載された試験データのいくつかを生成するために使用されたものであり、カートリッジ100に関して説明した構成部品のいくつかが別の構成で配置されている。
カートリッジ200は、プリント回路基板層205およびアクリル層210を含み、アクリル層210は、プリント回路基板層205の一部を覆い、粘着剤を使用してこのプリント回路基板層205の一部に接着されている。アクリル層210は、複数の試験ウェル215Aと、アクリル層210の高さ全体にわたり延びる円形貫通孔として形成された複数の温度監視ウェル215Bを含む。プリント回路基板層205は、前述した回路基板179と同様に形成することができ、それぞれの試験ウェル215A内に配置された１対の電極220と、それぞれの温度監視ウェル215B内に配置されたサーミスタ225を含む。電極220およびサーミスタ225はそれぞれ、プリント回路基板の複数のリード230で終端されたコンダクタに接続されている。図示するように、リードのうち６つは信号電極用であり、「SIG」の後に１～６の番号を付して表示され、リードのうち６つは励起電極用であり、「EXC」の後に１～６の番号を付して表示され、２つのリードは、サーミスタ用としてRT1およびRT2と表示されている。
本明細書に記載する試験のいくつかにおいて、以下の例示的なプロトコルを実施した。最初に、ユーザは、ウェル215Aを試験液で満たし、これを鉱油で覆った。試験液にはプライマー対照が含まれていなくてもよいことから、増幅を引き起こすプライマーが存在せず、確実な陰性対照を得ることが可能となった。
次いで、ユーザは、カートリッジ200を65℃で10分間加熱し、試験液内にトラップされた気体を膨張させ、気泡として液体の上部まで上昇させた。この最初の加熱中にウェル215A内に気泡が生じた。
次の工程において、ユーザは、ピペットまたはその他の器具を使用して、ウェル215A内の液体の表面にある気泡をこすり取った。前述のように、気泡を除去することで、試験結果はより正確なものとなりうる。
気泡を除去した後、ユーザは、カートリッジ200を室温まで冷却した。次いで、ユーザは、ループ媒介等温増幅（LAMP）の陽性対照（PC）を各試験ウェル215Aの底部に注入し、カートリッジ200をヒートブロック上に配置し、LAMP試験を開始した。信号電極から検出された信号は、本明細書の記載に従って分析され、陽性を示す信号のクリフが同定された。
図３Ａおよび図３Ｂは、標的を検出するように構成された別のカートリッジ300の一例を示す。図３Ａは、カートリッジ300を、左側の手前の方から上面を見た斜視図であり、図３Ｂは、カートリッジ300のウェル320の輪郭を示す斜視断面図である。カートリッジ300では、カートリッジ100に関して説明した構成部品のいくつかが別の構成で配置されている。
カートリッジ300は、試料導入部305、中央チャネル310、試験ウェル320、試験ウェル320と中央チャネル310とを流体連通させる分岐315、各試験ウェル320内に配置された電極325A、325B、および電極インターフェース320を含む。電極インターフェース320は接点パッドを含み、接点パッドは、電極325Aおよび電極325Bのそれぞれに接続されたコンダクタに接続され、読取装置との間で信号の送受信を行うように構成されている。図３Ｂで示されるように、各ウェルが概して半球状となるように、ウェル320は湾曲した底面を有していてもよい。カートリッジ300は、その内部の構成部品が見やすいように、上部が開かれた状態で示されているが、使用時には、カバーまたはその他の上部層を提供することによってカートリッジ300の流路を密封する。カバーは、カートリッジ300から気体を逃がすための通気孔を含んでもよく、例えば、図１Ａ～図１Ｄに関して前述したように、液体不透過性かつ気体透過性のフィルタを備えることができる。
試料導入部305に導入された流体試料は、中央チャネル310を下って流れ、例えば、読取装置から圧力が印加されることによって、試料導入部305の上部に接続されたポートを通ってカートリッジ300内へと試料が注入される。いくつかの実施形態では、そのような読取装置に、例えば積み重ねられた１組のカートリッジを提供することができ、各カートリッジに供給される試料は同一であってもよく、異なっていてもよい。流体試料の大部分は、気体が（例えば気泡として）溶解またはトラップされている液体でありうる。流体は、中央チャネル310から分岐チャネル315を通って試験ウェル320内へと流入することができる。分岐チャネル315は、ウェルの上部につながっていてもよく、異なる試験ウェル間での増幅プロセスの交差汚染を引き起こしうる流体の逆流を防止または軽減するために、屈曲していてもよい（例えば、半径の小さな湾曲部を複数含んでいてもよい）。
図４Ａ～図４Ｇは、図１Ａ～図３Ｂのカートリッジの試験ウェル内、または本明細書に記載の別の適切な標的検出カートリッジの試験ウェル内もしくはチャネル内で使用することのできる様々な電極の構成の例を示す。図４Ａ～図４Ｇに示す試験ウェルは円形であるが、別の例では、別の形状の試験ウェル内でこれらの電極を使用することができる。特に断りのない限り、図４Ａ～図４Ｇの黒丸は、本明細書で開示される電極と、該電極につながるコンダクタとの接点を表す。以下で使用する「幅」は、図４Ａ～図４Ｇのページの水平方向に沿った寸法を指し、以下で使用する「高さ」は、図４Ａ～図４Ｇのページの垂直方向に沿った寸法を指す。特定の方向で図示された図４Ａ～図４Ｇで示される電極は、別の実装では回転した方向であってもよい。さらに、本明細書で開示される寸法の例は、電極構成400A～400Gの実装における特定の例を表したものであり、様々な変形例では、提示した一例としての寸法間の比率に従った異なる寸法であってもよい。図４Ａ～図４Ｇに示す電極は、白金、金、鋼鉄および錫を含む適切な材料から作製することができる。実験による試験おいて、錫および白金は、特定の試験設定および試験標的に対して同様に適切に機能した。
図４Ａは第１の電極構成400Aを示したものであり、第１の電極405Aおよび第２の電極405Bは、それぞれ半円の外周として形成されている。第１の電極405Aの直線状の縁部は、第２の電極405Bの直線状の縁部に隣接し、構成400Aの幅に沿った間隙により隔てられている。この間隙は、電極の半円の半径より大きい。したがって、第１の電極405Aおよび第２の電極405Bは、鏡合わせになった２つの半円の外周として配置されている。第１の電極構成400Aの一例において、第１の電極405Aと第2の電極405Bが最も接近している部分の間隙は約26.369mmであり、第１の電極405Aおよび第２の電極405Bの（直線状の縁部に沿った）高さはそれぞれ約25.399mmであり、第１の電極405Aおよび第２の電極405Bの半円の半径はそれぞれ約12.703mmである。
図４Ｂは第２の電極構成400Bを示す。第１の電極構成400Aと同様に、第２の電極構成400Bの第１の電極410Aおよび第２の電極410Bは、それぞれ半円の外周として形成され、直線状の縁部同士が向かい合った鏡合わせの半円の外周として配置されている。第２の電極構成400Bの第１の電極410Aおよび第２の電極410Bは、第１の電極構成400Aの第１の電極405Aおよび第２の電極405Bと同じ大きさであってもよい。第２の電極構成400Bにおいて、第１の電極410Aと第２の電極410Bとの間の、構成400Bの幅に沿った間隙は、第１の電極410Aおよび第２の電極410Bの半円の半径よりも小さい。第２の電極構成400Bの一例において、第１の電極410Aと第２の電極410Bとが最も接近している部分の間隙は約10.158mmであり、第１の電極410Aおよび第２の電極410Bの（直線状の縁部に沿った）高さはそれぞれ約25.399mmであり、第１の電極410Aおよび第２の電極410Bの半円の半径はそれぞれ約12.703mmである。
図４Ｃは、第１の線状電極415Aおよび第２の線状電極415Bを有する第３の電極構成400Cを示し、第１の線状電極415Aと第２の線状電極415Bは、構成400Cの幅に沿った間隙により隔てられており、この間隙の幅は、電極415Aおよび415Bの高さとほぼ等しい。電極415Aおよび415Bの幅は、これらの電極の高さの約２分の１から３分の１である。第３の電極構成400Cの一例において、第１の電極415Aと第２の電極415Bとが最も接近している部分の間隙は約25.399mmであり、第１の電極415Aおよび第２の電極415Bの高さもそれぞれ約25.399mmであり、第１の電極415Aおよび第２の電極415Bの幅はそれぞれ約10.158mmである。第１の電極415Aおよび第２の電極415Bの端部は丸みを帯びていてもよく、例えば、約5.078mmの半径を有していてもよい。
図４Ｄは、第１の方形電極420Aおよび第２の方形電極420Bを有する第４の電極構成400Dを示し、第１の方形電極420Aと第２の方形電極420Bとは、構成400Dの幅に沿った間隙により隔てられており、この間隙の幅は、電極420Aおよび電極420Bの幅とほぼ等しい。第４の電極構成400Dの一例において、第１の電極420Aと第２の電極420Bとが最も接近している部分の間隙は約20.325mmであり、第１の電極420Aおよび第２の電極420Bの高さはそれぞれ約23.496mmであり、また第１の電極420Aおよび第２の電極420Bの幅はそれぞれ約17.777mmである。
図４Ｅは、第１の線状電極425Aおよび第２の線状電極425Bを有する第５の電極構成400Eを示し、第１の線状電極425Aと第２の線状電極425Bは、構成400Eの幅に沿った間隙によって隔てられており、この間隙の幅は、電極425Aおよび425Bの高さとほぼ等しい。第５の電極構成400Eは、第３の電極構成400Cと同様であるが、電極425Aおよび425Bの高さは同じであるものの、その幅は、電極415Aおよび415Bの幅の約２分の１から３分の２になっている。第５の電極構成400Eの一例において、第１の電極425Aと第２の電極425Bとが最も接近している部分の間隙は約25.399mmであり、第１の電極425Aおよび第２の電極425Bの高さもそれぞれ約25.399mmであり、第１の電極425Aおよび第２の電極425Bの幅はそれぞれ約5.078mmである。第１の電極425Aおよび第２の電極425Bの端部は丸みを帯びていてもよく、例えば、約2.542mmの半径を有していてもよい。
図４Ｆは、同心の環状電極430Aおよび環状電極430Bを有する第６の電極構成400Fを示す。第６の電極構成400Fは、図１Ｄの試験ウェル175で示した構成と同じである。内側電極430Bは、試験ウェルの中心に配置されていてもよい円板形状または円形状の電極であってもよい。外側電極430Aは、内側電極430Bと同心になるよう形成されており、間隙によって内側電極430Bから隔てられた半円形の電極であってもよい。第６の電極構成400Fにおいて、この間隙は、内側電極430Bの半径とほぼ等しい。外側電極430Aの半円の切れ目は、導電性リードが内側電極430Bを電流供給コンダクタに接続する箇所に位置している。第６の電極構成400Fの一例において、環状の第１の電極430Aの内周縁と円形の第２の電極430Bの外周の間の間隙は約11.430mmであり、円形の第２の電極430Bの半径は約17.777mmであり、第１の環状電極430Aの環の厚さは約5.080mmである。第１の電極430Aの端部は丸みを帯びていてもよく、例えば、約2.555mmの半径を有していてもよい。また、第１の電極435Aの環の開放端の間の間隙は、一方の頂部から他方の頂部までで約28.886mmであってもよい。
図４Ｇは、同心の環状電極435Aおよび環状電極435Bを有する第７の電極構成400Gを示す。図４Ｆの実施形態と同様に、内側電極435Bは、前記内側電極430Bと同一の半径を有する円板形状または円形状の電極であってもよく、試験ウェルの中心に配置されていてもよい。外側電極435Aは、内側電極435Bと同心になるよう形成されており、間隙によって内側電極435Bから隔てられた半円形の電極であってもよい。第７の電極構成400Gにおいて、この間隙は、内側電極435Bの半径より大きく、例えば、２倍から３倍の大きさである。これに応じて、外側電極435Bの半径は、前記外側電極430Bの半径より大きい。第７の電極構成400Gの一例において、環状の第１の電極435Aの内周縁と円形の第２の電極435Bの外周の間の間隙は約24.131mmであり、円形の第２の電極435Bの半径は約17.777mmであり、環状の第１の電極435Aの環の厚さは約5.080mmである。第１の電極435Aの端部は丸みを帯びていてもよく、例えば、約2.555mmの半径を有していてもよい。また、第１の電極435Aの環の開放端の間の間隙は、一方の頂部から他方の頂部までで約46.846mmであってもよい。
図４Ａ～図４Ｅの実施形態において、一方の電極を励起電極として使用することができ、他方の電極を信号電極として使用することができる。図４Ｆおよび図４Ｇの実施形態では、内側電極430B、435Bは励起電極として使用されるように構成されており（例えば、電流源に接続されており）、外側電極430A、435Aは信号電極として使用されるように構成されている（例えば、外側電極の信号を、メモリまたはプロセッサに提供する）。いくつかの試験例において、図４Ａ～図４Ｇで示される構成のうち、第６の電極構成400Fにおいて最も高い性能が示された。
図５Ａは、図１Ａ～図３Ｂのカートリッジの試験ウェル内、または本明細書に記載の別の適切な標的検出カートリッジの試験ウェル内もしくはチャネル内において、互いに間隔を空けて配置されてもよい第１の電極すなわち励起電極と第２の電極すなわち信号電極を示す。
例えば、図１Ａ～図３Ｂのカートリッジの試験ウェル内での増幅プロセス中に、凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されると、チャネルを通して送られる１つ以上の電気信号の波形の特性に影響を及ぼす場合がある。図５Ａに示すように、第１の電極すなわち励起電極510Aは、第２の電極すなわち検知電極510Bとは間隔を空けて試験ウェル505内に配置されている。試験ウェル505は、増幅プロセスに供される試験液を収容することができる。この増幅プロセスの全体またはその一部において、励起電圧515を励起電極510Aに供給することができ、この励起電極から、ウェル505内の流体（好ましくは液体の全体または実質的にその全体）に励起電圧515を送ることができる。
液体試料を通して減衰した励起電圧（抵抗ＲおよびリアクタンスＸとして模式的に示す）は、検知電極510Bで検知または検出される。この流体は、励起電極510Aおよび検知電極510Bと直列になった抵抗器Ｒとして作用する。この流体はさらに、リアクタンスＸによって示されている直列コンデンサとしても作用する。試験の全体またはその一部において検知された生の信号は、プロット520に示すような、振幅が変化する正弦曲線として経時的に表すことができる。
励起電圧515は、所定の駆動周波数の交流電流であってもよい。選択された特定の周波数は、例えば、検出を行う特定の標的、試験試料の培地、増幅プロセスの成分の化学的組成、増幅プロセスの温度および／または励起電圧に依存することがある。図１Ａ～図３Ｂのカートリッジのいくつかの実施形態では、励起駆動周波数は、可能な限り低い励起電圧において1kHz～10kHzの範囲であってもよい。一例を挙げると、５％全血に加えたインフルエンザ菌（H. Influenzae）（１反応あたり106コピー）を標的として同定するために実施した試験では、励起センサの駆動周波数は、0.15Vにおいて100Hz～100,000Hzの範囲で変動した。この試験から、所望の「信号のクリフ」、すなわち、試験試料が陽性であることを示す信号の一部におけるアーチファクト（これについての詳細は後述する）は、100Hz未満の周波数で容易に検出することができ、1kHz～10kHzの範囲において最も容易に検出できることが明らかになった。さらに、1kHz～10kHzの範囲の周波数を用いた場合、12分間の試験時間内に信号のクリフを同定することができるため、有利である。信号のクリフを迅速に同定できれば、試験時間の短縮につながり、これによって試験結果を迅速に提供することが可能となり、１日あたりに実施できる試験数が多くなるため、有益である。1kHz未満の周波数では、（陽性試料において信号のクリフが見出されうる）信号のリアクタンス成分は、漸次減少した。同様に、性能を最適化するため、すなわち信号のクリフの検出能力を最適化するため、その他の試験に応じてセンサの駆動周波数も微調整することができる。信号のクリフの検出能力とは、陽性試料と陰性試料を一貫して識別できる能力を指す。
図５Ｂは、検知電極510Bによって提供される生信号520から抽出することのできるインピーダンス信号530を示すプロット525の一例を示す。インピーダンス信号530は、試験ウェルの電気インピーダンスＺを経時的に表したものである。インピーダンスＺは、デカルトの複素数方程式によって次式で表すことができる。
Z = R + jX
（ここで、Ｒは、試験ウェルの抵抗を表し、上記の方程式の実数部分であり、Ｘは、試験ウェルのリアクタンスを表し、上記の方程式の虚数部分（ｊで示す）である。）したがって、試験ウェルのインピーダンスは、抵抗ＲとリアクタンスＸの２つの成分に分解することができる。
まず、抵抗Ｒの値は、増幅プロセスに先立って、またはその開始時に、試験ウェルのベースライン測定を行うことによって決定できる。試験液の抵抗は、試験の実施中にこのベースライン値から離れることもあるが、試験液の抵抗に基づき検知電極510Bによって検知される電流は、励起電極510Aによって提供される信号と同位相になりうる。したがって、抵抗の変動またはズレは、生信号520の同位相成分の経時的な値によって同定することができる。リアクタンスは、試験液のインダクタンスもしくは試験液の静電容量またはこれらの両方の効果を受けて発生する場合があり、これらの効果によって試験液が一時的に電流（例えば、励起電極510Aによって供給された電子）を保持することがある。しばらくすると、この保持されていた電流は、試験液から検知電極510Bへと流れ込む。この遅延により、試験液のリアクタンスに基づき検知電極510Bによって検知された電流は、試験液の抵抗に基づいて検知された電流とは異位相となりうる。したがって、試験液のリアクタンス値は、生信号520の異位相成分の経時的な値によって同定することができる。リアクタンスは、試験の実施中に、増幅プロセスによる試験液の化学的成分の変化に基づいて変動することがある。陽性試料であることを示す信号のクリフ（例えば、閾値率もしくは閾値量におけるリアクタンスの上昇または下降、閾値率もしくは閾値量を超えたリアクタンスの上昇または下降、および／または所定の時間枠内のリアクタンスの上昇または下降）は、リアクタンスＸにおいて見出すことができる。
試験中、励起電極510Aは、ある程度の振幅および電圧によりで正弦波励起することができる。励起電極510Aは、抵抗器Ｒと見なすことのできるウェル内で試験液と直列になっている。抵抗器（例えば、試験液）と電極により分圧器が形成され、この分圧器の電圧は、抵抗器と電極の化学的性質／インピーダンスの比率によって決まる。この分圧器により発生した電圧は、検知電極510Bで検出され、検知された電圧の波形は、複素インピーダンス信号530を示す。いくつかの実施形態において、インピーダンス信号530のような曲線が生成されないこともあるが、本明細書で述べるように、生の検知信号520を抵抗成分とリアクタンス成分に分解することができる。インピーダンス信号530は、経時的な試験液の抵抗と試験液のリアクタンスを示す曲線の一例として提示される。複素インピーダンス信号530は、直角位相変調波形（例えば、試験液の抵抗に起因する同位相波形と、試験液のリアクタンスに起因する異位相波形との組み合わせ）として解釈することができ、この波形において、同位相成分と異位相成分は、変調周波数を大きく上回る時間スケールで変化する。同位相波形は、複素インピーダンスの合成波形と同位相である。いくつかの実装では、生の信号520から同位相成分と異位相成分を抽出し、それらの振幅と位相を計算するために、例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）内に乗算器およびローパスフィルタを有する同期検出器を使用することができる。
インピーダンス信号530（または生の検知信号520）を、それを構成する抵抗成分とリアクタンス成分とに分解するために、検知電極510Bの電圧波形520を、ナイキスト周波数よりも速い周波数（例えば、励起電圧の最高周波数の２倍）でサンプリングし、次いで、同位相成分（抵抗）と異位相成分（リアクタンス）とに分解する。既知の直列抵抗（例えば、Ｒの値）を使用してインピーダンスの実数成分（抵抗）とインピーダンスの虚数成分（リアクタンス）とを計算することによって、同位相の電圧成分と異位相の電圧成分を算出することができる。
図５Ｃは、陽性試験の一例に基づいて生成された生の信号520から抽出した抵抗成分540Aとリアクタンス成分540Bの経時的な（t=3分～t=45分）プロット541を示す。図中、信号のクリフ545は、特定の時間枠TWにおけるリアクタンス540Bの変化ΔRを示す。信号のクリフ545は、陽性試料であることを示している。信号のクリフ545が発生するよりも前の時間において、リアクタンス曲線540Bは比較的平坦または安定しており、信号のクリフ545よりも後ろのリアクタンス曲線540Bも、比較的平坦または安定な状態である。したがって、この実施形態において、プロット541で示されたような、特定の試験パラメータに対する信号のクリフ545は、予測された領域535内におけるΔRの低下として生じる。
陽性試料の信号のクリフ545に対応するリアクタンスの変化量ΔR、ならびに信号のクリフ545が生じると予測される特定の時間枠TWの位置および／またはその持続時間は、試験の複数のパラメータに応じて変動しうる。このようなパラメータとして、試験の対象となる特定の標的（例えば、その標的の増幅速度）、励起電圧の周波数、励起電極および検知電極の構成（例えば、各々の形状および寸法、電極同士を隔てる間隙ならびに電極の材料）、サンプリング速度、試験開始時に供給される増幅剤の量、増幅プロセスの温度ならびに試料中に存在する標的の量が挙げられる。いくつかの実施形態では、陽性試料と陰性試料とを識別するために、例えば実験などによりあらかじめ決定された陽性試料の信号のクリフの予測される特性を使用することができる。いくつかの実施形態において、信号のクリフの予測される特性を使用して、例えば特定の信号クリフの特性と試料中の標的の特定の初期量との相関を調べることによって、病状の重症度または進行を判定することができる。試験カートリッジの検知電極から信号を受信するように構成された読取装置に対して、あらかじめ決定されたこのような予測される特性を提供し、この読取装置に格納しておくことで、試験結果の決定の際に、この読取装置からこれらの予測される特性にアクセスすることができる。
所定の試験において、陽性試料におけるリアクタンスの変化ΔRの予測量、および信号のクリフ545の予測時間枠TWは、陽性対照試料（および任意で陰性対照試料）によって得られたリアクタンス曲線をモニタリングおよび分析することによって実験的に決定することができる。いくつかの実施形態において、信号のクリフに影響を及ぼす試験パラメータを変化させて微調整することによって、正確に識別可能な信号のクリフに相当するパラメータを同定することができる。本明細書に記載の読取装置およびカートリッジは、試験の構成に適合するように構成することができ、この試験において予測される信号クリフの特性を、この読取装置およびカートリッジに提供することができる。
例えば、インフルエンザ菌の実験による一連の試験において、実験前の試験液は、増幅プライマーを含み、ここに1,000,000コピーの標的を加えた。励起電圧は200mV P2Pであり、試験パラメータとして、励起電流の周波数を10kHzのスイープスタートおよび10MHzのスイープストップとし、電極間の間隙は、狭いもので2.55mm、広いもので5mmとした。増幅温度は65.5℃に設定し、２組の電極（間隙の狭い１組の電極と間隙の広い１組の電極）には白金電極を含めた。低周波（10kHz～100kHz）において、間隙が5mmの電極構成を使用した場合、検出可能な信号のクリフは、約10kHzでは増幅開始から約23分、約100kHzでは約30分から始まると同定され、リアクタンスの変化量は、10kHzで約3.5～4オームであり、100kHzでは約3.25～3.5オームまで低下した。また、低周波（10kHz～100kHz）において、間隙が2.5mmの電極構成を使用した場合、検出可能な信号のクリフは、約10kHzでは増幅開始から約25分、約100kHzでは約30分で始まると同定され、リアクタンスの変化量は、約3.5～4オームであった。高周波では、信号のクリフのリアクタンスの低下は小さくなり、増幅プロセスにおいて、この小さな信号クリフが同定された時間は遅延した。したがって、この例において、試験カートリッジ内の試験ウェルは、電極間隙5mmとして構成してもよく、読取装置は、増幅中の試験カートリッジに10kHzの励起電流を供給するように構成してもよい。この励起電流を供給し、増幅プロセスの全体を通して、あるいは予測される信号クリフが発生する時間（ここでは23分）の周辺の時間枠（例えば20分～35分）において、試験ウェルで生じるリアクタンスをモニタリングするように読取装置に指示を出すことができる。また、増幅開始から約23分、あるいは予測される信号クリフが発生する時間の周辺の時間枠において、約3.5～4オームの変化を示すリアクタンスに基づき、陽性試料を同定するように読取装置に対して指示を出すこともできる。
同定されたΔR値とTW値は、その特定の試験において陽性試料と陰性試料とを識別するために、読取装置に提供することができる。いくつかの例において、そのような装置は、信号のクリフ545が生じると同定された時間枠TW内において、リアクタンス曲線540Bが、信号のクリフに相当する要求値および／または傾斜を有するか否かを判定することができる。別の実施形態において、読取装置は、リアクタンス曲線の形状を経時的に分析することによって、このリアクタンス曲線に信号のクリフが含まれるか否かを判定することができる。いくつかの実施形態において、読取装置は、信号のクリフ545が生じると予測された同定された時間枠TWに基づいて、試験手順を変更することができ、例えば、この時間枠内においてのみ励起電圧を供給し、生じた信号のモニタリングを行うことによって、試験時間の全体においてモニタリングを継続する場合よりも電力と処理資源を節約することができるという利点がある。
図５Ｄは、陽性対照および陰性対照の試験例において、検知電極510Bの生の検知データから抽出された抵抗成分およびリアクタンス成分のプロット551を示す。具体的に言えば、プロット551は、35分間の試験時間における、陽性試料の抵抗値を示す曲線550A、陽性試料のリアクタンス値を示す曲線550B、陽性試料の抵抗値を示す曲線550C、および陽性試料のリアクタンス値を示す曲線550Dを示す。この図５Ｄに示すように、陽性試料の信号のクリフは試験開始後約17分で生じ、この信号のクリフが発生するまでのリアクタンス曲線550Bは、比較的平坦で安定している。対照的に、同じ時間において、陰性試料のリアクタンス曲線550Dに信号のクリフは見られず、t=8分付近から試験終了時まで、二次曲線が維持されている。
図５Ｅは、陽性試験の一例に基づいて生成された生の信号520から抽出した抵抗成分560Aおよびリアクタンス成分560Bの経時的なプロット561を示す（増幅開始後t=0分～t=60分）。図中、信号のクリフ565は、特定の時間枠TWにおけるリアクタンス560Bの変化量ΔRを示す。信号のクリフ565は、陽性試料であることを示している。信号のクリフ565が発生する前の時間において、リアクタンス曲線560Bは比較的平坦または安定しており、信号のクリフ565が発生した後のリアクタンス曲線560Bも、わずかな凹みがあるものの、比較的平坦または安定している。プロット561によって示された、特定の試験パラメータに対する信号のクリフ565は、予測された領域535内でピーク、スパイクまたは釣鐘状の曲線として発生し、この予測された領域内におけるリアクタンスの値は、概ね放物線を描きながら変化量ΔRの分だけ上昇または下降している。本明細書で述べるように、特定の試験パラメータ（例えば、試験ウェルの構成、増幅成分の化学的性質および最初の量、標的、ならびに励起電流の特性）を変化させることで、陽性試料から得られる信号のクリフの形状を変化させることができる。したがって、いくつかの実施形態において、時間に対してプロットしたリアクタンス値の曲線における「信号のクリフ」の形状は、試験ごとに変化しうる。ただし、特定の試験では、その試験で用いる陽性試料のいずれに対しても、曲線の形状および／または信号のクリフの発生タイミングは、リアクタンスの変化および／またはタイミングパラメータと一致する。図６は、本明細書に記載のカートリッジ（例えばカートリッジ100または300）とともに使用することのできる読取装置600の一例の略ブロック図を示す。読取装置600は、メモリ605、プロセッサ610、通信モジュール615、ユーザインターフェース620、ヒーター625、電極インターフェース630、電圧源635、圧縮空気貯蔵部640、モータ650、およびカートリッジを挿入できるキャビティ660を含む。
試験カートリッジ100が読取装置に挿入されると、カートリッジの電極インターフェース135が読取装置600の電極インターフェース630と接続される。これにより、読取装置600は、例えば通信経路が確立されたか否かを試験することによって、カートリッジが挿入されたことを検出することができる。さらに、そのような通信により、読取装置600は、挿入された特定の試験カートリッジ100を特定し、対応する試験プロトコルにアクセスすることができる。試験プロトコルには、試験の実行時間、試験中の温度、陽性試料のインピーダンス曲線の特性、および得られた様々な試験結果に基づいてユーザに対して出力すべき情報が含まれうる。別の実施形態において、読取装置600は、ユーザインターフェース620を介して、（例えば、ユーザにより「試験開始」というコマンドが入力されたり、任意で試験カートリッジ識別子を入力することによって）カートリッジが挿入されたという指標を受信することができる。
メモリ605は、読取装置600の作動を制御するための、コンピュータにより実行可能な命令と、読取装置600の使用中に生成されたデータとを格納するように構成された１つ以上の物理的電子記憶装置を含む。例えば、メモリ605は、電極インターフェース630に接続された検知電極からのデータを受信し格納することができる。
プロセッサ610は、例えばユーザインターフェース620を管理し、ヒーター625を制御し、通信モジュール615を制御し、電圧源635と圧縮空気640とモータ650を作動させることによって、コンピュータにより実行可能な命令を実行して試験中に読取装置600の作動を制御するための１つ以上のハードウェアプロセッサを含む。試験操作の一例を、図７Ａを参照して以下で説明する。プロセッサ610は、コンピュータにより実行可能な命令に従って、例えば以下で説明する図７Ｂのプロセスを実行することによって、挿入された試験カートリッジの励起電極から受信したデータに基づいて試験結果を決定するように構成することもできる。さらに、プロセッサ610は、単一のカートリッジ内の異なる試験ウェルから受信した信号に基づいて同一の試験試料中の異なる標的を同定するように構成することもでき、あるいは、異なる複数の試験ウェルから得た信号の個別分析または集約分析に基づいて単一の標的を同定することができる。
通信モジュール615は、読取装置600内に設けることができ、ネットワーク対応のハードウェア部品、例えば、読取装置600と遠隔演算装置の間でネットワークを介して通信するための、有線または無線のネットワーク部品を含んでいてもよい。適切なネットワーク構成部品としては、WiFi、ブルートゥース、セルラーモデム、イーサネットポート、USBポートなどが挙げられる。ネットワークを介した通信が可能であることによって、読取装置600は、ネットワークを介して試験結果およびその他の試験データを所定の遠隔演算装置に送信することができるため有益であり、このような遠隔演算装置として、例えば、電子カルテを格納している病院の情報システムおよび／または検査室の情報システム、国立健康機関のデータベース、ならびに臨床医またはその他の所定の医療従事者の演算装置などが挙げられる。例えば、試験結果が読取装置によって判定されると、特定の患者の試験結果を医師自身のモバイル機器、ノートパソコンまたは診察室のデスクトップパソコンで受信することができるため、より短時間で診断および治療計画を提供することができる。さらに、ネットワークを介した通信が可能であることから、読取装置600は、ネットワークを介して遠隔演算装置から、例えば、既存の試験用の更新された信号のクリフのパラメータ、新しい試験用の新しい信号のクリフのパラメータ、更新された試験プロトコルまたは新しい試験プロトコルなどの情報を受信することができる。
ユーザインターフェース620は、ユーザに試験結果およびその他の試験情報を提示するためのディスプレイと、ユーザが読取装置600にコマンドや試験データを入力するための入力装置（例えば、ボタンやタッチディスプレイなど）を含んでいてもよい。
ヒーター625は、挿入されたカートリッジを増幅プロセスの所望の温度まで加熱するためのキャビティ660に隣接して配置することができる。ヒーター625は、キャビティ660の片側に図示されているが、いくつかの実施形態において、キャビティはヒーター625で囲まれていてもよい。
本明細書で述べるように、電圧源635は、挿入された試験カートリッジの励起電極それぞれに、所定の電圧および周波数の励起信号を供給することができる。圧縮空気貯蔵部640を使用して、チャネル645を経由して試験カートリッジ100の空気インターフェース160へと空気圧を供給することによって、試験カートリッジ内の液体の流れを促すことができる。圧縮空気貯蔵部640は、あらかじめ圧縮空気を貯蔵しておくこともでき、読取装置600の要求に応じて圧縮空気を生成することもできる。別の実施形態において、貯蔵または生成された圧縮空気の代わりに、その他の適切な空気ポンプおよび圧力供給機構を使用してもよい。モータ650は、前述したように、挿入されたカートリッジのブリスターパック140を破裂させるために、アクチュエータ655を移動させてブリスターパックに近づけたり、ブリスターパックから遠ざけたりするように作動させることができる。
図７Ａは、本明細書に記載の試験中に読取装置を作動させるためのプロセス700の一例のフローチャートを示す。プロセス700は、前述した読取装置600によって実行することができる。
ブロック705において、読取装置600は、例えば、ユーザの入力に応じて、または挿入されたカートリッジとの信号経路の確立に応じて、分析カートリッジ100、200、300が挿入されたことを検出できる。いくつかの実施形態において、分析カートリッジ100、200、300は、読取装置600に対して、実施する試験を特定する情報要素を含むことができ、試験プロトコル情報を含んでいてもよい。
ブロック710において、読取装置600は、増幅のための所定の温度までカートリッジ100、200、300を加熱することができる。例えば、この温度は、カートリッジ100、200、300に格納された情報によって設定されてもよく、あるいはカートリッジ100、200、300の挿入の判定に応じて読取装置600の内部メモリにアクセスして設定することもできる。
ブロック715において、読取装置600は、例えばモータ650とアクチュエータ655からなるブリスターパック穿刺機構を作動させることができる。ブリスターパックを穿刺すると、あらかじめ密封したチャンバーから、増幅促進用の化学成分を含む液状内容物が放出される。
ブロック720において、読取装置600は、空気ポンプを作動させることによって、カートリッジの流路を通して、試料と液体をブリスターパックから試験ウェルへと移動させることができる。前述したように、カートリッジの流路を介して液体を押すことにより、トラップされた空気を逃がすことが可能な通気孔を試験ウェルに設けてもよい。空気ポンプは、圧縮空気640または別の適切な圧力源を含むことができ、空気インターフェース160と流体連通することができる。
ブロック725において、読取装置600は、例えば、ある特定の抵抗が検知されるまでカートリッジの流路を介して液体を押すことによって（例えば、通気孔に設けられた液体不透過性かつ気体透過性のフィルタに向かって流路中の液体を押すことによって）、トラップされた空気を試験ウェルから放出することができる。また、ブロック725は、トラップされた空気またはその他の気体の気泡が液体中を移動して通気孔から放出されるように、挿入されたカートリッジを振盪することを含んでいてもよい。さらに、ブロック725において、読取装置600は、増幅プロセスの混在を回避するため、試験ウェル間に配置されたバルブを閉鎖させる信号をカートリッジに提供してもよい。
判定ブロック730において、読取装置600は、試験が所定の試験時間内にあるか否かを判断することができる。例えば、陽性試料に信号のクリフが現れることが予測される時間枠が既知である場合、その時間枠の終了時、またはその時間枠の終了からある程度の所定時間が経過した後に、試験の実行時間を終了してもよい。試験の実行時間が終了後、プロセス700は、任意の判定ブロック735へと移行するか、あるいは、任意の判定ブロック735が省略される実施形態では、ブロック740へと移行する。
任意の判定ブロック735において、読取装置600は、試験ウェルの検知電極からデータを記録することによって、試験ウェルの増幅をモニタリングすべきか否かを判定する。例えば、読取装置600は、試験の特定の１つの時間枠または複数の時間枠において、試験ウェルのインピーダンスのモニタリングのみを行うという命令を受信してもよい。読取装置600が試験ウェルの増幅のモニタリングを行わないと判定した場合、プロセス700は判定ブロック730に戻る。
読取装置600が試験ウェルの増幅をモニタリングすると判定した場合、プロセス700は、ブロック740へと移行する。ブロック740において、読取装置600は、挿入されたカートリッジの試験ウェルの励起電極に励起信号を提供する。前述したように、この励起信号は、特定の周波数および電圧の交流電流であってもよい。
ブロック745において、読取装置600は、挿入されたカートリッジの試験ウェルの検知電極からデータを検出し、記録する。いくつかの実施形態において、このデータは後続の分析のために、例えば試験終了後に分析を行うために格納することができる。いくつかの実施形態において、読取装置600は、リアルタイムで（例えば、試験が行われている最中に）このデータを分析することができ、陽性試料の信号クリフが同定されれば、試験を終了してもよい。
ブロック730において、読取装置600が、試験が指定された実行時間内にないと判定した場合、プロセス700はブロック750に移動し、試験データを分析し、試験結果を出力する。試験結果は、試験した試料において標的が陽性であるのか、それとも陰性であるのかという表示を含むことができ、より具体的には、試験した試料中の標的の推定量を示すこともできる。
図７Ｂは、本明細書の記載に従って、標的を検出するために試験データを分析するためのプロセスの一例のフローチャートを示し、このプロセスは、図７Ａのブロック750として読取装置600により実行することができる。
ブロック755において、読取装置600は、ウェルの電極から受信されて記録された信号データにアクセスすることができる。カートリッジに複数のウェルがある場合も、各ウェルからのデータを個別に分析することができる。各ウェルから得た試験結果を後に集約的に分析して、カートリッジ内で行われたすべての試験に基づいた単一の標的に対する単一の試験結果の判定を行ってもよく、複数の標的に対する複数の試験結果の判定を行ってもよい。
ブロック760において、読取装置600は、試験中の様々な時点のすべてまたはその一部で得られた信号を、抵抗成分とリアクタンス成分へと分解することができる。例えば、前述したように、読取装置600は、サンプリングされた生の電圧波形の同位相成分および異位相成分を各時点において判定し、次に、この電気回路の既知の直列抵抗を使用してこれらの成分の畳み込みを解いて、試験ウェルのインピーダンスの同位相（抵抗）部分と異位相（リアクタンス）部分を計算することができる。
ブロック765において、読取装置600は、経時的なリアクタンス値の曲線を作成することができる。さらに、ブロック765において、読取装置600は、経時的な抵抗値の曲線を作成してもよい。
ブロック770において、読取装置600は、リアクタンス曲線を分析することによって、試験が陽性であることを示す信号の変化を特定することができる。図５Ｃの信号のクリフに関して前述したように、読取装置600は、リアクタンスにおいて閾値よりも大きな変化を探したり、所定の時間枠内でのそのような変化を探したり、所定の時間におけるリアクタンス曲線の傾きを分析したり、リアクタンス曲線の全体的な形状の分析により、信号のクリフ（例えば、比較的安定した値が見られた前後での信号の上昇または下降）の有無を判定したりすることができる。
判定ブロック775において、読取装置600は、ブロック770で実施した分析に基づいて、探していた信号の変化がリアクタンス曲線において確認されるか否かを判定することができる。信号の変化が確認された場合、プロセス750はブロック780へと移行して、陽性であるという試験結果の表示をユーザに対して出力する。信号の変化が確認されなかった場合、プロセス750はブロック785へと移行して、陰性であるという試験結果の表示をユーザに対して出力する。試験結果は、局所的に、例えば読取装置のディスプレイ上などにローカル出力することができ、またネットワークを介して指定の遠隔計算処理装置に出力することもできる。
装置の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、励起電極および検知電極を含む装置を含む。いくつかの実施形態において、この励起電極および検知電極により、試料の電気的特性が測定される。いくつかの実施形態において、この電気的特性には、複素アドミタンス、インピーダンス、導電率、抵抗率、抵抗または誘電率が含まれる。
いくつかの実施形態において、前記電気的特性は、測定中に変化することのない電気的特性を有する試料において測定される。いくつかの実施形態において、前記電気的特性は、動的な電気的特性を有する試料において測定される。いくつかの実施形態において、前記動的電気的特性は、リアルタイムで測定される。
いくつかの実施形態において、励起電極に励起信号が印加される。励起信号は直流の電流もしくは電圧および／または交流の電流もしくは電圧を含みうる。いくつかの実施形態において、励起電極は、試料と容量結合され、かつ／または試料を介して容量結合される。いくつかの実施形態において、励起電極および／または検知電極は、試料と電極との直接的な接触を阻止するため、不動態化されている。
いくつかの実施形態において、パラメータは、試料の電気的特性に合わせて最適化される。そのような実施形態のいくつかにおいて、パラメータは、試料の量および／または形状に関する、印加電圧、印加周波数および／または電極構成を含みうる。
いくつかの実施形態において、測定中の励起電圧の電圧および周波数は、固定されていてもよく、変動してもよい。例えば、測定には、検出中に電圧および周波数をスイープすること、または試料ごとに最適化されていてもよい特定の電圧および周波数を選択することが含まれていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の装置のアドミタンスおよび／または試料の特性に応じて変動しうる電流を、励起電圧により信号電極に誘導することができる。
いくつかの実施形態において、検出パラメータの最適化は、電極と試料の結合インピーダンス、試料のインピーダンスおよび電極間の寄生インピーダンスからなる集中定数等価回路を用いて、アドミタンス、本発明の装置および試料のモデリングを行うことによって行われる。集中定数等価回路のパラメータは、本発明の装置に使用される１つまたは複数の励起周波数において、電極と試料からなる系のアドミタンスを測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、電極と試料からなる系の複素数（実数成分と虚数成分によって構成される数）のアドミタンスは、大きさを検出する技術と位相を検出する技術とを使用して測定される。いくつかの実施形態において、検出パラメータの最適化は、幅広い周波数においてアドミタンスを測定することにより、周波数域間の移行に相当する周波数を決定することによって行われる。いくつかの実施形態において、検出パラメータの最適化は、所定の集中定数モデルの数値の演算から周波数域間の移行に相当する周波数を決定することによって行われる。
いくつかの実施形態において、容量結合された電極と試料からなる系のアドミタンスは、３つの周波数領域を含み、すなわち、電極と試料からなる系の結合インピーダンスが支配的となる低周波数領域、試料のインピーダンスが支配的となる中周波数領域、および電極間の寄生インピーダンスが支配的となる高周波数領域を含む。電極と試料からなる結合領域のアドミタンスは、本質的に容量性であり、周波数の増加に伴ってその大きさが直線的に増加するという特徴を示し、その位相は９０°である。また、試料領域のアドミタンスは本質的に導電性であり、周波数が変化してもアドミタンスは大きく変化しないという特徴を示し、その位相は約０°である。また、電極間領域のアドミタンスは本質的に容量性であり、周波数の増加に伴ってその大きさが直線的に増加するという特徴を示し、その位相は９０°である。
いくつかの実施形態において、ピックアップ電極（検知電極）における誘導電流は、励起電圧および複素アドミタンスと次式で表される関係にある。
電流＝（複素アドミタンス）×（電圧）
いくつかの実施形態において、本発明の装置は、励起電圧の大きさと誘導電流の大きさを測定することによって、複素アドミタンスの大きさを決定する。いくつかの実施形態において、本発明の装置は、既知の励起電圧に合わせて較正してから、誘導電流の大きさを測定する。また、本発明の装置は、励起電圧と誘導電流の相対位相差を測定することにより、複素アドミタンスの位相を決定してもよい。
いくつかの実施形態において、前記大きさと前記位相は直接測定される。
いくつかの実施形態において、前記大きさと前記位相は間接的に測定され、例えば、同期検出と非同期検出を利用することにより間接的に測定される。同期検出器により、誘導電流の同位相成分が得られる。また、非同期検出器により、誘導電流の直角位相成分が得られる。これらの成分を組み合わせることにより、複素アドミタンスを決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記電極は不動態化されていない。
いくつかの実施形態において、励起電極および／または検出電極は不動態化されている。励起電極および／または検出電極は、例えば、これらの電極と試料またはその成分の間の望ましくない接着、付着、吸着またはその他の不利益な物理的相互作用を阻止するために不動態化されていてもよい。いくつかの実施形態において、不動態化層は誘電材料を含む。いくつかの実施形態において、不動態化により、電極と試料の効率的な容量結合が可能となる。結合効率は、電極と試料からなる系の特性を測定することにより決定することができ、このような特性として、例えば、不動態化層の誘電特性、不動態化層の厚さ、不動態化層と試料の間の界面の面積、不動態化層の表面の粗さ、試料と不動態化層の間の界面における電気二重層、温度、印加電圧および印加周波数、試料の電気的特性、電極材料の電気的特性および／または化学特性などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、電極間の望ましくない寄生結合を低減するため、前記電極の構成および構造が最適化される。この最適化は、電界シールド、様々な誘電率の電極基材の使用、設計の最適化および／または接地層により達成してもよい。
生体分子検出用装置の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、生体分子などの標的の検出用装置を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、生体分子分析のための検出方法として、試料の電気的特性を測定する。
いくつかの実施形態において、標的は、核酸、タンパク質、小分子、糖鎖、薬物、代謝産物、毒素、寄生虫、完全なウイルス粒子、細菌、芽胞またはその他の抗原であり、これらの標的は、捕捉プローブ部分および／または検出プローブ部分で認識および／または結合してもよい。いくつかの実施形態において、前記糖鎖は、ガレクチンやレクチンなどの、糖鎖に結合するタンパク質により検出することができる。
いくつかの実施形態において、前記標的は核酸である。いくつかの実施形態において、本発明の方法には核酸増幅が含まれる。いくつかの実施形態において、増幅には、LAMP法などの等温増幅が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、反応液の電気的特性またはその変化を測定することにより定量される。いくつかの実施形態において、増幅反応の電気的特性は、反応の経過中にリアルタイムで測定されるか、あるいは反応の前後で測定した電気的特性を比較することによって測定される。
いくつかの実施形態において、例えば、抗体、アプタマー、その他の分子認識部分および／または分子結合部分などの検出プローブの抗原への特異的結合によって標的抗原を検出する。例示的な一実施形態において、検出抗体は、核酸配列に結合することにより、抗体と核酸からなるキメラ複合体を形成する。このキメラ複合体は、抗原の検出を目的とした分析を行う前に合成される。数多くの様々な核酸を単一の抗体に結合させることによって、抗原に結合したキメラ複合体の検出感度を向上させてもよい。抗原に結合しなかった過剰なキメラ複合体を除去した後、キメラ複合体の核酸部分を増幅し、本明細書の記載に従って反応液の電気的特性（またはその変化）を測定することによって増幅反応を定量する。このような方法によって、キメラ複合体を介して抗原に結合した核酸の増幅量から、標的抗原の有無を知ることができるとともに、この抗原を定量することができる。このように、抗原認識に第２の増幅対象を使用し、電気的な検出と組み合わせることによって、その他の抗原検出法よりも簡便に高感度かつ広いダイナミックレンジの検出を行うことができる。
いくつかの実施形態において、抗体、アプタマー、その他の分子認識部分および／または分子結合部分などの、抗原を検出するための捕捉プローブは、結合または連結を介して表面に結合される。捕捉プローブを表面に固相化することによって、結合しなかった過剰な試薬および／または抗原を洗浄により除去することができる。また、このような表面に捕捉された抗原にキメラ複合体を結合させることによって、結合しなかったキメラ複合体を洗浄により除去することができる。このような方法によって、捕捉された抗原のみが保持され、キメラ複合体を介して検出される。図８に、この実施形態の一例を示す。いくつかの実施形態において、捕捉プローブと検出抗体は同じものである。
いくつかの実施形態において、捕捉プローブは、共有結合、ストレプトアビジン－ビオチン結合の利用、または当分野で一般に使用されている公知のその他の生体結合反応および分子固相法によって、表面に固相化される。いくつかの実施形態において、前記表面は、平面、足場、フィルタ、マイクロスフェア、何らかの形状の粒子、ナノ粒子、ビーズなどである。図９に、この実施形態の一例を示す。
磁気ビーズを用いたシステムの概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、磁気ビーズまたはその使用を含む。いくつかの実施形態において、前記マイクロスフェア、粒子またはビーズは、磁気を帯びており、かつ／または磁化することができる。このような実施形態において、磁気支持体を使用することによって、過剰な抗原および／または非特異的に吸着したキメラ複合体の表面からの除去を目的としたビーズの洗浄を容易に行うことができる。磁気粒子支持体の使用を含む方法は、磁気増幅免疫測定法（MAIA）を含んでいてもよい。図１０に、この実施形態の一例を示す。
いくつかの実施形態において、磁気ビーズは標的の捕捉に有用であり、純粋に電気的な試料の処理（MEMS）および／または増幅／検出カートリッジでの処理を行う際の磁気泳動操作に使用され、流体工学における流れ／圧力による移動性への依存を低減または排除することができる。いくつかの実施形態において、磁気ビーズを使用することにより、試料中の標的ゲノム材料を抽出および／または濃縮する。例えば、Tekin, HC., et al., Lab Chip DOI: 10.1039/c3lc50477hを参照されたい（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。本明細書で提供する実施形態において有用な自動マイクロ流体処理プラットフォームは、Sasso, LA., et al., Microfluid Nanofluidics. 13:603-612に記載されている（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。本明細書で提供する実施形態において有用なビーズの例として、核酸IVD用Dynabeads（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）またはDynabeads（登録商標）SILANE Viral NAキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられる。
fC 4 Dにおける励起および検出の一例の概要
いくつかの実装において、本明細書で開示する装置、システムおよび／または方法では、fC4Dを用いたアプローチを利用して、核酸増幅をリアルタイムでモニタリングする。したがって、１つ以上の位相感応導電率測定によって、試料中に１種以上の標的が存在することが示されてもよい。
いくつかの態様において、特定の駆動電圧値で周波数を迅速にスイープすることによって、増幅に関連する試料の導電率が最大となる最適励起周波数（fopt）を決定する方法が提供される。この最適励起周波数（fopt）において、センサの出力は、励起電圧と誘導電流の間の相対位相差の最小値に相当することを利用することによって、導電率の測定を介して高感度な生体分子の定量を行うことができる。
いくつかの実装において、fC4D検出システムは、少なくとも２つの電極を使用する。これら２つの電極は、核酸増幅が行われるマイクロチャネルと比較的近接して配置される。２つの電極のうちの一方に交流信号が印加される。交流信号が印加される電極は、マイクロチャネルを介して、これら２つの電極のうちの第２の電極に容量結合されてもよい。したがって、いくつかの態様において、第１の電極は信号電極であり、第２の電極は信号電極である。
一般に、信号電極で検出される信号は、信号電極に印加された交流信号と同一の周波数であるが、その大きさは印加された信号よりも小さく、負の位相にシフトしている。次に、ピックアップ電流を増幅してもよい。いくつかの態様において、ピックアップ電流は電圧に変換される。いくつかの態様において、電圧は整流される。いくつかの態様において、整流された電圧はローパスフィルタを使用してDC信号に変換される。このDC信号のバイアスをゼロにして、データ収集（DAQ）システムへと送り、さらに処理を行ってもよい。
前述の系は、一連のコンデンサと抵抗器で表してもよい。チャネル内での核酸増幅中に生じる導電率の変化により、この系全体のインピーダンスが低下し、生成するピックアップ信号の大きさが増加しうる。このような、得られる出力信号の大きさの変化は、DAQシステムにおいて１つ以上のピークとして現れうる。
信号の生成用および復調用の電子部品は、回路により実装される。例えば、プリント回路基板（「PCB」）、ASIC装置またはその他の集積回路（「IC」）は、従来の製造技術および構築技術を使用して作製される。いくつかの態様において、このような電子部品は、その全体または一部が使い捨て部品および／または消耗部品として設計される。このような回路の物理的形状および電気的特性（不動態化層の厚さ、電極パッドの面積、チャネルの断面積および長さ、ならびに絶縁耐性）は、所望の結果を得るために変更可能である。
核酸検出システムの一例は、少なくとも１つのチャネルを含み、チャネルの長さ方向に沿った少なくとも１つの部分において、ｐＨ、光学特性、電気的特性および／または電気的性質などの物理特性を検出し、チャネル内に目的とする特定の核酸および／または目的とする特定のヌクレオチドが含まれるか否かを判定する。
検出システムの一例は、試料および１種以上の検知用化合物（例えば、１種以上の核酸プローブ）を収容するための１つ以上のチャネルと、試料および検知用化合物を前記チャネルに導入するための１つ以上の入口ポートとを含むように構成されており、いくつかの実施形態では、１つ以上の出口ポートを含むように構成されており、この出口ポートから、チャネル内の内容物を取り除いてもよい。
１種以上の検知用化合物（例えば、１種以上の核酸プローブ）は、目的とする核酸および／またはヌクレオチド（試料中に存在する場合）と該検知用化合物の粒子とが直接的または間接的に相互作用することにより形成された凝集塊が、チャネルの長さ方向に沿った少なくとも１つの部分においてｐＨ、光学特性または電気的特性ならびに／または電気的性質を変化させるように選択してもよく、この凝集塊は、チャネル内に懸濁された状態で形成されるか、またはチャネル内に接着することなく形成されることが好ましい。
特定の場合、凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されることによって、チャネル内の流体の流れが阻害または遮断され、その結果、チャネルの長さ方向に沿って測定される導電率および電流の低下が測定されることがある。同様に、このような場合、凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されることによって、チャネルの長さ方向に沿って測定される抵抗率の上昇が測定されることがある。別の特定の場合において、凝集塊、核酸複合体または重合体は導電性であり、好ましくは、この凝集塊は、チャネル内に懸濁された状態で形成されるか、またはチャネル内に接着することなく形成されたものであり、このような凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されることによって、チャネルの長さ方向の少なくとも一部に沿った電気経路が増強され、その結果、チャネルの長さ方向に沿って導電率および電流の上昇が測定されることがある。このような場合、凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されることによって、チャネルの長さ方向に沿って測定される抵抗率の低下が測定されることがある。
特定の場合、凝集塊、核酸複合体または重合体が形成されることによって、チャネルを介して送信される１つ以上の電気信号の波形特性に影響が生じる。例えば、図１１に示すように、第１の電極すなわち励起電極1116と、第２の電極（「ピックアップ」電極または「検知」電極）118は、チャネル1104に沿って互いに間隔を空けて配置されている。図１１は、図５Ａ～図５Ｄを参照しながら説明した前記アプローチの別のアプローチまたは補助的なアプローチを表す。第１の電極1116および第２の電極1118は、チャネル1104内に収容されている測定対象の溶液と接触していなくてもよい。この場合、第１の電極1116と第２の電極1118は、チャネル1104内の溶液と容量結合されている。容量結合の強さは、電極の形状、不動態化層の厚さおよび不動態化層の材料（特にその相対絶縁耐性）に依存する。
いくつかの態様において、測定対象の溶液はチャネル1104に密閉されている。このチャネルは、ミクロンスケールの断面積を有していてもよい。この場合、測定対象の溶液は、その抵抗が溶液の導電率およびチャネル1104の形状に依存する抵抗器として挙動する。
いくつかの実装において、交流電流／電圧が励起電極1116に印加され、誘導電流が信号電極1118で測定される。誘導電流は、電極間のインピーダンスに比例し、このインピーダンスは溶液の導電率に応じて変化しうる。図に示すように、励起電圧1400が励起電極1116に印加され、誘導電流1410が信号電極1118で検出される。
いくつかの実装において、検出感度は、励起周波数に少なくとも部分的に依存する。したがって、いくつかの態様において、誘導電流の位相の絶対値が最小である場合に感度は最大となる。この領域において、チップのインピーダンスは流体のインピーダンスにより支配的に決定される。流体のインピーダンスは、流体の導電率およびチップの形状の関数である。最大検出感度および正確な検出動作を保証するために、複素インピーダンス情報は重要である。
等価回路の集中パラメータモデルの分析から、検出感度が、結合容量の強度（CWALL）、溶液の抵抗（RLAMP）および寄生容量（CX）と密接な関係にあることが示された。具体的に言うと、励起周波数（f）が次式を満たすとき、導電率の変化に対する電極間インピーダンスの変化は最大となる。
Figure 2022516442000002
図１２に示すように、信号のインピーダンスは、励起周波数に依存し、かつチャネル1104内でLAMP反応が起こった後に変化する。さらに、図１２から見て取れるように、左側の平坦でない部分では、この曲線を下回ると結合インピーダンスが支配的になることから、溶液のインピーダンスの変化が実質的に不可視となる周波数領域を定義していてもよい。右側の平坦でない部分では、この曲線を上回ると寄生効果が支配的になることから、電極1116および電極1118が実質的に短絡された状態となる周波数領域を定義していてもよい。
図１３に示すように、両側の極値領域では、コンデンサのようなインピーダンス特性が示され、励起電圧とは異位相である（９０°に近づく）。これら２つの領域の間において、インピーダンスは、単純な抵抗器の限界に近づき始め、インピーダンスの対周波数応答は平坦になる。実際に、最大検出感度は、インピーダンスの位相の最小値に相当する。
同期検出が必要か否かを明らかにするために、単純化モデルにおいて２本の並列電流経路、すなわち、流体チャネルを経由してチップを通る電流と、寄生容量または幾何学的容量とを考慮してもよい。所定の周波数ｆにおける励起信号をＶとした場合、誘導電流Ｉは次式で表される。
Figure 2022516442000003
 （ここで、Yは、流体経路との結合によるチップのアドミタンスであり、Cxは寄生容量であり、jは虚数単位である。）ｊを乗じているのは、寄生経路を通った電流が、励起電圧に対して９０°位相がずれていることを意味する。励起周波数に対して測定した試料チップのインピーダンスを図１４に示す。
同期検出器では、ピックアップ電流に同位相の矩形波ｍを乗じ、次にローパスフィルタに通す。
Figure 2022516442000004
変調信号から９０°ずれた位相の信号の寄与をゼロとする方がより簡単に理解することができるため、この分析では寄生容量は無視することとする。流体経路を通った電流に対する同期検出の効果を確認するため、（寄生容量の寄与を差し引いた）誘導電流に変調波を乗じることができる。
Figure 2022516442000005
 （ここで、|Y|は、アドミタンスの大きさであり、φ=arg（Y）であり、H.F.T.は、（例えば、ｆよりも大きい）高周波項を意味する。）ローパスフィルタを通過させた後、同期出力のDC項が残ることがある。
Figure 2022516442000006
 この式は、
Figure 2022516442000007
 であることに注目すれば単純化することができ、これによって、次式が得られる。
Figure 2022516442000008
 あるいは、
Figure 2022516442000009
 （ここで、バーは複素共役を示す）
であることに注目すれば、前記式を、Zで示されるインピーダンスで表すことができ、したがって、同期検出器の出力は次式となる。
Figure 2022516442000010
チップの単純な回路モデルが与えられれば、インピーダンスは明確に演算され、同期検出器の出力が予測される。
単純な等価回路モデルは、抵抗器Rと直列の２つのコンデンサCを含む。前述したように、抵抗Rは、主にマイクロ流体の形状および溶液の導電率の関数である。静電容量は、主に電極の面積、不動態化層に使用した誘電体および不動態化層の厚さの関数である。単純化された回路のインピーダンスZは、次式で与えられる。
Figure 2022516442000011
 インピーダンスの大きさの２乗は、
Figure 2022516442000012
 であり、
同期検出器の出力は、次式で表される。
Figure 2022516442000013
 （ここで、式の分子および分母には、導電率G＝1/Rの２乗を乗じている。）
導電率計に関して、セル定数ｋは次式で定義されてもよい。
Figure 2022516442000014
 （ここで、ｋは、長さの逆数の単位を有している。）セル定数ｋは、主に電極の配置、面積および流体経路の関数であり、単純な線形関係にはない可能性がある。このときの同期検出器の出力は、次式で表される。
Figure 2022516442000015
Figure 2022516442000016
 であり、したがって、次式となる。
Figure 2022516442000017
検出器の応答が無次元導電率に依存するのであれば、チップと検出器の設計を密接に結合させることが重要である。前述の３点を実際の導電率として言い換えると、以下のようになる。
Figure 2022516442000018
言い換えると、励起周波数を増加させると、同期検出器の出力が線形となる導電率の範囲が広くなる。無次元導電率に対してプロットした同期検出器の応答を図１５に示す。
集中パラメータモデルの妥当性を評価するため、導電率が既知であるKCl溶液に対する検出器応答を測定した。チップのチャネルは２mmであり、その断面積は0.01mm2であった。２つの電極はそれぞれ9mm2であり、SU8フォトレジストで構成された10μｍの層で不動態化されていた。セル定数と静電容量を推定し、検出器の出力の非線形性に相当する導電率が約5mS/cmとなるように励起周波数を選択した。励起周波数を10kHz、15kHzおよび20kHzとして実験を繰り返した。
LAMP法の実施前の化学的状態における導電率を測定したところ、約10mS/cmであった。過去に見出された制約、すなわち、
Figure 2022516442000019
 に依存する検出器の最小周波数の推定値を以下の表１に示す。
Figure 2022516442000020
図１６に示したモデルの結果から、広範囲な導電率および所定の周波数段階に対して検出器の出力がよく一致していることが示されている。各周波数において、同じ２種のパラメータとしてｋおよびＣが使用されていることには注目されたい。このモデルは、検出器の応答の質的挙動を予測するものであり、すなわち、機能形式、応答、および非線形性が生じる臨界導電率の励起周波数に対する依存が予測される。このモデルでは、臨界導電率を超えた後の導電率の周波数依存的な挙動の広がりを過大に評価している。
導電率および壁面の静電容量を迅速に評価するツールとして、フリンジ電界効果以外にも、表面導電率および静電容量効果を無視してもよい。形状ごとの有限要素モデルを用いて、この概算評価をさらに精緻化することができる。
電極は、相対絶縁耐性εｒの誘電体が間に挟まれた厚さtと面積AE有する平行平板電極コンデンサとしてモデル化される。したがって、静電容量は次式で概算される。
Figure 2022516442000021
 （ここで、ε０は誘電率である。）
流体は、断面積AF、長さlおよび導電率σを有する単純な抵抗器としてモデル化してもよい。したがって、流路の導電率は、次式で概算することができる。
Figure 2022516442000022
 この式から、セル定数も概算される。
いくつかの態様において、本発明の装置は、チップが挿入された後、「インピーダンスのスペクトル」を決定するように構成されている。本発明の装置は、デジタル制御された励起周波数を含んでいてもよい。本発明の装置は、周波数を迅速にスイープ可能であってもよい。本発明の装置は、誘導信号の同位相成分および直角位相成分を含んでいてもよく、これらに基づいて複素インピーダンスを決定することができる。インピーダンスのスペクトルの適合度は、カーブフィッティングまたはその他の経験則による方法に少なくとも部分的に基づいて判定され、この判定によって、適切なチップの挿入および／または適切な試料の導入の判定が行われる。いくつかの態様において、本発明の装置は、まず、初回のスイープにより決定された周波数で励起することによって試験される。いくつかの実装において、本発明の装置は、同期検出を利用する検出器を含む。このようにして、（最小位相における）流路に起因する測定された誘導電流をリアルタイムで検出してもよい。
チャネルの一例の概要
いくつかの実装において、チャネルまたは導管は、その寸法として、本発明の検出システムの基板と平行な平面に沿って延びる最長寸法（ｙ軸）に沿って測定される長さ；基板と平行な平面に沿って延びる最長寸法に対して垂直な軸（ｘ軸）に沿って測定される幅；および基板と平行な平面に対して垂直な軸（ｚ軸）に沿って測定される深さを有する。チャネルの一例は、その長さが、その幅および深さよりも実質的に大きくてもよい。いくつかの場合、長さと幅の比率は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１または２０：１であってもよく、あるいはこれらの比率のいずれか２つで定義される範囲内にあってもよい。
いくつかの実施形態において、チャネルまたは導管は、チャネル内で形成される凝集塊、核酸複合体または重合体の直径と実質的に同等以下の深さおよび／または幅を有するように構成されている。これらの凝集塊、核酸複合体または重合体は、チャネル内の懸濁液中で、目的の核酸と、この核酸の検出に使用される検知用化合物（例えば１種以上の核酸プローブ）の粒子との間の相互作用により形成されることが好ましい。
いくつかの実施形態において、チャネルの幅は、ｘ軸に沿って1nm～50,000nmもしくは約1nm～約50,000nmの幅、またはこの範囲内にある２つの数値によって定義される範囲内の幅を有するように構成されているが、これらの例示的な範囲に限定されない。チャネルまたは導管の一例において、その長さは、ｙ軸に沿って10nm～2cmもしくは約10nm～約2cmであるか、またはこの範囲にある２つの数値によって定義される範囲内の長さであるが、これらの例示的な範囲に限定されない。チャネルの一例において、その深さは、ｚ軸に沿って1nm～１ミクロンもしくは約1nm～約１ミクロンであるか、またはこの範囲にある２つの数値によって定義される範囲内の深さであるが、これらの例示的な範囲に限定されない。
いくつかの実施形態において、チャネルまたは導管は、何らかの適切な横断面形状（例えば、ｘ－ｚ平面に沿った断面）を有し、この横断面形状としては、円形、楕円形、長方形、正方形またはＤ字形（等方性エッチングによる）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、チャネルまたは導管の長さは10nm～10cmの範囲であり、例えば、少なくとも10nm、少なくとも50nm、少なくとも100nm、少なくとも200nm、少なくとも400nm、少なくとも600nm、少なくとも800nm、少なくとも1μm、少なくとも10μm、少なくとも50μm、少なくとも100μm、少なくとも300μm、少なくとも600μm、少なくとも900μm、少なくとも1cm、少なくとも3cm、少なくとも5cm、少なくとも7cmもしくは少なくとも10cmであるか、または10nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1μm、10μm、50μm、100μm、300μm、600μm、900μm、1cm、3cm、5cm、7cmもしくは10cmであるか、またはこれらのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、チャネルの深さは1nm～1μmの範囲であり、例えば、少なくとも1nm、少なくとも5nm、少なくとも7nm、少なくとも10nm、少なくとも50nm、少なくとも100nm、少なくとも200nm、少なくとも400nm、少なくとも600nm、少なくとも800nm、少なくとも1μm、少なくとも10μm、少なくとも20μm、少なくとも30μm、少なくとも40μm、少なくとも50μm、少なくとも100μm、少なくとも500μmもしくは少なくとも1mmであるか、または1nm、5nm、7nm、10nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、500μmもしくは1mmであるか、またはこれらのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の深さを有する。いくつかの実施形態において、チャネルの幅は1nm～50μmの範囲であり、例えば、1nm、5nm、7nm、10nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、500μmもしくは1mmであるか、またはこれらのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の幅を有する。
いくつかの実装において、チャネルまたは導管は、カートリッジ内に形成され、その後、本発明の装置に挿入される。いくつかの態様において、カートリッジは使い捨てのカートリッジであってもよい。いくつかの態様において、カートリッジは、コスト効率の良いプラスチック材料から作製される。いくつかの態様において、少なくともカートリッジの一部は、流体工学用の紙材料または積層材料から作製される。
試料中の特定の核酸および／または特定のヌクレオチドの有無を検出するために使用される検出システム2100の一実施形態を図１７Ａ～図１７Ｂに示す。図１７Ａは、このシステムの上面図であり、図１７Ｂはこのシステムの側断面図である。検出システム2100は、実質的に水平なｘ－ｙ平面に沿って延設された基板2102を含む。いくつかの実施形態において、基板2102は、誘電材料、例えばシリカから作製されていてもよい。基板2102の材料の別の例として、ガラス、サファイアまたはダイヤモンドが挙げられるが、これらに限定されない。
基板2102は、流体を収容するための内部表面2106と内部空間2108とを少なくとも有するチャネル2104を支持するか、含んでいる。いくつかの場合において、チャネル2104は、基板2102の上面にエッチングされている。チャネル2104の内部表面2106の材料の例として、ガラスまたはシリカが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、チャネル2104および基板2102は、ガラスで構成されている。ガラスは生体液に徐々に溶解されたり、タンパク質や小分子がガラスの表面に接着したりするため、ガラスで構成されたインプラントの使用では生物学的条件が障害となる。一例としての特定の実施形態では、自己集合単分子層を使用した表面修飾によって、核酸の検出用および分析用のガラス表面を修飾するアプローチが提供される。特定の実施形態において、チャネル2104の内部表面2106の少なくとも一部は、該内部表面への検知用化合物の特異的共有結合を可能にする材料を含むか、またはそのような材料でコーティングするために、前処理されたり、共有結合によって修飾されたりする。特定の実施形態では、チャネルを覆うカバー2114も、何らかの材料を用いた共有結合により修飾されていてもよい。
チャネル2104の内部表面2106を修飾するために使用される典型的な材料としては、シラン化合物（例えば、トリクロロシラン、アルキルシラン、トリエトキシシラン、パーフルオロシラン）、両性イオン性スルトン、ポリ（6-9）エチレングリコール（PEG）、パーフルオロオクチル、フルオレセイン、アルデヒドまたはグラフェン化合物が挙げられるが、これらに限定されない。チャネルの内部表面の共有結合修飾によって、特定の分子の非特異的吸収が低下する。一実施例では、内部表面の共有結合修飾によって、内部表面によるその他の分子の非特異的吸収を防止しつつ、内部表面への検知用化合物分子の共有結合が可能となる。例えば、ポリエチレングリコール（PEG）は、チャネル2104の内部表面2106を修飾して、内部表面への材料の非特異的吸着を低下させるために使用される。
いくつかの実施形態において、チャネル2104は、明確に定義された滑らかな内部表面2106を有するよう、ナノスケールまたはマイクロスケールで微細に作製されている。チャネルを作製し、チャネルの内部表面を修飾するための典型的な技術としては、Sumita Pennathur and Pete Crisallai (2014), “Low Temperature Fabrication and Surface Modification Methods for Fused Silica Micro- and Nanochannels”, MRS Proceedings, 1659, pp15-26.doi:10.1557/opl.2014.32に教示されており、その内容の全体が引用により本明細書に明示的に援用される。
チャネル2104の第１の端部は、入口ポート2110を含むか、または入口ポート2110と流体連通しており、チャネル2104の第２の端部は、出口ポート2112を含むか、または出口ポート2112と流体連通している。特定の実施形態において、ポート2110およびポート2112は、チャネル2104の末端に備えられるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態において、チャネル2104およびポート2110，2112を有する基板2102の上面は、カバー2114で覆われ、密封されている。いくつかの実施形態において、上面を含むチャネルを規定するために硬質プラスチックを使用してもよく、半透膜を使用してもよい。
第１の電極2116は、チャネル2104の第１の端部に、例えば入口ポート2110またはその近傍に電気的に接続されている。第２の電極2118は、チャネル2104の第２の端部に、例えば出口ポート2112またはその近傍に電気的に接続されている。第１の電極2116と第２の電極2118の間に電位差を生じさせるために、第１の電極および第２の電極は、電源または電圧源2120と電気的に接続されている。すなわち、チャネルの長さの少なくとも一部において電位差が印加される。チャネル2104内に流体が存在し、印加された電圧差の影響下にある場合、電極2116、2118と流体とが完全な電気経路を形成する。
電源または電圧源2120は、チャネルの長さに沿った（ｙ軸に沿った）第１の方向と（ｙ軸に沿った）逆の方向である第２の方向に電位差が印加されるように、可逆的に電界を印加するように構成されている。電界または電位差の方向が第１の方向である一例において、陽電極は、チャネル2104の第１の端部に、例えば入口ポート2110またはその近傍に接続され、陰電極は、チャネル2104の第２の端部に、例えば出口ポート2112またはその近傍に接続されている。電界または電位差の方向が逆の第２の方向である別の一実施例において、陰電極は、チャネル2104の第１の端部に、例えば入口ポート2110またはその近傍に接続され、陽電極は、チャネル2104の第２の端部に、例えば出口ポート2112またはその近傍に接続されている。
いくつかの実施形態において、電源または電圧源2120は、交流信号を印加するように構成されている。この交流信号の周波数は、動的に変更してもよい。いくつかの態様において、電源または電圧源2120は、10～109Hzの範囲にある周波数を有する電気信号を供給するように構成されている。いくつかの態様において、電源または電圧源2120は、105～107Hzの範囲にある周波数を有する電気信号を供給するように構成されている。
チャネル2104の第１の端部および第２の端部（例えば、入口ポート2110および出口ポート2112またはそれらの近傍）は、チャネル2104の１つ以上の電気的特性値の検出によって、チャネル2104内における特定の核酸および／またはヌクレオチドの有無を判定するようにプログラムまたは構成された核酸検出回路2122と電気的に接続されている。電気的特性値の検出は、単一の時間（例えば、試料および１種以上の検知用化合物がチャネル内へ導入されてから特定の時間が経過した後）に行われるか、または複数の異なる時間（例えば、試料および１種以上の検知用化合物がチャネル内へ導入される前とその後）に行われる。いくつかの態様において、電気的特性値は、試料の導入からLAMP増幅までの設定された時間にわたって連続的に検出される。検出される電気的特性の例として、電流、導電圧、抵抗、周波数または波形が挙げられるが、これらに限定されない。核酸検出回路2122の特定の例は、プロセッサもしくは演算処理装置を含むか、またはプロセッサもしくは演算処理装置として構成されており、例えば、図１８に示す装置1700として構成されている。別の特定の核酸検出回路2122は、電流計、電圧計、オーム計、またはオシロスコープを含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、核酸検出回路2122は、チャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って１つ以上の電気的特性値を測定するようにプログラムまたは構成された測定回路2123を含む。核酸検出回路2122は、平衡回路2124をさらに含み、この平衡回路2124は、チャネルの１つ以上の電気的特性値を、ある時間にわたって周期的にまたは連続的にモニタリングするように、かつ／または電気的特性値が平衡に達した後（例えば、分散または許容度に閾値を超える変動が見られなくなった後）に電気的特性値のうちの１つを選択するようにプログラムまたは構成されている。
核酸検出回路2122は、チャネルの２つ以上の電気的特性値を比較できるように、例えば、ある基準電気的特性値（例えば、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入される前の状態で測定された電気的特性値）と、別の電気的特性値（例えば、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入された後に測定された電気的特性値）とを比較するようにプログラムまたは構成されている比較回路2126をさらに含んでいてもよい。比較回路2126は、チャネル内の核酸の有無を判断するために、前記比較を利用してもよい。一実施形態において、比較回路2126は、測定された電気的特性値と基準電気的特性値との差を計算し、この差を、チャネル内の核酸の有無を示す所定の値と比較する。また、この情報は、対象の病態または感染症の有無を診断または予測するために使用される。
特定の実施形態では、チャネルに試料および検知用化合物を導入した後、比較回路2126は、チャネルの長さに沿った第１の方向において電界または電位差がチャネルに印加された場合の第１の電気的特性値（例えば電流の大きさ）と、チャネルの長さに沿った逆の第２の方向において電界または電位差がチャネルに印加された場合の第２の電気的特性値（例えば電流の大きさ）とを比較するようにプログラムまたは構成されている。一実施形態において、比較回路2126は、第１の値と第２の値の大きさの差を計算し、この差を、チャネル内の核酸の有無を示す所定の値と比較する（例えば、その差が実質的にゼロであるか否かを判定する）。例えば、差が実質的にゼロであれば、チャネル内で分散していたり、重合体を形成してたり、凝集塊を形成していたりする核酸は存在しないことが示される。差が実質的にゼロでない場合、チャネル内で分散形態にあったり、重合体を形成していたり、凝集塊を形成していたりする核酸が存在していることが示される。
特定の実施形態において、核酸検出回路2122は、試料中に存在する核酸の絶対濃度、および／または試料中に存在する１種以上の別の物質に対する核酸の相対濃度を測定するようにプログラムまたは構成されている。
いくつかの実施形態において、比較回路2124および平衡回路2126は、別々の回路またはモジュールとして構成されているが、別の実施形態においては、単一の集積回路またはモジュールとして構成されている。
核酸検出回路2122は出力2128を有し、いくつかの実施形態において、この出力は１つ以上の外部装置またはモジュールに接続されていてもよい。例えば、核酸検出回路2122は、基準電気的特性値および／または１つ以上の測定された電気的特性値を、さらなる演算、処理および分析を行うプロセッサ2130、得られた値を格納する非一時的記憶装置もしくはメモリ2132、ならびに／または得られた値をユーザに対して表示する視覚表示装置2134のうちの１つ以上に対して送信してもよい。いくつかの実施形態において、核酸検出回路2122は、試料中の核酸の有無を示す指標を生成し、これをプロセッサ2130、非一時的な記憶装置もしくはメモリ2132および／または視覚表示装置2134に送信する。
図１７Ａおよび図１７Ｂのシステムを使用する方法の一例では、１種以上の検知用化合物（例えば、１種以上の核酸プローブ）および試料が、順次または同時にチャネルへと導入される。（例えば、凝集塊が流体中に存在しないことなどによって）流体の流れおよび／または流体中の荷電粒子の流れに制約がない場合、流体中の導電性粒子またはイオンは、ｙ軸に沿ったチャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って移動し、入口ポート2110から出口ポート2112へと移動する。導電性粒子またはイオンが移動することによって、チャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って核酸検出回路2122により検出され、第１の電気的特性値すなわち「基準」電気的特性値（例えば、電流、導電率、抵抗率または周波数）またはその範囲が作成または生成される。いくつかの実施形態において、平衡回路2124は、電気的特性値が平衡に達するまでのある時間にわたって、電気的特性値を周期的または連続的にモニタリングする。次に、平衡回路2124は、電気的特性における一時的な変化による影響を避けるため、電気的特性値のうち１つを基準電気的特性値として選択する。
本明細書において、「基準」電気的特性値は、試料および検知用化合物（例えば１種以上の核酸プローブ）のすべてがチャネルに導入される前の電気的特性値またはその範囲を指す。すなわち、この基準値は、試料中の核酸と検知用化合物の間で何らかの相互作用が生じる前のチャネルを特徴付ける値である。場合によっては、基準値は、検知用化合物がチャネルに導入されてから、試料および追加の検知用化合物がチャネルに導入されるまでの間に検出される。場合によっては、基準値は、検知用化合物と試料がチャネルに導入されてから、追加の検知用化合物がチャネルに導入されるまでの間に検出される。いくつかの場合において、基準値は、試料または検知用化合物がチャネルに導入される前に検出される。いくつかの場合において、基準値は、あらかじめ決定され、アクセス可能な非一時的記憶媒体に格納される。
場合によっては、チャネル内での（例えば、試料中の目的の核酸と１種以上の核酸プローブの間の相互作用による）導電性の凝集塊、重合体または核酸複合体の形成は、チャネル2104の長さの少なくとも一部に沿った電気経路を増強する。この場合、核酸検出回路2122は、第２の電気的特性値またはその範囲（例えば電流、導電率、抵抗率または周波数）を、チャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って検出する。いくつかの実施形態において、核酸検出回路2122は、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入されてから第２の電気的特性値を検出するまでの間に、待機時間または調整時間を提供する。この待機時間または調整時間において、チャネル内で凝集塊、重合体または核酸複合体が、（好ましくはチャネル内に懸濁された状態で）形成されることが可能となり、（好ましくはチャネル内に懸濁された状態の）これらの凝集塊、重合体または核酸複合体の形成によって、チャネルの電気的特性が変化する。
いくつかの実施形態において、平衡回路2124は、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入された後、電気的特性値が平衡に達するまで、電気的特性値を周期的または連続的にモニタリングする。次に、平衡回路2124は、電気的特性における一時的な変化による影響を避けるため、電気的特性値のうち１つを第２の電気的特性値として選択してもよい。
比較回路2126は、第２の電気的特性値を基準電気的特性値と比較する。第２の電気的特性値と基準電気的特性値との差が、あらかじめ決定していた電流もしくは導電率の上昇（または抵抗率の低下）範囲に相当すると判定された場合、核酸検出回路2122は、チャネル内に凝集塊、重合体または核酸複合体が存在すると判定し、つまり、試料中に標的核酸が存在すると判定するか、試料中に標的核酸が検出されたと判定する。これに基づいて、対象における標的の有無、および病態または感染状態の有無を診断または確認することができる。
別の特定の実施形態において、（例えば、凝集塊、重合体または核酸複合体の形成によって）チャネル内の流体の流れおよび／または流体中の荷電粒子の流れが部分的にあるいは完全に遮断された場合、流体中の導電性粒子またはイオンは、ｙ軸に沿ったチャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って自由に移動することができず、入口ポート2110から出口ポート2112に自由に移動することができない。導電性粒子またはイオンの移動が妨害または阻止されることによって、第３の電気的特性値またはその範囲（例えば、電流もしくは電気信号、導電率、抵抗率または周波数）が作成または生成され、この第３の電気的特性値が、核酸検出回路2122により、チャネル2104の長さの少なくとも一部に沿って検出される。第３の電気的特性値は、第２の電気的特性値に加えて検出されるか、あるいは第２の電気的特性値の代わりに検出される。いくつかの実施形態において、核酸検出回路2122は、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入されてから、第３の電気的特性値が検出されるまでの間の待機時間または調整時間中に待機してもよい。この待機時間または調整時間中に、チャネル内での凝集塊、重合体または核酸複合体の形成が可能となり、これらの凝集塊、重合体または核酸複合体が形成されることによって、チャネルの電気的特性が変化する。
いくつかの実施形態において、平衡回路2124は、試料およびすべての検知用化合物がチャネルに導入されてから、電気的特性値が平衡に達するまでの間に、電気的特性値を周期的または連続的にモニタリングする。次に、平衡回路2124は、電気的特性における一時的な変化の影響を避けるため、電気的特性値のうち１つを第３の電気的特性値として選択する。
比較回路2126は、第３の電気的特性値を基準電気的特性値と比較する。第３の電気的特性値と基準電気的特性値との差が、あらかじめ決定していた電流もしくは導電率の低下（または抵抗率の上昇）範囲に相当すると判定された場合、核酸検出回路2122は、チャネル内に凝集塊、重合体または核酸複合体が存在すると判定し、つまり、試料中に標的核酸が存在すると判定する。
チャネルの長さに沿った流体の流れは、チャネルの寸法に対する凝集塊、重合体または核酸複合体の大きさに依存し、また、チャネルの内部表面の電気二重層（EDL）の形成に依存する。
一般的に、電気二重層（EDL）は、荷電した固体（例えば、チャネルの内部表面、分析種の粒子、凝集塊、重合体または核酸複合体）と電解質含有溶液（例えば、チャネル内の流動性内容物）との間の正味の荷電領域である。EDLは、チャネルの内部表面と、チャネル内のあらゆる核酸粒子、凝集塊、重合体または核酸複合体の周囲とに存在する。電解質由来の対イオンは、チャネルの内部表面の電荷に引き寄せられ、正味の電荷を有する領域を生じさせる。EDLは、チャネル内の流れならびに分析種の粒子および凝集塊、重合体または目的の核酸複合体の周囲の流れに影響を与え、ダイオード様の挙動を示す。その結果、対イオンは、チャネルの長さを通り抜けることができなくなる。
電気二重層（EDL）の代表長さを数学的に求めるため、ポアソン－ボルツマン（「PB」）方程式および／またはポアソン－ネルンスト－プランク方程式（「PNP」）を解く。これらの解を、流体の流れを表すナビエ－ストークス（NS）方程式と連立させて連立方程式の非線形セットを作成し、これを分析して、一例としての前記系の動作を理解する。
チャネルの表面と電気二重層（EDL）と凝集塊、重合体または核酸複合体の間の寸法の相互作用を考慮に入れて、ある所定の大きさの凝集塊、重合体または核酸複合体がチャネル内で形成された場合にチャネルの長さ方向に沿った導電性イオンの流れが実質的に抑制されるように注意深く選択された寸法パラメータを用いてチャネルの一例を構成および構築する。場合によっては、一例としてのチャネルは、核酸検出中にチャネル内で形成された凝集粒子の直径と実質的に同じ寸法の深さおよび／もしくは幅、またはそれよりも小さい深さおよび／もしくは幅となるように構成する。特定の実施形態では、EDLのサイズも、チャネルの寸法パラメータを選択する際に考慮に入れる。場合によっては、チャネルの一例は、チャネルの内部表面の周囲に生じたEDLの寸法およびチャネル内の凝集塊、重合体または核酸複合体の大きさと実質的に同じ深さおよび／もしくは幅、またはそれよりも小さい深さおよび／もしくは幅となるように構成する。
特定の実施形態では、検出システムを使用する前に、チャネル内に検知用化合物（例えば１種以上の核酸プローブ）は存在しない。すなわち、検出システムの製造者は、検知用化合物を収容するような前処理や修飾をチャネルに対して行わなくてもよい。この場合、ユーザが、使用中に例えば電解質緩衝液中の１種以上の検知用化合物をチャネルに導入し、試料の非存在下における検知用化合物の存在下でのチャネルの基準電気的特性値を検出する。
別の特定の実施形態では、検出システムを使用する前に、チャネルに前処理または修飾を行い、内部表面の少なくとも一部が、検知用化合物（例えば１つ以上の核酸捕捉プローブ）を含むか、検知用化合物でコーティングされた状態とする。一例では、製造者が、検知用化合物で修飾されたチャネルの基準電気的特性値を検出し、ユーザは、検出システムを使用する際に、格納されたその基準電気的特性値を使用してもよい。すなわち、検出システムの製造者は、検知用化合物を含むようにチャネルの前処理または修飾を行ってもよい。この場合、ユーザは、試料と１種以上の追加の検知用化合物をチャネルに導入する必要がある。
特定の検出システムの一例では、１つのチャネルのみを含む。別の特定の検出システムの一例では、１つの基板上に複数のチャネルが提供される。このような検出システムは、適切な個数であればどのような個数のチャネルを含んでいてもよく、その個数としては、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個もしくは少なくとも１０個、または２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個、またはこれらの個数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の個数が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、検出システムは、少なくとも２つのチャネルが互いから独立して作動する複数のチャネルを含む。一例としてのチャネル2104および図１７Ａ～図１７Ｂに示した関連する構成部品を、同じ基板上に複製することにより、このようなマルチチャネル検出システムを構成することができる。マルチチャネルは、同一の試料中の同一の核酸、同一の試料中の異なる核酸、異なる試料中の同一の核酸、および／または異なる試料中の異なる核酸を検出するために使用される。別の一実施形態において、検出システムは、少なくとも２つのチャネルが互いに連携して作動する複数のチャネルを含む。いくつかの態様において、各チャネルは、検出対象である標的に応じた様々な形状で作製される。
臨床現場即時（POC）使用のための装置の一例の概要
いくつかの実装において、本発明の装置は携帯型であり、試料中の１種以上の標的を検出するように構成されている。図１９に示すように、この装置は、fC4D回路905を制御するように構成されたプロセッサ900を含む。fC4D回路905は、信号発生器907を含む。前述したように、信号発生器907は、チャネル2104または試験ウェルを介して１つ以上の信号を供給するように構成されている。信号発生器907は、該信号発生器907からの１つ以上の信号を増幅するための前増幅器915に接続される。この１つ以上の信号は、マルチプレクサ909およびチャネル2104を介して送信される。チャネル2104から送信された信号は後増幅器911によって増幅され、デマルチプレクサ913により復調される。アナログからデジタルへの変換器917は、信号を復元し、デジタル信号をプロセッサ900へと転送する。プロセッサ900は、所望の標的が試料中で検出されたか否かを判定するために、測定、平衡化、比較などを行うように構成された回路を含む。いくつかの実施形態では、アナログからデジタルへの変換を最初に行ってもよい。このような実施形態のいくつかでは、誘導波全体をサンプリングし、ソフトウェアでのデジタル処理により復調することができる。
いくつかの実施形態では、プロセッサ900は、１つ以上の発熱体920にも接続されている。この１つ以上の発熱体920は、抵抗発熱体であってもよい。１つ以上の発熱体920は、試料および／またはチャネル2104内の溶液を加熱するように構成される。いくつかの実施形態において、試料は、0℃以上、5℃以上、10℃以上、15℃以上、20℃以上、25℃以上、30℃以上、35℃以上、40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上、95℃以上、100℃以上、105℃以上、110℃以上、115℃以上、120℃以上、130℃以上、140℃以上、150℃以上、160℃以上、170℃以上、180℃以上、190℃以上、200℃以上、210℃以上、220℃以上、230℃以上、240℃以上、250℃以上、260℃以上もしくは任意の温度、またはこれらの数値のうちの２つの間にある範囲の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、試料は、40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下、20℃以下、15℃以下、10℃以下、5℃以下、0℃以下、－5℃以下、－10℃以下、－15℃以下、－20℃以下もしくは任意の温度以下、またはこれらの数値のうちの２つの間にある範囲の温度に冷却される。これらを考慮に入れて、プロセッサ900および／またはその他の回路は、試料および／またはチャネル2104の温度925を読み取り、所望の加熱設定値930に達するまで、１つ以上の発熱体920を制御するように構成される。いくつかの態様において、チャネル2104は、その全体が１つ以上の発熱体920によって加熱されるように構成される。別の態様において、チャネル2104は、その一部のみが１つ以上の発熱体920によって加熱されるように構成される。
プロセッサ900は、キーパッド、タッチスクリーン、ボタン、スイッチ、マイクロホンなどの１つ以上のユーザ入力装置からのユーザの入力940を受信するように構成される。データは出力950された後、記録951、ユーザへの報告953、クラウドベースの記憶システムへの送信952などが行われる。いくつかの実施形態において、データは、処理のための別の装置への送信および／またはさらなる処理が行われる。例えば、fC4Dデータは、クラウド上に送信され、その後、試料中の標的の有無を判定するために処理してもよい。
いくつかの態様において、本発明の装置は、消費電力が比較的低くなるように構成される。例えば、本発明の装置が必要とする電力は、わずか１～10ワットであってもよい。いくつかの態様において、本発明の装置が必要とする電力は７ワット以下である。本発明の装置は、データの処理、その他の１つ以上の装置とのワイヤレス通信、チャネルを通した信号の送信および検出、試料／チャネルの加熱、ならびに／またはタッチ対応ディスプレイを用いた入出力の検出および表示を行うように構成される。
いくつかの実装において、試料採取装置、試料調製装置および流体工学カートリッジは、個別の物理的装置として形成される。したがって、第１の試料採取装置が、試料を採取するために使用される。試料は、唾液、粘液、血液、血漿、便または脳脊髄液を含んでいてもよい。次に、試料は、第２の装置である試料調製装置に移される。試料調製装置は、核酸増幅に必要な成分および試薬を含む。調製された試料は、流体工学カートリッジを含む第３の装置へと移され、ここで増幅およびfC4Dによる励起および測定が行われる。いくつかの実装において、試料の採取および調製は、単一の装置によって行われる。いくつかの実装において、試料調製と流体工学カートリッジは、単一の装置に含まれる。いくつかの実装では、単一の装置が、試料の採取、試料の調製、少なくとも試料の一部の増幅、およびfC4Dを用いた試料の分析を行うように構成される。
小型流体工学カートリッジの一例の概要
いくつかの態様において、本発明の装置は、付随する装置に接続することのできる取り外し可能な流体工学カートリッジを含む。この取り外し可能な流体工学カートリッジは、使い捨てのカートリッジとして構成されている。いくつかの実施形態において、この取り外し可能な流体工学カートリッジは複数のチャネルを含む。複数のチャネルは、様々な形状で作製されてもよい。いくつかの態様において、４種の形状のチャネルが使用され、精度を確保するために繰り返される。いくつかの態様において、４種よりも多くの形状のチャネルが使用され、精度を確保するために繰り返される。いくつかの態様において、各チャネルは、単一のユニークな標的を検出するように構成される。別の態様では、各チャネルは、同一の標的を検出するように構成される。いくつかの実装において、カートリッジは１つ以上の発熱体を含む。通常、流体工学カートリッジは、fC4D分析用に構成された少なくとも１つのチャネルを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、前記カートリッジは多層の積層構造を含む。１つ以上のチャネルが、打抜き加工および／またはレーザ切断によって基板内に作製される。いくつかの実施形態において、基板は、ポリプロピレンフィルムを含む。フィルムの一面または両面が、接着剤でコーティングされる。このチャネルの全部または一部を加熱するために、チャネル層は、ポリアミドヒーターコイル上に固定される。チャネルは、少なくとも一部が、親水性のPET層によって覆われる。PET層の下には、プリント電極が配置されてもよい。いくつかの態様において、温度のフィードバックのために、チャネル当たり少なくとも１つのサーミスタが供給される。
別の態様において、前記カートリッジは射出成型されたプラスチックを含む。この射出成型されたプラスチック内に、１つ以上のチャネルが配置される。前記射出成型プラスチックに対してPETをレーザ溶接することによって、チャネルの全部または一部にPET層またはPETフィルムがコーティングされる。射出成形によって剛性および三次元構造が提供されると有利であり、さらに、バルブやフレームのような取り扱いを容易にするための機能が付与される。特定の設定に応じて、前記カートリッジは、プリントされた電子部品および／または発熱体および／またはサーミスタを含んでもいてもよく、これらを含んでいなくてもよい。
流体工学カートリッジ500の実施形態の一例を図２０に示す。図に示すように、カートリッジ2500は４つの層を含む。PCB/PWB層2501の上には、電極2505がトレースされている。電極は、原子蒸着などの方法を用いて、30nmの二酸化チタン層で不動態化することができる。PCB/PWB層は、４つの層を固定するためのねじまたは別の固定手段の挿入部2506を含んでいてもよい。電源および検出回路をPCB/PWB層に接続することができる。ガスケット層2510は、切抜部2513および2514ならびに挿入部2506を備える。ガスケット層は、フルオロシリコーンなどの材料から作製することができる。下部硬質基板層2520は、挿入部2506および入口ポート2522を含む。上部硬質層2530は、挿入部2506および入口ポート2522を含む。上下の硬質層は、それぞれアクリル樹脂などの材料から作製することができる。４つの層が組み立てられ、いくつかの層のいくつかの挿入部2506を通したねじまたは別の固定手段により固定されると、４つのチャネルが形成される。切抜部2513および2514は、チャネルの側面を形成する。切抜部2513は、２つの台形端部を有するチャネルを形成し、別の切抜部2514は、実質的に直線状の端部を有するチャネルを形成する。電極2505を含むPCB/PWB層2501の一部は、チャネルの底部を形成する。下部硬質層2520は、チャネルの上部を形成し、入口ポート2522は、これらのチャネルへの入口ポートおよび出口ポートを提供する。上層の入口ポート2522および上部硬質層の入口ポートは、各チャネルに試薬を提供する手段を提供する。いくつかの実施形態において、２つの台形端部を有するチャネルは、約30μl～約50μlの容量を有していてもよい。いくつかの実施形態において、実質的に直線状の端部を有するチャネルは、約20μl～約30μlの容量を有していてもよい。これらの容量は、少なくともガスケット層の圧縮度を変えることにより調節することができる。図２１は、図２０の流体工学カートリッジ2500の平面図であり、ねじまたは別の固定手段のための挿入部506と、チャネル2550と流体連通する入口ポート2522と、電極2505とを有する。図２２は、２つの電極2505の寸法の一例を示す。図２３は、２つの台形端部を有するチャネル2550の寸法の一例を示す。いくつかの実施形態において、これらのチャネルは、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃もしくは75℃、またはこれらの数値のいずれか２つで定義される範囲内にある温度に加熱され、加圧される。いくつかの態様において、これらのチャネルは、１気圧、２気圧、３気圧、４気圧、５気圧もしくは６気圧、またはこれらの圧力のうちのいずれか２つで定義される範囲内の圧力に加圧することができる。
いくつかの実施形態において、流体工学装置のチャネルは、1μl以上、2μl以上、3μl以上、4μl以上、5μl以上、6μl以上、7μl以上、8μl以上、9μl以上、10μl以上、20μl以上、30μl以上、40μl以上、50μl以上、60μl以上、70μl以上、80μl以上、90μl以上、100μl以上、200μl以上、300μl以上、400μl以上、500μl以上、600μl以上、700μl以上、800μl以上、900μl以上もしくは1000μl以上、またはこれらの量のうちのいずれか２つの間の範囲にある量の試料を収容できるように構成することができる。いくつかの実施形態において、流体工学装置のチャネルは、加圧に適するように構成することができる。いくつかの実施形態において、チャネル内の試料は、１気圧以上、２気圧以上、３気圧以上、４気圧以上、５気圧以上、６気圧以上、７気圧以上、８気圧以上、９気圧以上、10気圧以上、またはこれらの圧力のうちのいずれか２つの間にある範囲の圧力に加圧することができる。いくつかの実施形態において、流体工学装置のチャネルは、－20℃以上、－15℃以上、－10℃以上、－5℃以上、0℃以上、5℃以上、10℃以上、15℃以上、20℃以上、25℃以上、30℃以上、35℃以上、40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、85℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上、95℃以上、100℃以上、105℃以上、110℃以上、115℃以上、120℃以上、130℃以上、140℃以上、150℃以上、160℃以上、170℃以上、180℃以上、190℃以上、200℃以上、210℃以上、220℃以上、230℃以上、240℃以上、250℃以上、260℃以上もしくは任意の温度、またはこれらの温度のうちのいずれか２つの間にある範囲の温度を維持できるように構成することができる。
試料採取の一例の概要
いくつかの実装において、本明細書で開示する方法、システムおよび装置は、単純化された直接的な試料採取方法を利用している。このようにして、試料の採取から分析までの工程数が削減される。言い換えると、いくつかの実装において、試料の汚染を防ぐためには、ユーザが試料の移動および／または操作を行う回数を最小限に抑えることが望ましい。いくつかの態様において、本明細書で開示する装置は、あらゆる種類の試験環境に適するように、複数の試料採取方法に適合するように構成されている。したがって、いくつかの態様において、バイアルからチップへの均質なインターフェースが利用される。試料採取システムを調整することによって、採取されて分析される試料の種類にかかわらず、同じ検出ハードウェアを使用することができる。
分析の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、単一の容器内で生の試料からの標的の単純な溶解／増幅／検出を行うことを含む。いくつかの実施形態は、核酸以外の標的を検出するための免疫増幅を含む。いくつかの実施形態は、反応に加えることで導電率の変化を増加させる試薬を含む。いくつかの実施形態は、LAMP法、SDA法および／またはRCA法などの等温増幅法を含む。いくつかの実施形態において、検出対象の標的は、タンパク質などのバイオマーカー、薬剤や麻酔剤などの小分子、または毒素などの生物兵器である。このような標的の検出は、抗体やアプタマーなどの免疫結合試薬と、等温増幅反応に関与する核酸とを結合させることにより行うことができる。いくつかの実施形態では、増幅反応に添加剤を加えることによって、標的の定量と相関する溶液の導電率の変化を増強することができる。添加剤の使用により、検出の感度およびダイナミックレンジを高くすることができる。
本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかでは、試料の採取および処理の１つ以上の望ましい特徴として、遠心の必要がない；携帯型である；安価である；使い捨てである；壁付コンセントを必要としない；簡単に使用できるか、または直感的に使用できる；使用に必要とされる技術的手腕が比較的低く済む；少量の試料（例えば70μL）からRNAおよび／またはDNAを抽出できる；増幅までのRNAおよび／またはDNAを安定化できる；熱に安定な試薬を使用することにより、コールドチェーンによる保管の必要がない；低濃度のわずかな試料でも（例えば1,000コピー/mL以下の試料でも）分析が可能である；および／または、例えば、少なくとも４桁にわたってウイルス量を検出できるダイナミックレンジを有するという特徴がある。
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、本明細書に記載の診断装置において使用するための、試料の採取および処理を含む。採取される試料として、生物試料とも称されるが、例えば、植物、血液、血清、血漿、尿、唾液、腹水、髄液、精液、肺洗浄液、喀痰、痰、粘液、糞便；細胞または核酸を含む液体培地；細胞または核酸を含む固体培地；組織などが挙げられる。試料の採取方法としては、指先穿刺、踵穿刺、静脈穿刺、成人の鼻腔吸引、小児の鼻腔吸引、鼻咽頭洗浄、鼻咽頭吸引、綿棒による採取、カップ内へのバルク採取、組織生検または洗浄試料の使用が挙げられる。さらなる例として、土壌試料や水試料などの環境試料が挙げられる。
増幅の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、核酸標的の増幅を含む。核酸の増幅方法はよく知られており、PCRなどの、反応中に温度を変化させる方法がある。
さらなる例として、実質的に一定の温度で反応を起こすことができる等温増幅がある。いくつかの実施形態において、核酸標的の等温増幅により、溶液の導電率が変化する。等温核酸増幅の方法には、いくつかの種類があり、例えば、核酸配列ベース増幅（NASBA）法、鎖置換増幅（SDA）法、ループ媒介等温増幅（LAMP）法、インベーダー法、ローリングサークル増幅（RCA）法、signal mediated amplification of RNA technology（SMART）法、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）法、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）法、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅（NESA）法、ニッキングエンドヌクレアーゼによるナノ粒子の活性化（NENNA）法、エキソヌクレアーゼによる標的リサイクル、連結またはYプローブ、スプリットDNAZyme増幅法、デオキシリボザイム増幅法、鋳型指向性化学反応による増幅信号、非共有DNA触媒反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応（HCR）法およびDNAプローブの自己集合による超分子構造を介した検出などが挙げられる。例えば、Yan L.,et al.,Mol.BioSyst.,(2014)10:970-1003を参照されたい（この文献はその内容の全体が引用により本明細書に明示的に援用される）。
LAMP法の一例において、フォワードプライマーセットうち、２種のプライマーは、インナープライマー（F1c-F2、cは「相補的」を意味する）とアウタープライマー（F3）と呼ばれる。まず、60℃において、インナープライマーのF2領域が標的とハイブリダイズし、DNAポリメラーゼによって伸長される。次に、アウタープライマーF3が、同じ標的鎖のF3cに結合し、ポリメラーゼによりF3が伸長され、新たに合成された鎖に置換される。置換された鎖は、F1c領域とF1領域のハイブリダイゼーションにより、５’末端にステムループ構造を形成する。この鎖の３’末端には、リバースプライマーセットがハイブリダイズすることができ、ポリメラーゼにより、両末端にステムループ構造を有する新たな鎖が作製される。このダンベル構造のDNAが指数関数的な増幅サイクルに入り、伸長と鎖置換を繰り返すことにより、標的DNAの逆方向反復配列を数個有する鎖を作製することができる。本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかにおいて、LAMP法の成分として、４種のプライマー、DNAポリメラーゼおよびdNTPが含まれる。LAMP法の応用例としてウイルス病原体が挙げられ、この例として、デング熱（M.Parida, et al., J. Clin. Microbiol., 2005, 43, 2895-2903）、日本脳炎（M.M.Parida, et al., J. Clin. Microbiol., 2006, 44, 4172-4178）、チクングンヤ熱（M. M. Parida, et al., J. Clin. Microbiol., 2007, 45, 351-357）、西ナイル熱（M. Parida, et al., J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 257-263）、重症急性呼吸器症候群（SARS）（T. C. T. Hong, Q. L. Mai, D. V. Cuong, M. Parida, H. Minekawa, T. Notomi, F. Hasebe and K. Morita, J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 1956-1961）および高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）H5N1（M. Imai, et al., J. Virol. Methods, 2007, 141, 173-180）が挙げられる（これらの文献はその内容の全体が引用により本明細書に明示的に援用される）。
鎖置換増幅（SDA）法の一例において、プローブは２つの部分を含み、すなわち、５’末端のHinc II認識部位と、標的に相補的な配列を含む別のセグメントとを含む。DNAポリメラーゼによりプライマーが伸長され、デオキシアデノシン５’－［α－チオ］－三リン酸（dATP［αS］）が取り込まれる。次に、制限エンドヌクレアーゼHinc IIが、プローブ鎖のHinc II認識部位でニックを形成する。このニックの形成は、このエンドヌクレアーゼが、チオリン酸修飾を含む他方の鎖を開裂させることができないことにより起こる。エンドヌクレアーゼによる切断の結果、３’－OHが露出し、DNAポリメラーゼによって伸長される。新しく生成した鎖も、Hinc IIのニック部位を含んでいる。新たに合成された二本鎖におけるニックの形成と、これに続くDNAポリメラーゼによる伸長とが数回繰り返されることによって、等温増幅カスケードが起こる。本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかにおいて、SDA法の成分として、４種のプライマー、DNAポリメラーゼ、REase HincII、dGTP、dCTP、dTTPおよびdATPαSが含まれる。SDAの一応用例として、結核菌ゲノムDNA（M. Vincent, et al., EMBO Rep., 2004, 5, 795-800）が挙げられる（この文献は、引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。
NASBA法の一例において、フォワードプライマー１（P1）は、２つの部分から構成され、そのうちの一方はRNA標的の３’末端に相補的であり、もう一方はT7プロモーター配列に相補的である。P1がRNA標的（RNA（＋））に結合すると、逆転写酵素（RT）がこのプライマーを伸長させ、このRNAに相補的なDNA（DNA（＋））を生成する。次に、RNase Hが、RNA－DNA（＋）ハイブリッドのRNA鎖を分解する。次に、リバースプライマー２（P2）がDNA（＋）に結合し、逆転写酵素（RT）により二本鎖DNA（dsDNA）が生成するが、これにはT7プロモーター配列が含まれる。この最初の段階が終了した後、この系は増幅段階に入る。T7 RNAポリメラーゼは、dsDNAに基づいて多くのRNA鎖（RNA（－）を生成し、リバースプライマー（P2）は新たに形成されたRNA（－）と結合する。逆転写酵素（RT）がリバースプライマーを伸長させ、RNase HがRNA－cDNA二本鎖のRNAを分解して単鎖DNAとする。次に、新たに生成したcDNA（DNA（＋））がP1の鋳型となり、このサイクルが繰り返される。本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかにおいて、NASBA法の成分として、２種のプライマー、逆転写酵素、RNase H、RNAポリメラーゼ、dNTPおよびrNTPが含まれる。NASBAの応用例として、HIV-1ゲノムRNA（D. G. Murphy, et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 4034-4041）、Ｃ型肝炎ウイルスRNA（M. Damen, et al., J. Virol. Methods, 1999, 82, 45-54）、ヒトサイトメガロウイルスmRNA（F. Zhang, et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 1920-1925）、細菌種における16S RNA（S. A. Morre, et al., J. Clin. Pathol.: Clin. Mol. Pathol., 1998, 51, 149-154）および腸内ウイルスゲノムRNA（J. D. Fox, et al., J. Clin. Virol., 2002, 24, 117-130）が挙げられる。これらの文献はそれぞれ引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
等温増幅法のさらなる例として、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法；90-I；BAD増幅；cross priming amplification（CPA）法；等温指数関数的増幅反応（EXPAR）；等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法；等温多置換増幅（IMDA）法；ライゲーション媒介SDA法；多置換増幅；ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）；restriction cascade exponential amplification（RCEA）；スマート増幅法（SMAP2）；単一プライマー等温増幅（SPIA）法；転写増幅システム（TAS）；転写媒介増幅（TMA）法；リガーゼ連鎖反応（LCR）；および／または交差多置換増幅（MCDA）；ローリングサークル増幅（RCA）法；ニッキング酵素増幅反応（NEAR）；または核酸配列ベース増幅（NASBA）法が挙げられる。
免疫等温増幅の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、免疫等温増幅を使用して核酸以外の標的を検出することを含む。このようないくつかの実施形態では、等温増幅法に有用なプライマーが、抗体もしくはその断片、またはアプタマーに連結される。本明細書において、「アプタマー」は、標的分子に特異的に結合するペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態において、抗体またはアプタマーは、等温増幅法に有用なプライマーに共有結合または非共有結合を介して連結されうる。このようないくつかの実施形態において、等温増幅法に有用なプライマーは、ビオチン－ストレプトアビジンリンカーを介して抗体またはアプタマーに連結されうる。いくつかの実施形態において、等温増幅法に有用なプライマーは、THUNDER-LINK（Innova Biosciences社、英国）を介して抗体またはアプタマーに連結されうる。
いくつかの実施形態において、標的抗原が抗体またはアプタマーに結合し、該抗体またはアプタマーに連結されたプライマーが、等温増幅の基質となるか、あるいはこのプライマーによって等温増幅が開始される。例えば、Pourhassan-Moghaddam et al., Nanoscale Research letters, 8:485-496を参照されたい（この文献は引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。いくつかの実施形態において、標的抗原は、２つの抗体またはアプタマー（Ab）の間、すなわち抗原に特異的に結合する捕捉抗体と検出抗体の間にサンドイッチされた形態で捕捉される。あらかじめ固体支持体の表面に固相化された捕捉抗体が標的抗原を捕捉し、等温増幅法に有用なプライマーに連結された検出抗体が、捕捉された抗原に結合する。洗浄後、等温増幅が行われ、増幅産物の存在によって、試料中の標的抗原の存在が間接的に示される。
導電率変化の増強の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、核酸の増幅により得られた溶液における導電率の変化を増強することを含む。いくつかの実施形態において、核酸の増幅により生じたピロリン酸塩（「PPi」）のキレート化を利用して、増幅反応の継続中に溶液の導電率の変化を増強することができる。特定の理論に束縛されるものではないが、核酸増幅中に起こりうる導電率の変化は、マグネシウムのカチオンとPPiイオンが溶液中で沈殿することによるものである可能性がある。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、マグネシウムのカチオンとPPiイオンの沈殿が生じないように平衡状態を変化させて導電率の変化を増強することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、この導電率の変化の増強は、PPiに対してマグネシウムのカチオンと競合する分子を添加することによって達成される。このような実施形態のいくつかにおいて、溶液の正味の導電率を高めることが可能な、イオン移動度の高い化合物が提供される。したがって、PPiとともに沈殿させることによって、そのような化合物を溶液から除去することで、溶液の導電率に劇的な変化がもたらされる。本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかにおいて、増幅の継続中にPPiと結合することにより溶液の導電率に変化および／または増強された変化をもたらしうる化合物／複合体として、Cd2+－サイクレン－クマリン錯体；ビス（２－ピリジルメチル）アミン（DPA）単位を含むZn2+錯体；DPA－2Zn2+－フェノキシド錯体；アクリジン－DPA－Zn2+錯体；DPA－Zn2+－ピレン錯体；およびアザクラウン－Cu2+錯体が挙げられる。例えば、Kim S. K.et al., (2008) Accounts of Chemical Research 2:23-31；Lee D-H,et al., (2007) Bull. Korean Chem. Soc. 29:497-498; Credo G. M.et al., (2011) Analyst 137:1351-1362；およびHaldar B. C. (1950)“Pyrophosphato-Complexes of Nickel and Cobalt in Solution” Nature 4226:744-745を参照されたい。これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
いくつかの実施形態には、２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（MESG）などの化合物が含まれる。MESGは、EnzChek（登録商標）Pyrophosphate Assay Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などの、ピロリン酸塩の検出用キットで使用され、無機リン酸塩の存在下でプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）によりリボース－１－リン酸と２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンとに変換される。MESGの酵素変換によって、吸収極大波長は330nmから360nmへとシフトする。PNPは、ピロリン酸塩から同じ当量の２つのリン酸塩への変換を触媒する。次に、このリン酸塩はMESG／PNP反応によって消費され、360nmにおける吸光度の増加によって検出される。ピロリン酸塩１分子がリン酸塩２分子に増幅されることによって、感度はさらに高められる。別のキットとしては、PIPER Pyrophosphate Assay Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、核酸の増幅により得られた溶液における導電率の変化の増強は、増幅されたDNAに結合する化合物を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、増幅の継続中に、電荷を運ぶ化学種が、増幅され増量したDNAに結合することによって、溶液の正味の導電率が低下する。いくつかの実施形態において、電荷を運ぶ化学種として、DNA／RNAの染色剤／色素として一般に使用されている正荷電分子が挙げられ、例えば、臭化エチジウム、クリスタルバイオレット、SYBRが挙げられ、これらの化学種は、静電引力によって核酸に結合する。これらの荷電した小さな分子種が、大きく移動性の低い増幅産物に結合することによって、これらの色素分子の電荷移動性が効果的に低減し、溶液の導電率を低下させることができる。この静電引力の機構は、ゲル電気泳動法の際のDNA染色によく使用されているが、アンプリコンに結合させる分子は、DNA染色に従来使用されている化合物である必要はないことに留意されたい。これらの分子は、（溶液の導電率に寄与する）電荷担体としての機能と、アンプリコンに対する結合能が利用され、DNAに対する何らかの染色能を備えている必要はない。いくつかの実施形態において、電荷を運ぶ化学種は、アリザリンレッドSを含む。例えば、アリザリンレッドSは、増幅されたDNA分子と相互作用して、この増幅されたDNAの挙動をボルタンメトリー的に変化させ、本明細書に記載のシステムまたは装置による増幅DNAの検出を増強することができる。
いくつかの実施形態は、ナノ粒子に連結された抗体またはアプタマーの使用を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、標的抗原の存在によって抗体が凝集し、溶液の導電率が変化する。特定の理論に束縛されるものではないが、液体中に懸濁したナノコロイドの有効導電率は、電気二重層（EDL）の特性、体積比率、イオン濃度およびその他の物理化学特性に複雑に依存しうる。例えば、Angayarkanni SA., et al., Journal of Nanofluids, 3:17-25を参照されたい（この文献は引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。抗体に連結されるナノ粒子は、当技術分野においてよく知られている。Arruebo M.et al., Journal of Nanomaterials 2009:Article ID 439389;およびZawrah MF., et al., HBRC Journal 2014.12.001を参照されたい（これらの文献はいずれも引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。本明細書で提供する方法において有用なナノ粒子としては、γ-Al2O3、SiO2、TiO2およびα-Al2O3ならびに金ナノ粒子が挙げられる。例えば、Abdelhalim, MAK., et al., International Journal of the Physical Sciences, 6:5487-5491を参照されたい（この文献は引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。ナノ粒子に連結された抗体を使用することによって、電気化学インピーダンス分光法（EIS）を使用した測定により表面に生じる信号も増強されうる。例えば、Lu J., et al., Anal Chem. 84:327-333を参照されたい（この文献は引用によりその内容の全体が本明細書に明示的に援用される）。
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、酵素に連結された抗体またはアプタマーの使用を含む。いくつかの実施形態では、酵素活性によって溶液の導電率が変化する。このような実施形態のいくつかにおいて、導電率の変化は、分析成分と接触している基質への電荷の移動によって検出される。
ウイルス標的の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定のウイルスまたはウイルス標的の検出を含む。ウイルス標的は、ウイルスの核酸、ウイルスのタンパク質および／またはウイルスの活性産物（酵素やその活性など）を含んでいてもよい。本明細書で提供する方法および装置を用いて検出されるウイルスタンパク質としては、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルス糖タンパク質、ウイルス膜融合タンパク質、ウイルスプロテアーゼおよびウイルスポリメラーゼが挙げられる。また、前記ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部に相当するウイルス核酸配列（RNAおよび／またはDNA）も本明細書に記載の方法および装置を用いて検出される。そのような標的のヌクレオチド配列は、公開されているデータベースから容易に入手することができる。等温増幅に有用なプライマーは、そのような所望のウイルス標的の核酸配列から容易に設計することができる。また、そのようなウイルスタンパク質に対する抗体およびアプタマーも市販品および／または当技術分野で公知の技術を利用して容易に入手することができる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出されるウイルスとしては、二本鎖DNAウイルスおよび一本鎖ウイルスなどのDNAウイルス；二本鎖RNAウイルス、一本鎖（＋）RNAウイルス、一本鎖（－）RNAウイルスなどのRNAウイルス；ならびに一本鎖逆転写RNAウイルスおよび二本鎖逆転写DNAウイルスなどの逆転写ウイルスが挙げられる。本発明の技術を利用して検出されるウイルスとしては、ヒトウイルス、飼育動物ウイルス、家畜ウイルスなどの動物ウイルスおよび植物ウイルスが挙げられる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出されるヒトウイルスとして、以下の表２に記載のウイルスが挙げられる。さらに、増幅に有用なプライマーが容易に設計される代表的なヌクレオチド配列も表２に示す。


Figure 2022516442000023
Figure 2022516442000024
Figure 2022516442000025
Figure 2022516442000026
細菌標的の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定の細菌および細菌標的の検出を含む。細菌標的は、細菌の核酸、細菌のタンパク質および／または細菌の活性産物（毒素や酵素活性など）を含む。特定の細菌を示すヌクレオチド配列は、公開データベースから容易に入手することができる。等温増幅に有用なプライマーは、そのような細菌標的の核酸配列から容易に設計することができる。特定の細菌のタンパク質に対する抗体およびアプタマーは、市販品および／または当技術分野で公知の技術を利用して容易に入手することができる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出される細菌としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌が挙げられる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出される細菌としては、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・プチダ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、バークホルデリア・セパシア、エロモナス・ハイドロフィラ、大腸菌、シトロバクター・フレンディ、ネズミチフス菌、チフス菌、パラチフス菌、腸炎菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、セラチア・マルセッセンス、野兎病菌、モーガネラ・モーガニイ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルティイ、アシネトバクター・バウマンニイ、アシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・ヘモリティカス、腸炎エルシニア、ペスト菌、偽結核菌、エルシニア・インターメディア、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、ヘモフィルス・パラヘモリティカス、軟性下疳菌、パスツレラ・ムルトシダ、マンヘイミア・ヘモリティカ、ブランハメラ・カタラーリス、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター・フィタス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、淋菌、髄膜炎菌、キンゲラ属、モラクセラ属、ガードネレラ・バギナリス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・ディスタソニス、バクテロイデス3452Aホモロジー群、バクテロイデス・ブルガータス、バクテロイデス・オバタス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・エガーシイ、バクテロイデス・スプランクニカス、クロストリジウム・ディフィシル、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、癩菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・アルセランス、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、化膿連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、スタフィロコッカス・インターメジウス、スタフィロコッカス・ヒイカス亜種ヒイカス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・ホミニスおよびスタフィロコッカス・サッカロリティカスが挙げられる。さらなる例としては、炭疽菌、枯草菌、ブルセラ菌、葉腐細菌および野兎病菌が挙げられる。
抗原標的の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定の抗原標的の検出を含む。抗原は、抗体、その結合断片、または等温増幅などの増幅用に構成されたプライマーに連結されたアプタマーを使用して検出される。特定の抗原に対する抗体およびアプタマーは、市販品および／または当技術分野で公知の技術を利用して容易に入手することができる。本明細書において、「抗原」は、抗体、その結合断片、またはアプタマーが特異的に結合する化合物または組成物を含む。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出される抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、および医薬化合物などの小分子が挙げられる。分析種のさらなる例としては、リシン、アブリン、ボツリヌス毒素またはブドウ球菌エンテロトキシンＢなどの毒素が挙げられる。
寄生虫標的の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定の寄生虫標的の検出を含む。寄生虫標的は、寄生虫の核酸、寄生虫のタンパク質および／または寄生虫の活性産物（毒素および／または酵素もしくは酵素活性など）を含む。特定の寄生虫を示すヌクレオチド配列は、公開データベースから容易に入手することができる。等温増幅に有用なプライマーは、そのような寄生虫標的の核酸配列から容易に設計することができる。特定の寄生虫のタンパク質に対する抗体およびアプタマーは、市販品および／または当技術分野で公知の技術を利用して容易に入手することができる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出される寄生虫としては、アカントアメーバ属、バベシア属、多型バベシア、フタゴバベシア、バベシア・エクイ、ネズミバベシア、バベシア・ダンカニ、バラムチア・マンドリルリス、大腸バランチジウム、ブラストシスチス属、クリプトスポリジウム属、サイクロスポーラ・カエタネンシス、二核アメーバ、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、戦争イソスポラ、リーシュマニア属、ネグレリア・フォーレリ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale curtisi、Plasmodium ovale wallikeri）、四日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫、リノスポリジウム・セーベリ、ヒト肉胞子虫、ブタ肉胞子虫、トキソプラズマ・ゴンディ、膣トリコモナス、トリパノソーマ・ブルーセイまたはトリパノソーマ・クルージなどの原虫；Bertiella mucronata、サル条虫、条虫綱、多頭条虫、広節裂頭条虫、蝟粒条虫、多包条虫、フォーゲル包条虫、ヤマネコ包条虫、小形条虫、縮小条虫、マンソン裂頭条虫、無鉤条虫、有鉤条虫などの特定の蠕虫；肝吸虫、タイ肝吸虫（Clonorchis viverrini）、槍形吸虫、棘口吸虫（Echinostoma echinatum）、肝蛭、巨大肝蛭、肥大吸虫、有棘顎口虫、剛棘顎口虫、横川吸虫、メトロキス・コンジャンクタス（Metorchis conjunctus）、タイ肝吸虫（Opisthorchis viverrini）、ネコ肝吸虫、肝吸虫、ウェステルマン肺吸虫、アフリカ肺吸虫、カリエンシス肺吸虫（Paragonimus caliensis）、ケリコット肺吸虫、スクリヤビン肺吸虫、フォーゲル肺吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫、インターカラツム住血吸虫、メコン住血吸虫、住血吸虫属、トリコビルハルジア・レジェンティ（Trichobilharzia regenti）または住血吸虫科などの特定の吸虫；十二指腸鉤虫、アメリカ鉤虫、コスタリカ住血線虫、アニキサス、回虫属、ヒト回虫、アライグマ回虫、マレー糸状虫、チモール糸状虫、腎虫、メジナ虫、ヒト蟯虫、Enterobius gregorii、土壌線虫、ロア糸状虫、マンソネラ・ストレプトセルカ、回旋糸状虫、糞線虫、カリフォルニア眼虫、東洋眼虫、イヌ回虫、ネコ回虫、旋毛虫（Trichinella spiralis、Trichinella britovi、Trichinella nelsoni、Trichinella nativa）、ヒト鞭虫、イヌ鞭虫またはバンクロフト糸状虫などの特定の回虫；原始鉤頭虫目、鎖状鉤頭虫、鼻腔舌虫、ヒツジバエ上科、クロバエ科、ニクバエ科、ラセンウジバエ（クロバエ科）、スナノミ、トコジラミ科（トコジラミ）、ヒトヒフバエなどのその他の寄生虫などの内部寄生虫が挙げられる。寄生虫のさらなる例としては、ヒトジラミ、コロモジラミ、ケジラミ、ニキビダニ、コニキビダニ、イヌニキビダニ、ヒゼンダニ；ツツガムシ科などのクモ綱；ヒトノミ；マダニ科および／もしくはヒメダニ科などのクモ綱などの外部寄生虫が挙げられる。
マイクロRNA標的の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定のマイクロRNA（miRNA）標的の検出を含む。miRNAとしては、RNAサイレンシングまたは遺伝子発現の転写後調節において機能するノンコーディング低分子RNAが挙げられる。miRNAのいくつかは、異常なDNAメチル化やヒストン修飾パターンなどの、異常なエピジェネティックパターンによって引き起こされる様々なヒト疾患における制御異常と関連している。例えば、対象から得た試料中での特定のmiRNAの有無により疾患または病態が示される。miRNAの検出および等温増幅に有用なプライマーは、miRNAのヌクレオチド配列から容易に設計することができる。miRNAのヌクレオチド配列は、公開データベースから容易に入手することができる。本明細書で提供する方法、システムおよび組成物を用いて検出されるmiRNA標的としては、hsa-miR-1、hsa-miR-1-2、hsa-miR-100、hsa-miR-100-1、hsa-miR-100-2、hsa-miR-101、hsa-miR-101-1、hsa-miR-101a、hsa-miR-101b-2、hsa-miR-102、hsa-miR-103、hsa-miR-103-1、hsa-miR-103-2、hsa-miR-104、hsa-miR-105、hsa-miR-106a、hsa-miR-106a-1、hsa-miR-106b、hsa-miR-106b-1、hsa-miR-107、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-122、hsa-miR-122a、hsa-miR-123、hsa-miR-124a、hsa-miR-124a-1、hsa-miR-124a-2、hsa-miR-124a-3、hsa-miR-125a、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-125b-1、hsa-miR-125b-2、hsa-miR-126、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-127、hsa-miR-128a、hsa-miR-128b、hsa-miR-129、hsa-miR-129-1、hsa-miR-129-2、hsa-miR-130、hsa-miR-130a、hsa-miR-130a-1、hsa-miR-130b、hsa-miR-130b-1、hsa-miR-132、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-134、hsa-miR-135a、hsa-miR-135b、hsa-miR-136、hsa-miR-137、hsa-miR-138、hsa-miR-138-1、hsa-miR-138-2、hsa-miR-139、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-140、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-144、hsa-miR-145、hsa-miR-146a、hsa-miR-146b、hsa-miR-147、hsa-miR-148a、hsa-miR-148b、hsa-miR-149、hsa-miR-15、hsa-miR-150、hsa-miR-151、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-152、hsa-miR-153、hsa-miR-154、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-15a-2、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-16-1、hsa-miR-16-2、hsa-miR-16a、hsa-miR-164、hsa-miR-170、hsa-miR-172a-2、hsa-miR-17、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-17-92、hsa-miR-18、hsa-miR-18a、hsa-miR-18b、hsa-miR-181a、hsa-miR-181a-1、hsa-miR-181a-2、hsa-miR-181b、hsa-miR-181b-1、hsa-miR-181b-2、hsa-miR-181c、hsa-miR-181d、hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-184、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-187、hsa-miR-188、hsa-miR-189、hsa-miR-190、hsa-miR-191、hsa-miR-192、hsa-miR-192-1、hsa-miR-192-2、hsa-miR-192-3、hsa-miR-193a、hsa-miR-193b、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-196a、hsa-miR-196a-2、hsa-miR-196b、hsa-miR-197、hsa-miR-198、hsa-miR-199a、hsa-miR-199a-1、hsa-miR-199a-1-5p、hsa-miR-199a-2、hsa-miR-199a-2-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-19a、hsa-miR-19b、hsa-miR-19b-1、hsa-miR-19b-2、hsa-miR-200a、hsa-miR-200b、hsa-miR-200c、hsa-miR-202、hsa-miR-203、hsa-miR-204、hsa-miR-205、hsa-miR-206、hsa-miR-207、hsa-miR-208、hsa-miR-208a、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-210、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-213、hsa-miR-214、hsa-miR-215、hsa-miR-216、hsa-miR-217、hsa-miR-218、hsa-miR-218-2、hsa-miR-219、hsa-miR-219-1、hsa-miR-22、hsa-miR-220、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-224、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-24、hsa-miR-24-1、hsa-miR-24-2、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26a-1、hsa-miR-26a-2、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-28、hsa-miR-296、hsa-miR-298、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29a-2、hsa-miR-29b、hsa-miR-29b-1、hsa-miR-29b-2、hsa-miR-29c、hsa-miR-301、hsa-miR-302、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-30a、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-30b、hsa-miR-30c、hsa-miR-30c-1、hsa-miR-30d、hsa-miR-30e、hsa-miR-30e、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-31、hsa-miR-31a、hsa-miR-32、hsa-miR-32、hsa-miR-320、hsa-miR-320-2、hsa-miR-320a、hsa-miR-322、hsa-miR-323、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-326、hsa-miR-328、hsa-miR-328-1、hsa-miR-33、hsa-miR-330、hsa-miR-331、hsa-miR-335、hsa-miR-337、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-338、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-34a、hsa-miR-340、hsa-miR-340、hsa-miR-341、hsa-miR-342、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-345、hsa-miR-346、hsa-miR-347、hsa-miR-34a、hsa-miR-34b、hsa-miR-34c、hsa-miR-351、hsa-miR-352、hsa-miR-361、hsa-miR-362、hsa-miR-363、hsa-miR-355、hsa-miR-365、hsa-miR-367、hsa-miR-368、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-370、hsa-miR-371、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-374、hsa-miR-375、hsa-miR-376a、hsa-miR-376b、hsa-miR-377、hsa-miR-378、hsa-miR-378、hsa-miR-379、hsa-miR-381、hsa-miR-382、hsa-miR-383、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-419、hsa-miR-422a、hsa-miR-422b、hsa-miR-423、hsa-miR-424、hsa-miR-429、hsa-miR-431、hsa-miR-432、hsa-miR-433、hsa-miR-449a、hsa-miR-451、hsa-miR-452、hsa-miR-451、hsa-miR-452、hsa-miR-452、hsa-miR-483、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-484、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-486、hsa-miR-487b、hsa-miR-489、hsa-miR-491、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-492、hsa-miR-493-3p、hsa-miR-493-5p、hsa-miR-494、hsa-miR-495、hsa-miR-497、hsa-miR-498、hsa-miR-499、hsa-miR-5、hsa-miR-500、hsa-miR-501、hsa-miR-503、hsa-miR-508、hsa-miR-509、hsa-miR-510、hsa-miR-511、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-513、hsa-miR-513-1、hsa-miR-513-2、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-516-5p、hsa-miR-516-3p、hsa-miR-518b、hsa-miR-519a、hsa-miR-519d、hsa-miR-520a、hsa-miR-520c、hsa-miR-521、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-539、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-550、hsa-miR-551a、hsa-miR-561、hsa-miR-563、hsa-miR-565、hsa-miR-572、hsa-miR-582、hsa-miR-584、hsa-miR-594、hsa-miR-595、hsa-miR-598、hsa-miR-599、hsa-miR-600、hsa-miR-601、hsa-miR-602、hsa-miR-605、hsa-miR-608、hsa-miR-611、hsa-miR-612、hsa-miR-614、hsa-miR-615、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-622、hsa-miR-627、hsa-miR-628、hsa-miR-635、hsa-miR-637、hsa-miR-638、hsa-miR-642、hsa-miR-648、hsa-miR-652、hsa-miR-654、hsa-miR-657、hsa-miR-658、hsa-miR-659、hsa-miR-661、hsa-miR-662、hsa-miR-663、hsa-miR-664、hsa-miR-7、hsa-miR-7-1、hsa-miR-7-2、hsa-miR-7-3、hsa-miR-708、hsa-miR-765、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-802、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-9、hsa-miR-9-1、hsa-miR-9-3、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-92、hsa-miR-92-1、hsa-miR-92-2、hsa-miR-9-2、hsa-miR-92、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-95、hsa-miR-96、hsa-miR-98、hsa-miR-99aおよび／またはhsa-miR-99bが挙げられる。
農業分野の分析種の一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物のいくつかの実施形態は、特定の農業分野の分析種の検出を含む。農業分野の分析種としては、核酸、タンパク質または小分子が挙げられる。特定の農業分野の分析種を示すヌクレオチド配列は、公開データベースから容易に入手することができる。等温増幅に有用なプライマーは、そのような農業分野の分析種の核酸配列から容易に設計することができる。特定の農業分野の分析種のタンパク質に対する抗体およびアプタマーは、市販品および／または当技術分野で公知の技術を利用して容易に入手することができる。
本明細書で提供する方法および装置の実施形態のいくつかは、肉加工品、魚加工品、またはビール、ブドウ酒、パンなどの酵母製品に含まれる生物またはその産物の有無を同定するために使用される。いくつかの実施形態において、生物種に特異的な抗体もしくはアプタマー、または生物種に特異的なプライマーを使用して、食品中の特定の生物の有無を同定する。
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、農薬の検出を含む。いくつかの実施形態において、土壌試料または食品試料などの試料中で農薬が検出される。本明細書に記載する装置および方法を用いて検出される農薬としては、除草剤、殺虫剤または殺真菌剤が挙げられる。除草剤の例としては、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、アトラジン、グリホサート、メコプロップ、ジカンバ、パラコート、グルホシネート、メタムナトリウム、ダゾメット、ジチオピル、ペンディメタリン、EPTC、トリフルラリン、フラザスルフロン、メソスルフロンメチル、ジウロン、ニトロフェン、ニトロフルオルフェン、アシフルオルフェン、メソトリオン、スルコトリオンおよびニチシノンが挙げられる。本明細書に記載の装置および方法を用いて検出される殺虫剤の例としては、有機塩化物、有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ネオニコチノイドおよびリアノイドが挙げられる。本明細書に記載の装置および方法を用いて検出される殺真菌剤の例としては、カルベンダジム、ジエトフェンカルブ、アゾキシストロビン、メタラキシル、メタラキシルＭ、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、クロロタロニル、テブコナゾール、ジネブ、マンコゼブ、テブコナゾール、ミクロブタニル、トリアジメホン、フェンブコナゾール、デオキシニバレノールおよびマンコゼブが挙げられる。
バイオマーカーの一例の概要
本明細書で提供する方法、システムおよび組成物の実施形態のいくつかは、特定の疾患の特定のバイオマーカーの検出を含む。バイオマーカーとして、核酸、タンパク質、タンパク質の断片および抗原を挙げることができる。いくつかのバイオマーカーは、本明細書で提示する標的を含んでいてもよい。疾患の例としては、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、消化管間質腫瘍、白血病およびリンパ腫、肺がん、黒色腫、脳腫瘍および膵臓がんなどのがんが挙げられる。いくつかの実施形態は、試料中のバイオマーカーの有無またはバイオマーカーの濃度の検出を含んでいてもよい。バイオマーカーは、特定の疾患の有無または特定の疾患のステージを示しうる。バイオマーカーの例としては、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、HER-2/neu、EGFR、KRAS、UGT1A1、c-KIT、CD20、CD30、FIP1L1-PDGFRα、PDGFR、フィラデルフィア染色体（BCR/ABL）、PML/RARα、TPMT、UGT1A1、EML4/ALK、BRAF、および特定のアミノ酸の濃度上昇（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）が挙げられる。
液滴増幅産物またはデジタル増幅産物を検出するためのシステム、装置、キットおよび方法の一例の概要
いくつかの実施形態は、鋳型核酸の増幅産物および／または核酸増幅産物を検出するための、システム、方法、キットまたは装置に関する。いくつかの実施形態において、前記システム、方法、キットまたは装置は、液滴形成ユニット、任意で設けられる温度制御ユニット、および／または検出ユニットを含む。例えば、前記システム、方法、キットまたは装置は、図３７および図３８に示すか、あるいは実施例12～14において説明する液滴形成ユニット、温度制御ユニットおよび／または検出ユニットのいずれを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、前記システム、装置または方法は、液滴形成ユニットと温度制御ユニットと検出ユニットとを含み、
前記液滴形成ユニットは、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を含む試料リザーバーと、
油および界面活性剤（非イオン界面活性剤など）を含む油相リザーバーと、
前記試料リザーバーおよび前記油相リザーバーと流体連通しており、かつ前記油と前記水性反応混合物を混合することにより、該水性反応混合物と該油を含む液滴を形成するように構成されている混合チャンバーと
を含み、
前記温度制御ユニットは、加熱ユニットを含み、かつ所望の温度で所望の時間にわたり前記液滴を加熱するように構成されており、
前記検出ユニットは、
前記液滴を輸送するように構成されており、かつ前記混合チャンバーと流体連通している流路または導管と、
前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
を含み、
前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される。
液滴形成ユニット
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、液滴形成ユニットを含む。いくつかの実施形態は、試料リザーバーを含む。いくつかの実施形態において、液滴形成ユニットに試料リザーバーが含まれる。いくつかの実施形態において、この試料リザーバーは、PCR反応溶液または等温増幅反応溶液などの水性反応混合物を含む。この水性反応混合物は、本明細書に記載の核酸増幅反応混合物を含んでいてもよく、本明細書に記載の、核酸増幅反応混合物用の試薬を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記水性反応混合物は、鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む。いくつかの実施形態において、前記水性反応混合物は、前記鋳型核酸を含む細胞や小胞などの実体のあるものを含む。前記鋳型核酸は、本明細書に記載の標的のいずれかに由来する核酸を含んでいてもよい。
本明細書に記載の方法、システムおよび装置の実施形態のいくつかにおいて、前記水性反応混合物は、前記鋳型核酸を含むビーズまたは粒子を含み、該ビーズまたは粒子は、解放可能に該鋳型核酸に結合されているか、または解放不能に該鋳型核酸に結合されている。例えば、前記鋳型核酸は、磁気金属ビーズに結合する抗体などのタンパク質を介して、磁気金属ビーズに結合されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記ビーズまたは粒子は、金属、ポリマー、プラスチックもしくはガラスを含むか、または磁気を帯びている。いくつかの実施形態において、前記抗体は、化学結合を介して前記ビーズに結合されているか、あるいは前記ビーズに前記抗体が化学的に結合されている。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、油相リザーバーを含む。いくつかの実施形態において、前記液滴形成ユニットに油相リザーバーが含まれる。いくつかの実施形態において、油相リザーバーは、油および／または界面活性剤（非イオン界面活性剤など）を含む。いくつかの実施形態において、油相リザーバーは、油と界面活性剤を含む油相を含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、ポンプを含む。本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記液滴形成ユニットに前記ポンプが含まれる。いくつかの実施形態において、前記ポンプは、前記試料リザーバーから前記水性反応混合物を押し出すように構成されており、かつ／または前記油相リザーバーから前記油または油相を押し出すように構成されている。別々のポンプを使用して、前記水性反応混合物と油または油相とを押し出してもよい。いくつかの実施形態において、前記ポンプは、シリンジポンプまたは空気ポンプを含む。いくつかの実施形態において、前記ポンプは、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力を印加するように構成されている。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、混合チャンバーを含む。いくつかの実施形態において、前記液滴形成ユニットに混合チャンバーが含まれる。いくつかの実施形態において、混合チャンバーは、前記試料リザーバーおよび／または前記油相リザーバーと流体連通している。いくつかの実施形態において、混合チャンバーは、前記油と前記水性反応混合物を混合することにより、該水性反応混合物と該油を含む液滴を形成するように構成されている。例えば、前記ポンプにより、前記水性反応混合物および／または前記油または油相を混合チャンバー内に押し出してもよい。いくつかの実施形態において、前記ポンプもしくは第２のポンプまたはシリンジにより、前記水性反応混合物および／または前記油もしくは油相を混合チャンバー内で前後に行き来させる。例えば、前記水性反応混合物と前記油相の混合物を数回にわたりシリンジの内外に行き来させてもよく、あるいは２本のシリンジの間で数回にわたり行き来させてもよい。いくつかの実施形態において、前記混合チャンバーは、振盪または攪拌により前記液滴を形成または維持する。
液滴
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、液滴を含む。いくつかの実施形態において、この液滴は、前記混合チャンバー内で形成されるか、または前記混合チャンバーにより形成される。いくつかの実施形態において、前記液滴は、油もしくは油相および／または水溶液（水性反応混合物など）を含む。いくつかの実施形態において、各液滴は、油または油相と水性反応混合物とを混合することにより形成される。いくつかの実施形態において、各液滴の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、該システムまたは装置は、前記液滴を選択的に押し出すように構成されている。例えば、本明細書に記載のカートリッジの各ウェルは、液滴を収容および／または輸送するように構成された流路または導管に各ウェルを接続する開口部を備えていてもよい。この開口部は、例えば、膜、シールまたは出入り口によって可逆的に閉鎖してもよく、この膜、シールまたは出入り口を開けて、液滴を流路または導管に押し出す。いくつかの実施形態において、この開口部の大きさは、圧力（例えば、減圧などの陰圧または陽圧）などの力によって、液滴がこの開口部を通って流路内または導管内に押し出されない限り、該液滴を内部に保持できるように十分に小さいものとなっている。いくつかの実施形態において、前記開口部の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmであるか、１つ以上の液滴の直径とほぼ同じ直径である。いくつかの実施形態は、例えば、0.01～0.1psi、0.1～1psi、１～10psiまたは10～100psiの圧力を加えることによって、液滴を開口部から流路へと押し流すまたは選択的に押し出すポンプを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、液滴（または各液滴）はエマルションを含む。本明細書で提供する方法の実施形態のいくつかは、圧力下で、例えば、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力下で、油に前記水性反応混合物を導入することにより前記エマルションを形成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記エマルションを形成するように構成されている反応チャンバー、または前記液滴を選択的に押し出すように構成されている反応チャンバーにおいて行われる。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記液滴は油相を含む。いくつかの実施形態において、この油相は、非イオン界面活性剤および／または油を含む。いくつかの実施形態において、前記非イオン界面活性剤は、オレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80および／またはTriton X-100を含む。いくつかの実施形態において、前記油は鉱油を含む。いくつかの実施形態において、前記液滴の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
温度制御ユニット
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、温度制御ユニットを含む。いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットは加熱ユニットを含む。いくつかの実施形態において、前記加熱ユニットは、設定温度で一定時間にわたり前記液滴を加熱するように構成されている。前記温度制御ユニットまたは前記加熱ユニットの実施形態のいくつかは、サーマルサイクル加熱ユニットを含む。例えば、前記温度制御ユニットまたは前記加熱ユニットは、72℃、95℃および60℃のサイクルで加熱を行う。いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットまたは前記加熱ユニットは、例えば、98℃、65℃、37℃または４℃といった一定の温度などで温度を維持する。いくつかの実施形態において、前記試料リザーバー、前記油相リザーバー、前記混合チャンバーおよび前記温度制御ユニットのうちのいずれかは、それ以外のリザーバー、チャンバーまたはユニットと接続されている。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、加熱チャンバーを含む。いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットは、前記加熱チャンバーを含み、該加熱チャンバーは、例えば、加熱された反応チャンバー、加熱されたパッド、加熱された支持体などである。いくつかの実施形態において、前記加熱された反応チャンバーは、前記検出ユニットの前記流路または導管を含むか、または前記検出ユニットの前記流路の一部を含む。いくつかの実施形態において、前記加熱された反応チャンバーまたは前記混合チャンバーは、前記液滴を選択的に押し出すように構成されている。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記混合チャンバーに前記温度制御ユニットが含まれる。いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットは、前記混合チャンバーが油と水性反応混合物を混合している間に、液滴を所望の温度に加熱するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記温度制御ユニットは、前記混合チャンバーが油と水性反応混合物を混合した後に、液滴を所望の温度に加熱するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記混合チャンバーは、前記加熱チャンバーと分離されている。
流路および導管
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、流路または導管を含む。いくつかの実施形態において、この流路または導管は、例えば、本明細書において説明した液滴などの、液滴、複数の液滴、または１つ以上の液滴を輸送するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットは、このような流路または導管を含む。いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、前記試料リザーバー、前記油相リザーバー、前記混合チャンバーおよび／または前記温度制御ユニットと流体連通している。
本明細書で提供するシステムまたは装置の実施形態のいくつかにおいて、前記流路または導管は、チューブ、ナノチューブ、マイクロチューブ、チャネル、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを含む。いくつかの実施形態において、前記流路または導管の直径は、100～500nm、500～1000nm、１～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、壁面を含むか、または壁面に囲まれており、これらの壁面からなる断面は、正方形、長方形、円形または別の形状を含む。いくつかの実施形態において、前記流路または導管は、本明細書において「チャネルの一例の概要」という表題の節で述べたチャネルであるか、このチャネルを含むか、またはこのチャネルで構成されている。いくつかの実施形態は、「検出ユニット」という表題の節で述べたような、本明細書に記載の複数の流路もしくは複数の導管、または分岐した流路もしくは分岐した導管を含む。
検出ユニット
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、検出ユニットを含む。いくつかの実施形態は、第２の検出ユニットおよび／または追加の検出ユニットを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記検出ユニットは、流路または導管を含み、例えば、前記液滴形成ユニットで形成された液滴を輸送するように構成された流路または導管を含む。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットは、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の追加の流路または導管をさらに含む。いくつかの実施形態は、前記追加の流路および／または導管のそれぞれに付属または接触している追加の電場発生ユニットまたは電気検知素子をさらに含む。
本明細書で提供するシステムまたは装置の実施形態のいくつかにおいて、前記流路もしくは導管および／または前記追加の流路もしくは導管は、該流路または導管から分枝または分岐した流路または導管を備える分枝形状または分岐形状を含み、前記分枝または分岐した流路または導管が、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成されている。いくつかの実施形態は、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の、前記流路または導管から分枝または分岐した追加の流路または導管をさらに含む。いくつかの実施形態は、前記分枝または分岐した流路または導管のそれぞれに付属している追加の電場発生ユニットおよび／または電気検知素子をさらに含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、電場発生ユニットを含む。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットに電場発生ユニットが含まれる。いくつかの実施形態において、電場発生ユニットは、前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記電場発生ユニットは、本明細書に記載の電場発生ユニットであるか、本明細書に記載の電場発生ユニットを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、電気検知素子を含む。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットに電気検知素子が含まれる。いくつかの実施形態において、この電気検知素子は、増幅された核酸を含まない試料または対照との比較により、電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変化または変調を測定するように構成されている。例えば、いくつかの実施形態において、電気信号の変化または変調は、本明細書に記載の電気信号のどのような変化または変調であってもよい。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記電気信号の変化または変調によって、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される。前記電気信号の例としては、インピーダンスおよび静電容量が挙げられる。電気信号の変化または変調は、増幅された核酸を含む液滴が溶液中に存在する前後で、同じ溶液中の信号を比較したものであってもよい。対照の一例として、増幅された核酸を含まない液滴が挙げられる。対照の別の例として、液滴を含まない溶液、増幅された核酸を含まない溶液、および核酸を含まない溶液が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記電気検知ユニットは、本明細書に記載の電気検知ユニットであるか、本明細書に記載の電気検知ユニットを含む。
複数の流路もしくは複数の導管、または分岐した流路または分岐した導管を含む、本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、該システムまたは装置は、１つ以上の追加の電場発生ユニットおよび／または追加の電気検知ユニットをさらに含む。いくつかの実施形態において、各電場発生ユニットおよび／または各電気検知ユニットは、本明細書に記載の１本以上のチャネルまたは流路に付随または隣接している。
本明細書で提供するシステムまたは装置の実施形態のいくつかにおいて、前記電場発生ユニットおよび／または前記電気検知素子は、本明細書に記載の流路または導管などの流路または導管に付属または接触している単一または複数の電極パッドを含む。いくつかの実施形態において、前記単一または複数の電極パッドは、前記流路または導管に蒸着もしくは印刷されているか、または前記流路または導管に接触している。例えば、複数の電極および複数のチャネルを用いたインピーダンスの検出が必要ではない実施形態のいくつかにおいて、並列ではない１組の表面マイクロ電極を用いて、マイクロチャネル内を流れる増幅産物含有液滴を検出してもよい。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルは、その両面に印刷された１組または複数組の電極を含み、かつ／または増幅産物を含む液滴が通過し、測定される通路を提供する。例えば、H. Wang, N. Sobahi, & A. Han, Impedance spectroscopy-based cell/particle position detection in microfluidic systems, 17 LAB ON A CHIP 1264 (2017)（この文献は引用により明示的に本明細書に援用される）に従って、刺激電極および／または検出電極（すなわち、１つ以上の電場発生ユニットおよび／または電気検知素子）を配置または使用してもよい。いくつかの実施形態において、前記電極は、フレキシブル回路として、PETフィルムなどの基板上にスクリーン印刷されている。いくつかの実施形態において、前記電極は、所望の形状にエッチングされたものであり、かつ／または、例えば、基板上にスクリーン印刷された電極にマスクを使用して電極を成形してもよい。前記基板は、前記流路または導管のどの部分を含んでいてもよく、前記流路または導管が、前記基板のどの部分を含んでいてもよい。
カートリッジ
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかは、カートリッジを含む。いくつかの実施形態において、このカートリッジは、本明細書において「小型流体工学カートリッジの一例の概要」という表題の節などで述べたカートリッジまたは小型流体工学カートリッジであるか、このようなカートリッジまたは小型流体工学カートリッジを含むか、またはこのようなカートリッジまたは小型流体工学カートリッジで構成されている。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、該システムまたは装置は、本明細書に記載の液滴形成ユニット、温度制御ユニットおよび／または検出ユニットのすべてまたはその一部を収容したカートリッジを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記カートリッジは、ナノリットルウェルやマイクロリットルウェルなどのウェル、流路もしくは導管、任意で設けられる液滴形成ユニット、任意で設けられる温度制御ユニットおよび／または検出ユニットを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、該システムまたは装置は、ナノリットルウェルと、流路または導管と、検出ユニットとを含むカートリッジを含み、
前記ナノリットルウェルのそれぞれが、鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物と油とを含む液滴を収容するように構成されており、
前記流路または導管のそれぞれが、前記ナノリットルウェルの少なくとも１つと流体連通しており、かつ前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成されており、
前記検出ユニットが、
各流路または各導管に付属しており、
前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
を含み、
前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される。
本明細書で提供するシステムまたは装置の実施形態のいくつかにおいて、前記カートリッジは、ナノリットルウェルやマイクロリットルウェルなどのウェルを含む。いくつかの実施形態において、各ウェルは、本明細書で提供する液滴などの液滴を収容するように構成されている。いくつかの実施形態において、各液滴は、鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物と油とを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ウェルは、一連のウェルを含む。いくつかの実施形態において、前記ナノリットルウェルは、一連のナノリットルウェルを含む。いくつかの実施形態において、前記マイクロリットルウェルは、一連のマイクロリットルウェルを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記カートリッジは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、１～10個、１～100個、10～25個、25～50個、48個、約48個、25～75個、50～100個、100～250個、250～500個またはそれ以上の個数のナノリットルウェルまたはマイクロリットルウェルを含む。いくつかの実施形態において、前記カートリッジは、１～10nl、10～100nl、100～500nlまたは500～1000nlの容量のナノリットルウェルを含む。いくつかの実施形態において、前記カートリッジは、1～10μl、10～100μl、100～500μlまたは500～1000μlの容量のマイクロリットルウェルを含む。いくつかの実施形態において、前記カートリッジは、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、1～10本、1～100本、10～25本、25～50本、48本、約48本、25～75本、50～100本、100～250本、250～500本またはそれ以上の本数の流路または導管を含む。いくつかの実施形態において、各ナノリットルウェルの直径は、100～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記カートリッジは、本明細書に記載の液滴を選択的に押し出するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記液滴は、「液滴」および「流路および導管」という表題の節などで述べたように、本明細書に記載の流路内または導管内に押し出される。いくつかの実施形態において、前記カートリッジの各流路または各導管は、前記ナノリットルウェルのうちの少なくとも１個と流体連通している。いくつかの実施形態において、各流路または各導管は、前記液滴のうちの少なくともいくつかを輸送するように構成されている。
本明細書で提供するシステム、方法または装置の実施形態のいくつかは、前記液滴が、前記ナノリットルウェル内および／または前記流路内もしくは前記導管内に存在する場合に、前記液滴を所望の温度に加熱または維持するように構成された温度制御ユニットまたは加熱ユニットをさらに含む。いくつかの実施形態において、この温度制御ユニットまたは加熱ユニットは、本明細書に記載の温度制御ユニットまたは加熱ユニットである。いくつかの実施形態において、前記カートリッジは、前記温度制御ユニットまたは前記加熱ユニットを含む。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記カートリッジは、本明細書に記載の検出ユニットなどの検出ユニットを含む。いくつかの実施形態において、検出ユニットは各流路または各導管に付属している。いくつかの実施形態において、前記検出ユニットは、前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定するように構成されている電気検知素子とを含み、前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される。
方法
いくつかの実施形態は、鋳型核酸の増幅産物および／または核酸増幅産物を検出する方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書で提供するシステム、装置および／またはキットを使用して実施される。
前記方法3900の一例を図３９に示す。いくつかの実施形態において、この方法は、液滴を加熱チャンバーに導入する工程3910、前記液滴中で増幅反応を行う工程3920、および／または前記液滴中の電気信号の変化または変調を測定することにより増幅産物を検出する工程3930を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法3900は、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を含む油性液滴を加熱チャンバーに導入する工程3910；
前記油性液滴中の前記水性反応混合物に対して核酸増幅反応を行うことによって、前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程3920；ならびに
対照との比較により、電界を印加したときの前記油性液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定することによって、該油性液滴中の前記鋳型核酸の増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される工程3930
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法3900は、油性液滴を加熱チャンバーまたは温度制御ユニット（例えば、本明細書に記載の加熱チャンバーまたは温度制御ユニット）に導入する工程3910を含む。いくつかの実施形態において、前記油性液滴は、本明細書に記載の水性反応混合物を含む。この水性反応混合物は、例えば、鋳型核酸、緩衝液および／または核酸増幅試薬を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、前記方法3900は、前記油性液滴中の前記水性反応混合物に対して核酸増幅反応を行うことによって、前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程3920を含む。いくつかの実施形態によれば、前記核酸増幅は、本明細書に記載の核酸増幅を含んでいてもよい。
本明細書で提供するシステム、装置または方法の実施形態のいくつかにおいて、前記核酸増幅または前記核酸増幅試薬は、「増幅の一例の概要」という表題の節で述べたような、本明細書に記載の核酸増幅または核酸増幅試薬を含む。例えば、前記核酸増幅試薬は、PCR試薬、等温増幅試薬、LAMP試薬、RPA試薬またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅試薬は、等温核酸増幅法に適合した試薬を含み、該等温核酸増幅法は、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などである。
本明細書に記載の方法、装置、キットおよびシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記核酸増幅、前記核酸増幅試薬および／または前記水性反応混合物は、標識、色素、濁度測定用試薬、蛍光色素、二本鎖核酸インターカレーター剤、シーケンシング用インデックスおよび／またはナノ粒子などの検出試薬を含んでいない。いくつかの実施形態において、前記核酸増幅および／または前記増幅産物の存在の検出は、色素、濁度測定用試薬、蛍光色素、二本鎖核酸インターカレーター剤、シーケンシング用インデックスおよび／またはナノ粒子などの検出試薬の非存在下で行われる。いくつかの実施形態において、核酸増幅、核酸増幅試薬および／または水性反応混合物に含まれる何らかのプライマーおよび／またはあらゆるプライマーは、標識、色素および／またはその他の検出試薬を含んでいない。
いくつかの実施形態において、前記方法3900は、電界を印加したときの前記油性液滴におけるインピーダンスまたは静電容量などの電気信号の変調を測定することによって、該油性液滴中の前記鋳型核酸の増幅産物の存在を検出する工程3930を含む。いくつかの実施形態において、前記電気信号の変化または変調を対照と比較する。いくつかの実施形態において、前記電気信号の変化または変調、または対照と比較したときの前記電気信号の変化または変調によって、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される。前記方法の実施形態のいくつかは、流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程をさらに含み、該流路内または該導管内に該液滴が存在する場合に、該液滴に電界が印加される。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載のシステム、装置もしくはカートリッジにおいて実施されるか、または本明細書に記載のカートリッジ、システム、キットもしくは装置の一部において実施される。
いくつかの実施形態において、前記方法は、
鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を提供する工程；
エマルションに封入された前記水性反応混合物の液滴を形成する工程；
核酸増幅反応を行うことによって、各液滴内に前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程；
流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程；ならびに／または
対照との比較により、電界を印加したときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定することによって、各液滴中の前記増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記増幅産物の存在が示される工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、鋳型核酸、緩衝液および／または核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を提供する工程を含む。前記方法の実施形態のいくつかは、エマルションに封入された前記水性反応混合物の液滴を形成する工程を含む。前記方法の実施形態のいくつかは、核酸増幅反応を行うことによって、各液滴内に前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程を含む。前記方法の実施形態のいくつかは、流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程を含む。前記方法の実施形態のいくつかは、対照との比較により、電界を印加したときの各液滴における電気信号（インピーダンスなど）の変調を測定することによって、各液滴中の前記増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記増幅産物の存在が示される工程を含む。
キット
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のシステムまたは装置を含むキットを含む。このキットの実施形態のいくつかは、本明細書に記載の一連の核酸増幅試薬、油または界面活性剤を含む。
実施例１－PDMS製チップにおけるfC 4 D LAMP法による増幅前後の検出
NEB社の標準プロトコルに従って、標的としてのインフルエンザ菌ゲノムの５’末端の非翻訳領域を使用したLAMP反応ミックスを調製した。この反応ミックスを小分けし、増幅前バイアル（陰性対照）と増幅後バイアル（陽性対照）に入れた。増幅前バイアルは、増幅を阻止するために85℃で20分間加熱し、不活化した。増幅後バイアルは、63℃で60分間増幅した。各バイアルから交互に一定量を取り、室温においてPDMS／ガラス製チップ（v.1.1）に順にロードしながら、リアルタイムでデータを収集した。図２４は、センサ電圧の経時変化を示すグラフである。
実施例２－PDMS製チップにおける全血を用いたfC 4 Dによる増幅前後の検出
0％(v/v)、1％(v/v)または5％(v/v)の全血と、標的としてのインフルエンザ菌ゲノムの５’末端の非翻訳領域を使用して、反応ミックスを調製した。この反応ミックスを小分けし、増幅前バイアル（陰性対照）と増幅後バイアル（陽性対照）に入れた。増幅前バイアルは、増幅を阻止するために85℃で20分間加熱し、不活化した。増幅後バイアルは、63℃で60分間増幅した。各バイアルから交互に一定量を取り、室温においてPDMS／ガラス製チップ（v.1.1）に順にロードしながら、リアルタイムでデータを収集した。図２５、図２６および図２７は、増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）におけるセンサ電圧の経時変化を、0％、1％および5％の全血のそれぞれについて示したグラフである。
実施例３－LAMP法の増幅前後におけるろ過
実施例１と同様に試料を調製した。測定に先立ち、50kDのフィルタを用いて、すべての試料（対照としての１つの試料は除く）をスピンろ過した。各バイアルから交互に一定量を取り、室温においてPDMS／ガラス製チップ（v.1.1）に順にロードしながら、リアルタイムでデータを収集した。ろ過によって、S/N比および導電率の変化が改善された。図２８および図２９は、0％全血を用いた際の増幅前（陰性対照）および増幅後（陽性対照）のセンサ電圧の経時変化を、ろ過していない試料とろ過した試料についてそれぞれ示したグラフである。
実施例４－１k～１Mの濃度の標的コピーの導電率の検出
標的としてのインフルエンザ菌ゲノムの５’末端の非翻訳領域を使用して、反応ミックスを調製した。fC4D装置を用いて検出を行った。データは、３回の反復実験の平均値を取った。図３０は、標的のロード量に対する閾値時間を標準偏差のエラーバーとともに示したグラフである。鋳型を含まない陰性対照は、60分間の加熱で信号を示さなかった。
実施例５－PDMS製チップにおける全血を用いたfC 4 Dによる増幅前後の検出
0％または1％（v/v）の全血と、標的としてのインフルエンザ菌ゲノムの５’末端の非翻訳領域を使用して、反応ミックスを調製した。この反応ミックスを小分けし、増幅前バイアル（陰性対照）と増幅後バイアル（陽性対照）に入れた。増幅前バイアルは、増幅を阻止するために85℃で20分間加熱し、不活化した。増幅後バイアルは、63℃で60分間増幅した。各バイアルから交互に一定量を取り、室温においてPDMS／ガラス製チップ（v.1.1）に順にロードしながら、リアルタイムでデータを収集した。図３１は、増幅前（陰性対照）のバイアルおよび増幅後（陽性対照）のバイアルから得た様々な試料の導電率を示すグラフである。
実施例６－磁気増幅免疫測定法（MAIA）を用いたＢ型肝炎表面抗原の検出
ビオチン標識ポリクローナル抗体捕捉プローブ（抗HBs抗原）を、ストレプトアビジンにより機能化した１ミクロンの磁気マイクロスフェア（Dynal T1）に結合させた。ビオチン標識したポリクローナル抗体捕捉プローブ（抗HBs抗原）をストレプトアビジンに結合させ、さらにこのストレプトアビジン－抗体複合体を、ビオチン標識したDNA標的に結合させることによって、キメラ検出複合体を合成した。抗体により機能化されたビーズを使用して、溶液中のHBs抗原を捕捉した。HBs抗原にキメラ抗体－DNA複合体が結合した後、このキメラ複合体のDNA鋳型部分が増幅されることによって、HBs抗原が検出された。図３２は、核酸で標識した抗体と抗原の間の結合を示す。図３３は、Ｂ型肝炎表面抗原の検出を示したグラフである。
実施例７－低イオン強度緩衝液を用いた検出
市販品を使用した増幅溶液およびT10増幅溶液を、それぞれ表３および表４に示した試薬を用いて調製した。市販品の増幅溶液は、一般的な増幅反応において通常使用されているものである。T10増幅溶液は、トリスHClの含有量が少なく、硫酸アンモニウムは含まれていなかった。各溶液は400μL調製し、各溶液を約15μLずつ、実験用カートリッジの別々のチャネルにロードした。各溶液は63.0℃に加熱した。データの収集にはデータ収集基板を使用した。
結果を図３４に示す。T10増幅緩衝液を使用した場合、市販品の増幅溶液を使用して得られた信号よりも少なくとも30％大きい信号が得られた。
Figure 2022516442000027
Figure 2022516442000028
実施例８－流体工学カートリッジのインピーダンス特性
図１７Ａに示した流体工学カートリッジの各チャネルに1288mS/cmの基準緩衝液を充填し、励起周波数を約100Hz未満～約1MHz超までスイープし、周波数に対するインピーダンス|Z|またはargZを測定した。周波数に対する|Z|またはargZとして結果を図３５に示す。
実施例９－HCV配列を含む核酸の増幅
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の配列を含む核酸を含む試料を、LAMP法による一連の実験において様々な条件で増幅した。臨界時間（Ct）値を求め、標準偏差（SD）および相対標準偏差（RSD）（％）を算出した。増幅した核酸には、HCV配列を含む合成核酸すなわちHCV配列を含む合成RNAが含まれていた。いずれの反応系にもTween20が5％含まれていた。HCV配列を含む約100万コピーの合成核酸を含む反応系を使用した実験において、平均Ctは856、SDは15、RSDは1.72％であった。
未処理、合成RNAの添加前に加熱処理、合成RNAの添加後に加熱処理、および100mMのDTTの添加を含む様々な条件下で、HCV配列を含む合成RNAを含む血漿試料をLAMP法により増幅した。各反応に含まれる核酸の量は、約25kコピーであった。結果を表５にまとめる。データは秒で示す。
Figure 2022516442000029
RSDで示されたように、100mMのDTTを添加する条件と、合成RNAの添加前に血漿の加熱処理を行う条件において、未処理試料よりも増幅が向上した。また、DTTを添加する条件と、合成RNAの添加前に血漿の加熱処理を行う条件において、未処理試料よりも増幅速度が速くなった（約50秒速くなった）（それぞれP=0.03およびP=0.002）。
血漿の加熱処理、100mMのDTTの添加、ならびにSDSおよび／またはDTTの添加を含む様々な条件下で、HCVを含有する血漿試料（SeraCare社、マサチューセッツ州ミルフォード）を、LAMP法により増幅した。表６に結果をまとめる。データは秒で示す。
Figure 2022516442000030
RSDで示されたように、血漿の加熱処理を行う条件およびDTTを添加する条件において、未処理の血漿よりも増幅結果が向上した。また、0.05％または0.1％のSDSを添加すると、未処理の条件、加熱処理を行う条件およびDTTを添加する条件の血漿よりも増幅の再現性および増幅速度が低下した。
実施例１０－HCVを含む臨床試料の増幅
HCVを含む臨床血漿試料を、様々な濃度のDTTを用いて、LAMP法により増幅した。WarmStart LAMPマスターミックス（ニュー・イングランド・バイオラボ）を使用して、各試料を四連で調製した。各試料は、１反応あたり約20kコピーのHCVを含む5％の血漿（SeraCare社、マサチューセッツ州ミルフォード）、１反応あたり50Uのマウス由来RNase阻害剤、ならびに様々な濃度のTweenおよびDTTを含むものであった。HCV配列（１Mコピー／反応）を含む合成核酸を含む試料は、1％または5％のTweenを用いて試験した。標的を含まない対照（NTC）についても試験を行った。LAMP法は67℃で行い、結果は、Zeus QS3システムにおいて１分／サイクルで60サイクルにわたり測定した。各サイクルでデータを取得し、LAMP法の完了後に、融解曲線解析により融解曲線の上昇と下降を確認した。結果を表７にまとめて示す。データは秒で示す。
Figure 2022516442000031
RSD値で示されたように、5％のTweenを含む試料は、1％のTweenを含む試料よりも増幅が向上した。さらに、反応チューブ内のTweenの濃度を様々に変えて同様の検討を行った。結果を表８にまとめて示す。データは秒で示す。
Figure 2022516442000032
Tweenの濃度とDTTの濃度が高い反応量では、HCV試料の増幅結果の再現性が良く、特に、反復試験での反応では、極端な外れ値や増幅の失敗が少なく、増幅を反復した際のRSD値も小さかった。5mMのDTTまたは10mMのDTTを使用した条件では、Tweenの濃度にかかわらず、増幅の見られない反復はなかった。同様に、4％または5％のTweenでは、DTTの濃度が低い（1mM以下）場合を除いて、増幅の失敗や極端な外れ値はなかった。
実施例１１－カートリッジを用いた標的の増幅
各ウェルに環状電極を備えた６つのウェルを有し、図２に示したカートリッジと実質的に同様のカートリッジを用いて、一連の３種の実験を実施した。各ウェルは１本の測定チャネルを備えていた。試料は、インフルエンザ菌（Hinf）またはＢ型肝炎ウイルス（HBV）に由来する配列を含む標的核酸が含まれていた。LAMP法により試料を増幅し、インピーダンスの変化を測定した。
ウェルの準備として、72℃で20分間にわたり予備加熱後、「鋳型を含まないプライマー対照（NTPC）」を含む緩衝液25μlを各ウェルに充填し、この緩衝液を鉱油で覆い、72℃で20分間にわたりカートリッジを加熱し、ウェルから気泡を除去し、室温で10分間静置してカートリッジを冷却した。緩衝液をあらかじめ充填したウェルの底部に試料を注入し、カートリッジを67℃または76.5℃で静置して、LAMP法を行って特定の実験を行った。Hinfの試験に使用した周波数は60kHzであった。各カートリッジに注入した試料と、対応するウェル／チャネルを表９に示す。標的配列およびプライマーは表１０に示す。反応成分を表１１に示す。
Figure 2022516442000033
Figure 2022516442000034
Figure 2022516442000035
65℃のカートリッジで行ったLAMP法のデータを図３６Ａおよび図３６Ｂに示す。図３６Ａは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の異位相部分を示すグラフである。このグラフにおいて、ｘ軸は時間を表し、NTPC試料、ならびに一例としてのHinf試料および合成HBV試料に対して行ったLAMP法を示す曲線に凡例を付している。図３６Ｂは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の同位相部分を示すグラフである。このグラフの各線は、合成HBV（チャネル１～３）、NTPC（チャネル４）およびHinf（チャネル５～６）を示している。合成HBVを含む試料は、65℃のカートリッジでは増幅されなかった。Hinfと表示した試料では、陽性試料であることを示す信号のクリフの一例が見られる。
67℃のカートリッジで行ったLAMP法のデータを図３６Ｃおよび図３６Ｄに示す。図３６Ｃは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の異位相部分を示すグラフである。このグラフにおいて、ｘ軸は時間を表し、NTPC試料、ならびに一例としてのHinf試料および合成HBV試料に対して行ったLAMP法を示す曲線に凡例を付している。図３６Ｄは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の同位相部分を示すグラフである。このグラフの各線は、合成HBV（チャネル１～３）、NTPC（チャネル４）およびHinf（チャネル５～６）を示している。合成HBVを含む試料は、67℃のカートリッジにおいて約49分の時点で増幅された。Hinfと表示した試料では、陽性試料であることを示す信号のクリフの一例が見られる。
67℃のカートリッジで行ったLAMP法のデータを図３６Ｅおよび図３６Ｆに示す。図３６Ｅは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の異位相部分を示すグラフである。このグラフにおいて、ｘ軸は時間を表し、NTPC試料、ならびに一例としてのHinf試料および合成HBV試料に対して行ったLAMP法を示す曲線に凡例を付している。図３６Ｆは、図２に示したカートリッジの試験ウェルにおいて検知された、減衰した励起信号の同位相部分を示すグラフである。このグラフの各線は、合成HBV（チャネル１～３）、NTPC（チャネル４）およびHinf（チャネル５～６）を示している。合成HBVを含む試料は、67℃のカートリッジにおいて約46分の時点で増幅された。
さらに、Applied Biosystems社のQuantStudioTM 3 リアルタイムPCRシステムを用いて、67℃で各試料の定量PCR試験を行った。サーモフィッシャー社のQS3ソフトウェアを用いて、閾値を100kに設定し、同一の反応からなる各セットには同一のベースライン値を設定して、臨界時間（Ct）を計算した。表１２に、Hinfを含む試料または合成HBVを含む試料の平均Ct値を示す。
Figure 2022516442000036
実施例１２－液滴デジタル核酸増幅
本明細書で提供される電気的検知技術は、核酸標的を正確に定量するためのデジタル核酸増幅プラットフォームに応用してもよい。この核酸増幅は、等温増幅（例えば、LAMP、SDA、RPA、RCA、NSABA）であってもよく、PCRに基づく増幅（例えば、デジタルPCR）であってもよい。デジタル増幅は、従来の増幅法と比較して、遺伝子変異と単一の鋳型分子をより正確かつ高い信頼性で特異的に検出でき、絶対定量が可能である。いくつかの実施形態は、電気検知技術と、PCR増幅技術または等温増幅技術とを含む。いくつかの実施形態は、様々な応用に対する解決策を提供するものであり、例えば、アレルの絶対定量、稀な変異の検出、コピー数変化の分析、DNAのメチル化、様々な種類の臨床試料における遺伝子再構成、混合腫瘍またはその他の遺伝性疾患における稀なアレルの検出、固形腫瘍量を調べるための末梢体液を用いたリキッドバイオプシー、非侵襲的出生前診断、ウイルス量の検出、遺伝子発現、不均一試料におけるコピー数変化、単一細胞における遺伝子発現やホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料などの限られた量の試料を用いたアッセイ、シーケンシング前のDNAの品質管理試験、またはシーケンシングにより同定された低頻度の変異の検証を目的とした応用に対する解決策を提供するが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態は、液滴形成ユニット、温度制御ユニット（加熱チャンバーやサーマルパッドなど）および検出ユニットを含む。いくつかの実施形態において、液滴形成ユニットを使用して、ナノリットルサイズの液滴を形成する。いくつかの実施形態において、形成された各液滴は、単一コピーの核酸標的、酵素、マグネシウム、各dNTPおよび増幅反応緩衝液などの、増幅に必要なすべての成分を含む増幅マイクロリアクターとして機能する。いくつかの実施形態において、温度制御ユニットは、この液滴マイクロリアクターにおいて酵素核酸増幅反応法を行うための温度を制御する。いくつかの実施形態において、液滴が形成された後、反応チャンバーの温度を、所望の温度または増幅反応の開始温度まで上昇させる。この温度上昇は、PCR法などにおける複数の温度段階であってもよく、等温増幅を行うための単一の温度であってもよい。反応が完了したら、温度を変化させることができ、あるいは環境温度まで下げることができる。いくつかの実施形態において、増幅後または増幅中に、単一または複数の増幅産物を含む各液滴を、流体輸送チャネルまたはマイクロ流体輸送チャネルを通して検出ユニットに輸送し、この検出ユニットにおいて分析を行う。
均一なナノリットルサイズの液滴を形成させるために、数多くの様々なメカニズムを利用することができる。そのうちの技術の１つとして、油中水型エマルションの形成によるものがある。いくつかの実施形態において、乳化液滴を形成させるため、Span 80、Tween 80および／またはTriton X-100を鉱油中に含む油相を、増幅反応水溶液と機械的に混合し、ナノリットルサイズの液滴を形成させる。酵素反応ミックスと単一の核酸標的を含む各液滴が、不混和性担体油中に含まれる。液滴の形成は、前述の３つのユニットすべてを備えた一体型カートリッジにおいて行うことができ、別の容器において行うこともできる。振盪および／または攪拌を利用して、液滴を形成させることができる。別の容器を用いる場合、磁気攪拌子または機械的攪拌棒を容器内に配置することができ、攪拌プレートまたは自動攪拌装置を使用することができる。この容器は、バイアル、チューブ、または所望の容量および効率的な振盪または攪拌を行える特注の容器であってもよい。完全一体型カートリッジの設計では、試料と油を収容する区画を用いて液滴を形成させてもよい。いくつかの実施形態において、振盪または攪拌はこの区画で行われる。また、シリンジおよび／またはポンプを液滴の形成に使用することもできる。図３７および図３８は、液滴を形成し、検出を完了させるための方法を示す。
図３７は、液滴リアクターの形成、標的の増幅、電気検出およびデータの収集の一例を示す概略図である。試料溶液相と油相を混合して、反応加熱チャンバーにおいて液滴を形成するための２本のシリンジポンプを示す。一方は試料溶液用であり、もう一方は油相用である。液滴を形成した後、増幅反応を開始することができる。反応完了後、（水性反応混合物を含む液滴を含む）各液滴リアクターを反応加熱チャンバーから電気検出ユニットへと放出し、検出を行うことができる。
図３８は、液滴リアクターの形成、標的の増幅、電気検出およびデータの収集の一例を示す概略図である。試料溶液相と油相を混合して、混合チャンバーにおいて液滴を形成するための２本のシリンジポンプを示す。一方は試料溶液用であり、もう一方は油相用である。液滴を形成した後、この液滴を増幅反応用コイル状加熱チャンバーに送ってもよい。次に、このコイル内において増幅を開始してもよい。反応完了後、各液滴リアクターをコイル状加熱チャンバーから電気検出ユニットへと放出し、検出を行うことができる。
核酸プライマーをコーティングした磁気ビーズまたは核酸プライマーをコーティングしたその他のビーズを使用して、液滴の輸送および検出を容易にすることもできる。いくつかの実施形態において、液滴形成プロセスにおいて、このようなビーズを油および酵素反応溶液と混合する。いくつかの実施形態において、添加するビーズの比率は、液滴ミセル１個あたり１つのビーズのみが割り当てられるように最適化される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の装置の検出ユニットには、電気検知素子が埋設された１つまたは複数のマイクロサイズからナノサイズのチャネルを配置する。いくつかの実施形態において、本発明の装置の電気検知素子は読取装置に接続されている。いくつかの実施形態において、この読取装置は本発明の装置に電力を供給する。いくつかの実施形態において、各液滴はこの単一または複数のチャネルを通過し、インピーダンスや静電容量などの電気信号の変化を介して電気検知素子により各液滴が検出される。次に、電気信号が読取装置により受信される。分析データを生成することができる。
実施例１３－デジタルPCRと電気特性による反応生成物の検出
PCR反応ミックス（鋳型核酸、緩衝液およびPCRの実施に必要なその他の試薬を含む）を調製する。次に、48個のマイクロウェル、各マイクロウェル用の混合チャンバー、加熱チャンバーおよび検出ユニットを備えるカートリッジのマイクロウェルに、PCR反応ミックスをピペットで加えるか、注入する。このカートリッジの別のマイクロウェルには、別の鋳型核酸および／またはプライマーを含むPCR反応ミックスを加える。マイクロウェル内のこれらの反応混合物を、約10psi～約75psiの圧力で油相と一緒に、加熱チャンバーとしても機能する混合チャンバーに注入する。高い圧力で注入することによって、油相と反応混合物から反応液滴が形成される。
次に、液滴をサーマルサイクル処理に供し、各混合／加熱チャンバー内の液滴を、各混合／加熱チャンバーのマイクロ流体チューブ内に押し出す。次に、このマイクロ流体チューブを通して液滴を輸送し、電場発生ユニットにより生成された電場を印加し、電気検知素子で検知する。この電気検知素子からの電気信号（インピーダンスおよび／または静電容量の変化など）をデータに変換し、このデータを各液滴について分析して、各液滴中の増幅産物の有無および／またはその量を求める。
実施例１４－デジタルLAMP法と電気特性による反応生成物の検出
LAMP反応ミックス（鋳型核酸、緩衝液およびLAMP法に必要なその他の試薬を含む）を調製する。次に、高圧力下（約200psi）において反応ミックスを油相と混合することにより該反応ミックスからマイクロ液滴を形成することができる装置に、LAMP反応ミックスをピペットで加えるか、または注入する。次に、28個のマイクロウェルおよび各マイクロウェル用の検出ユニットを備えているが、混合チャンバーや加熱チャンバーを備えていないカートリッジのマイクロウェルに、前記マイクロ液滴をピペットで加えるか、または注入する。別のLAMP反応ミックス（別の鋳型核酸、プライマーおよび／またはその他の試薬を含む）を含むマイクロ液滴を、前記カートリッジの別のマイクロウェルにピペットで加えるか、または注入する。
前記カートリッジを、加熱チャンバーを備えた装置に配置する。この加熱チャンバーによりカートリッジを65℃に加熱し、この温度で加熱を60分間継続後、各液滴をそれぞれのマイクロウェルから、検出ユニットが付属した分岐チャネルを通して輸送する。検出ユニットにより液滴に電場が印加される。電気信号（インピーダンスおよび／または静電容量の変化など）をデータに変換し、このデータを各液滴について分析して、各液滴中の増幅産物の有無および／またはその量を求める。
システムの実装と用語
本明細書で開示する実装は、標的分析種の有無および／またはその量を検出するためのシステム、方法および装置を提供する。当業者であれば、これらの実施形態をハードウェアに実装してもよく、またはハードウェアとソフトウェアおよび／もしくはファームウェアとの組み合わせに実装してもよいことを理解できるであろう。
本明細書に記載の信号処理および読取装置の制御機能は、プロセッサ可読媒体またはコンピュータ可読媒体に１つ以上の命令として格納されていてもよい。「コンピュータ可読媒体」は、コンピュータまたはプロセッサによりアクセス可能な、利用可能な何らかの媒体を指す。このような媒体は、例えば、RAM、ROM、EEPROM、フラッシュメモリ、CD-ROM、その他の光学ディスク記憶装置、磁気ディスク記憶装置もしくはその他の磁気記憶装置、または命令もしくはデータ構造の形態の所望のプログラムコードを格納可能であり、かつコンピュータによりアクセス可能なその他の媒体を含んでいてもよいが、これらに限定されない。コンピュータ可読媒体は、実体を有する非一時的媒体であってもよいことに留意されたい。「コンピュータプログラム製品」は、演算装置またはプロセッサによって実行されてもよく、処理されてもよく、または演算されてもよいコードまたは命令（例えば「プログラム」）を組み合わせた演算装置またはプロセッサを指す。本明細書において、「コード」は、演算装置またはプロセッサによって実行することができるソフトウェア、命令、コードまたはデータを指してもよい。
本明細書で開示した実施形態に関して説明した一例としての様々な論理ブロックおよびモジュールは、機械装置で実装または実行することができ、このような機械装置として、汎用プロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（DSP）、特定用途向け集積回路（ASIC）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）、その他のプログラマブルロジックデバイス、ディスクリートゲートまたはトランジスタロジック、ディスクリートハードウェア部品、および本明細書に記載の機能を実行するよう設計された、これらの装置の任意の組み合わせが挙げられる。汎用プロセッサは、マイクロプロセッサであってもよいが、その代わりにコントローラ、マイクロコントローラ、これらの組み合わせなどを使用することもできる。プロセッサは、演算装置の組み合わせ、例えば、DSPとマイクロプロセッサの組み合わせ、複数のマイクロプロセッサ、１つ以上のマイクロプロセッサとDSPコアの併用、またはこのようなその他の構成で実装することができる。本明細書では、主にデジタル技術に関して説明を行ったが、プロセッサは、アナログ部品を主に含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の信号処理アルゴリズムのいずれかを、アナログ回路に実装してもよい。コンピュータ環境は、何らかの種類のコンピュータシステムを含んでいてもよく、いくつか例を挙げれば、マイクロプロセッサに基づくコンピュータシステム、メインフレームコンピュータ、デジタルシグナルプロセッサ、携帯型コンピュータデバイス、電子システム手帳、デバイスコントローラおよび電化製品の演算エンジンがあるが、これらに限定されない。
本明細書で開示した方法は、本明細書に記載の方法を達成するための１つ以上の工程または操作を含む。本明細書で開示した方法のこれらの工程および／または操作は、請求項の範囲から逸脱することなく互いに入れ替えることができる。言い換えると、本明細書に記載の方法を適切に実施するために特定の順序で工程または操作を行う必要がない限り、これらの特定の工程および／もしくは操作を行う順序、ならびに／またはこれらの特定の工程および／もしくは操作の使用は、請求項の範囲から逸脱することなく変更してもよい。
本明細書で使用されている「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「特徴とする（characterized by）」という用語と同義であるとともに、オープンエンドで包括的な意味であり、本明細書には記載されていないさらなる要素や工程を除外するものではない。
前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更およびその他の態様を包含する。
本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。引用によって援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。

Claims (48)

  1. 鋳型核酸の増幅産物の検出用システムであって、
    液滴形成ユニットと温度制御ユニットと検出ユニットとを含み、
    前記液滴形成ユニットが、
    鋳型核酸または該鋳型核酸を含む細胞と、緩衝液と、核酸増幅試薬とを含む水性反応混合物を含む試料リザーバーと、
    油を含み、非イオン界面活性剤などの界面活性剤を含んでいてもよい油相リザーバーと、
    前記試料リザーバーおよび前記油相リザーバーと流体連通しており、かつ前記油と前記水性反応混合物を混合することにより、該水性反応混合物と該油を含む液滴を形成するように構成されている混合チャンバーと
    を含み、
    前記温度制御ユニットが、加熱ユニットを含み、かつ所望の温度で所望の時間にわたり前記液滴を加熱するように構成されており、
    前記検出ユニットが、
    前記液滴を輸送するように構成されており、かつ前記混合チャンバーと流体連通している流路または導管と、
    前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
    対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴におけるインピーダンスまたは静電容量などの電気信号の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
    を含み、
    前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される、
    システム。
  2. 前記混合チャンバーに前記温度制御ユニットが含まれており、該混合チャンバーにより前記油と前記水性反応混合物が混合されると同時に、または該混合チャンバーにより前記油と前記水性反応混合物が混合された後に、前記温度制御ユニットが、前記液滴を所望の温度に加熱するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記混合チャンバーが、前記加熱ユニットと分離されている、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記混合チャンバーが、振盪または攪拌により前記液滴を形成または維持する、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 前記液滴形成ユニットが、前記試料リザーバーから前記水性反応混合物を押し出すように構成されているポンプ、または前記油相リザーバーから前記油を押し出すように構成されているポンプを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 前記ポンプが、シリンジポンプまたは空気ポンプを含む、請求項５に記載のシステム。
  7. 前記ポンプが、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力を印加するように構成されている、請求項５または６に記載のシステム。
  8. 前記温度制御ユニットが、加熱された反応チャンバー、加熱されたパッド、加熱された支持体などの加熱チャンバーを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
  9. 前記加熱された反応チャンバーが、前記検出ユニットの前記流路または導管を含むか、または前記検出ユニットの前記流路の一部を含む、請求項８に記載のシステム。
  10. 前記加熱された反応チャンバーまたは前記混合チャンバーが、前記液滴を選択的に押し出すように構成されている、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  11. 各液滴の直径が、100～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
  12. 前記流路または導管が、ナノチューブ、ナノチャネル、マイクロチューブまたはマイクロチャネルを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のシステム。
  13. 前記流路または導管の直径が、100～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである、請求項１～１２のいずれか１項に記載のシステム。
  14. 前記電場発生ユニットおよび／または前記電気検知素子が、前記流路または導管に付属または接触している単一または複数の電極パッドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のシステム。
  15. 前記単一または複数の電極パッドが、前記流路または導管に蒸着もしくは印刷されているか、または前記流路または導管に接触している、請求項１４に記載のシステム。
  16. 前記流路または導管が、壁面を含むか、または壁面に囲まれており、これらの壁面からなる断面が、正方形、長方形、円形または別の形状を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のシステム。
  17. 前記検出ユニットが、少なくとも１つの液滴を輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の追加の流路または導管をさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のシステム。
  18. 前記追加の流路および／または導管のそれぞれに付属または接触している追加の電場発生ユニットまたは電気検知素子をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
  19. 前記流路または導管が、該流路または導管から分枝または分岐した流路または導管を備える分枝形状または分岐形状を含み、前記分枝または分岐した流路または導管が、少なくとも１つの液滴を輸送するように構成されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載のシステム。
  20. 少なくとも１つの液滴を輸送するように構成された、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、20本、30本、40本、50本、60本、70本、80本、90本、100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、またはこれらの数値の間の本数の、前記流路または導管から分枝または分岐した追加の流路または導管をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
  21. 前記分枝または分岐した流路または導管のそれぞれに付属または接触している追加の電場発生ユニットおよび／または電気検知素子をさらに含む、請求項１９または２０に記載のシステム。
  22. 前記液滴形成ユニット、前記温度制御ユニットおよび前記検出ユニットの全体またはその一部を収容したカートリッジを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のシステム。
  23. 前記核酸増幅試薬が、PCR試薬、等温増幅試薬、LAMP試薬、RPA試薬またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のシステム。
  24. 前記核酸増幅試薬が、等温核酸増幅法に適合した試薬を含み、該等温核酸増幅法が、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などである、請求項１～２３のいずれか１項に記載のシステム。
  25. 核酸増幅産物の検出用装置であって、
    ナノリットルウェルと、流路または導管と、検出ユニットとを含むカートリッジを含み、
    前記ナノリットルウェルのそれぞれが、鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物と油とを含む液滴を収容するように構成されており、
    前記流路または導管のそれぞれが、前記ナノリットルウェルの少なくとも１つと流体連通しており、かつ少なくとも１つの液滴を輸送するように構成されており、
    前記検出ユニットが、
    各流路または各導管に付属しており、
    前記液滴が前記流路内または前記導管内に存在する場合に、該液滴に電場を印加するように構成されている電場発生ユニットと、
    対照との比較により、前記電場が印加されたときの各液滴におけるインピーダンスまたは静電容量などの電気信号の変調を測定するように構成されている電気検知素子と
    を含み、
    前記電気信号の変調により、前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される、
    装置。
  26. 前記カートリッジが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、１～10個、１～100個、10～25個、25～50個、48個、約48個、25～75個、50～100個、100～250個、250～500個またはそれ以上の個数のナノリットルウェルを含む、請求項２５に記載の装置。
  27. 前記カートリッジが、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、10本、１～10本、１～100本、10～25本、25～50本、48本、約48本、25～75本、50～100本、100～250本、250～500本またはそれ以上の本数の流路または導管を含む、請求項２５または２６に記載の装置。
  28. 各液滴が、前記油と前記水性反応混合物を混合することにより形成される、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の装置。
  29. 前記液滴が、前記ナノリットルウェル内および／または前記流路内もしくは前記導管内に存在する場合に、前記液滴を所望の温度に加熱または維持するように構成された温度制御ユニットまたは加熱ユニットをさらに含む、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の装置。
  30. 前記核酸増幅試薬が、PCRまたは等温核酸増幅法に適合した試薬を含み、該等温核酸増幅法が、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などである、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の装置。
  31. 鋳型核酸の増幅産物を検出する方法であって、
    鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を含む油性液滴を加熱チャンバーに導入する工程；
    前記油性液滴中の前記水性反応混合物に対して核酸増幅反応を行うことにより、前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程；ならびに
    対照との比較により、電界を印加したときの前記油性液滴におけるインピーダンスまたは静電容量などの電気信号の変調を測定することによって、該油性液滴中の前記鋳型核酸の増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記鋳型核酸の増幅産物の存在が示される工程
    を含む方法。
  32. 前記核酸増幅反応が、PCR、等温増幅法、LAMP法、RPA法またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記核酸増幅反応が、self-sustaining sequence replication reaction（3SR）法、90-I、BAD増幅、cross priming amplification（CPA）法、等温指数関数的増幅反応（EXPAR）、等温キメラプライマー核酸増幅（ICAN）法、等温多置換増幅（IMDA）法、ライゲーション媒介SDA法、多置換増幅法、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）、restriction cascade exponential amplification（RCEA）法、スマート増幅法（SMAP2）、単一プライマー等温増幅（SPIA）法、転写増幅システム（TAS）、転写媒介増幅（TMA）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）、交差多置換増幅（MCDA）法、LAMP法、RPA法、ローリングサークル複製（RCA）法、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、核酸配列ベース増幅（NASBA）法などの等温核酸増幅法を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記水性反応混合物が、前記鋳型核酸を含むビーズまたは粒子を含み、該ビーズまたは粒子が、解放可能に該鋳型核酸に結合されているか、または解放不能に該鋳型核酸に結合されている、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ビーズまたは粒子が、金属、ポリマー、プラスチックもしくはガラスを含むか、または磁気を帯びている、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記液滴がエマルションを含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 圧力下で、例えば、10～50psi、50～100psi、100～200psi、200～300psi、300～400psi、400psi、約400psi、10～400psi、400～500psiまたは500～1000psiの圧力下で、油に前記水性反応混合物を導入することにより前記エマルションを形成する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記核酸増幅反応が、前記エマルションを形成するように構成されている反応チャンバー、または前記液滴を選択的に押し出すように構成されている反応チャンバーにおいて行われる、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 前記液滴が、非イオン界面活性剤と油を含む油相を含む、請求項３１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記液滴が、オレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80、Triton X-100または鉱油を含む油相を含む、請求項３１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記液滴の直径が、100～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである、請求項３１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程をさらに含み、該流路内または該導管内に該液滴が存在する場合に、該液滴に電界が印加される、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記流路または導管の直径が、100～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～50μm、50～100μmまたは100～500μmである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記流路または導管が、ナノチューブ、ナノチャネル、マイクロチューブまたはマイクロチャネルを含む、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. カートリッジ内において実施されるか、または請求項１～３０のいずれか１項に記載のシステムもしくは装置において実施される、請求項３１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 鋳型核酸の増幅産物を検出する方法であって、
    鋳型核酸、緩衝液および核酸増幅試薬を含む水性反応混合物を提供する工程；
    エマルションに封入された前記水性反応混合物の液滴を形成する工程；
    核酸増幅反応を行うことによって、各液滴内に前記鋳型核酸の増幅産物を得る工程；
    流路または導管を通して前記液滴を輸送する工程；ならびに
    対照との比較により、電界を印加したときの各液滴におけるインピーダンスまたは静電容量などの電気信号の変調を測定することによって、各液滴中の前記増幅産物の有無を検出し、前記電気信号が変調した場合に前記増幅産物の存在が示される工程
    を含む方法。
  47. 請求項２５～３０のいずれか１項に記載の装置を含むキット。
  48. 核酸増幅試薬、油または界面活性剤をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
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