CN114807403A - 一种用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂和数字pcr试剂盒 - Google Patents
一种用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂和数字pcr试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及一种用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂和数字PCR试剂盒，该核酸试剂包括SEQ ID NO.1‑6所示的引物和SEQ ID NO.9‑11所示的探针。本公开建立了同时检测斯氏普罗威登斯菌、产碱普罗威登斯菌和雷氏普罗威登斯菌的检测体系；检测体系中含有外源内控作为对照，能够对检测过程进行质控；检测结果具有良好的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂和数字PCR试剂盒。
背景技术
普罗威登斯菌，与肠杆菌科的一般定义符合，兼性厌氧，属革兰氏阴性直杆菌，以周生鞭毛运动，不出现集群。氧化脱氨苯丙氨酸和色氨酸。分离于腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本。普罗威登斯菌是条件致病菌，能引起腹泻，肠道外感染和尿道感染等疾病。常见的普罗威登斯菌有产碱普罗威登斯菌、雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌等。但是目前尚未研制出能够同时检测多种普罗威登斯菌的检测试剂盒。
发明内容
本公开的目的是提供一种特异性好和灵敏度高、快速、准确地检测普罗威登斯菌的核酸试剂及数字PCR试剂盒。
为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂，该核酸试剂包括SEQ ID NO.1-6所示的引物和SEQ ID NO.9-11所示的探针。
可选地，所述SEQ ID NO.9所示的探针中，5’端核苷酸标记有FAM发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
所述SEQ ID NO.10所示的探针中，5’端核苷酸标记有VIC发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
所述SEQ ID NO.11所示的探针中，5’端核苷酸标记有CY5发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团。
可选地，所述核酸试剂中还包括SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.12所示的探针；
可选地，所述SEQ ID NO.12所示的探针中，自5’端核苷酸标记有A425发光基团，3’端核苷酸标记有BHQ1淬灭基团。
可选地，所述普罗威登斯菌包括雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌和产碱普罗威登斯菌中的至少一种。
本公开还提供了一种用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括核酸试剂和数字PCR扩增试剂，所述核酸试剂为本公开第一方面提供的核酸试剂。
可选地，所述数字PCR试剂包括：阳性对照DNA模板、DNA聚合酶、dNTP和反应体系缓冲液中的至少一种。
可选地，所述阳性对照DNA模板为编码LexA基因的DNA或编码LexA基因的DNA的片段。
可选地，所述编码LexA基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.13、14、15中任意一项所示。
本公开还提供第一方面所述核酸试剂在制备用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒中的用途。
通过上述技术方案，本公开首次使用数字PCR技术检测三种普罗威登斯菌，达到如下检测效果：
（一）较高的多重检测能力
本公开所建立的检测方法，能够同时检测产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌和雷氏普罗威登斯菌，节省时间、人力和试剂成本。
（二）灵敏度高
本公开所建立的检测方法能够实现产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌和雷氏普罗威登斯菌的同时检测，反应体系中每种检测目标的检测灵敏度均可达到0.5 拷贝/μL，灵敏度高。
（三）特异性高
本公开所建立的检测方法中，所有引物及探针都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅能够将检测目标相互区分，而且还能与其它种属相近、生存环境相同、核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或其他常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌区别开，如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。因此，本公开提供的检测方法无论是体系内还是体系外都具有良好的特异性，而且检测值稳定。
（四）预防假阴性结果
本公开所建立的检测方法中，利用外源内控，可以有效提示假阴性检测结果。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种用于检测普罗威登斯菌核酸试剂盒，该核酸试剂包括SEQ ID NO.1-6所示的引物和SEQ ID NO.9-11所示的探针。
可选地，所述SEQ ID NO.9所示的探针中，5’端核苷酸标记有FAM发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
可选地，所述SEQ ID NO.10所示的探针中，5’端核苷酸标记有VIC发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
可选地，所述SEQ ID NO.11所示的探针中，5’端核苷酸标记有CY5发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团。
可选地，所述核酸试剂中还包括SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.12所示的探针；
其中，所述SEQ ID NO.12所示的探针中，5’端核苷酸标记有A425发光基团，3’端核苷酸标记有BHQ1淬灭基团。
可选地，所述普罗威登斯菌包括雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌和产碱普罗威登斯菌中的至少一种。
本公开还提供了一种用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒，该试剂盒中包括核酸试剂和数字PCR扩增试剂，所述核酸试剂为本公开第一方面所述的检测试剂。
可选地，所述数字PCR扩增试剂包括：阳性对照DNA模板、DNA聚合酶、dNTP和反应体系缓冲溶液中的至少一种。
可选地，所述阳性对照DNA模板为编码LexA基因的DNA或编码LexA基因的DNA的片段。
可选地，所述编码LexA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13、14、15中任意一项所示。
本公开还提供了上述核酸试剂在制备用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒中的用途。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
实施例1 检测方法及检测结果判定
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中FAM、VIC、CY5和A425为荧光基团；MGB和BHQ1为淬灭基团。
表1
表2
| 序号 | 探针代码 | 序列 | 修饰 | 检测目标 |
| 9 | LSP | CACATGCAGATTTC | FAM-MGB | 雷氏普罗威登斯菌 |
| 10 | SSP | CAAACCACATGCTGAC | VIC-MGB | 斯氏普罗威登斯菌 |
| 11 | CJP | AACCTCATGCGGATTT | CY5-MGB | 产碱普罗威登斯菌 |
| 12 | IC-P | CGCGACGGATCTACGTCACAGCG | A425-BHQ1 | 外源内控 |
SEQ ID NO.13-15的核苷酸序列如下所示：
>P.rettgeri（雷氏普罗威登斯菌）
ATGAAAGCACTGACGGCTCGACAACAGCAGGTTTACGATCTAGTGCGTGACCACATTTCGCAGACGGGTATGCCTCCTACACGCGCTGAGATAGCAGCAAGCCTTGGTTTTCGTTCGCCTAATGCGGCAGAAGAGCATTTAAAGGCCTTAGCGCGTAAAGGGGTTATTGAAATCGTCTCAGGTGCATCTCGAGGTATTCGTCTGCTTCTTGAAGAAGAAACCGAAGATCAGGGGTTACCTCTGATTGGACGTGTAGCCGCTGGCGAACCATTATTAGCACAGGAACATATTGAGAGCCACTATCAAGTTGACCCTGAGCTGTTTAAACCACATGCAGATTTCTTATTGCGTGTGAATGGGATGTCCATGAAAGATATTGGTATTATGGATGGCGATTTATTAGCTGTGCATAAAACACAAAATGTACATAACGGGCAAGTAGTGGTTGCACGTATCGAAGATGAAGTCACTGTTAAACGTTTTAAGCAACAGGGTAACCGTGTTGAGTTAATAGCAGAAAACCCAGAATTCGAACCTATTGTTGTTGACTTGCGTCAGCAAAATTTCACTATTGAAGGTTTAGCGGTTGGGGTTATTCGTAACAGTGATTGGTATTAA SEQ ID NO.13
>P.stuartii（斯氏普罗威登斯菌）
ATGAAAGCACTGACCGCTAGACAACAGCAAGTTTATGATCTGGTGCGCGATCACATTTCTCAGACGGGTATGCCACCTACACGTGCTGAAATAGCAGCAAGCCTTGGTTTTCGTTCGCCTAATGCGGCAGAAGAGCATCTTAAGGCCTTAGCTCGTAAAGGGGTGATAGAGATTGTTTCAGGGGCTTCTCGTGGTATCCGTTTACTGCTTGAAGAAGAAAATGATCCTGAAATTCAGGGGCTACCTTTAATTGGGCGTGTCGCTGCCGGCGAACCTTTATTAGCGCAAGAGCATATTGAAAGTCATTATCAGGTTGATCCTGAGCTATTCAAACCACATGCTGACTTTTTATTGCGTGTTAATGGGATGTCGATGAAAGATATCGGGATTATGGATGGTGACCTGTTAGCTGTTCATAAAACACAAGATGTCCGTAATGGGCAAGTGGTTGTGGCGCGTATTGAAGATGAGGTTACGGTAAAACGCTTTAAGCAACAAGGTAACCGCGTTGAGTTAATCGCCGAAAACCCAGAGTTTGCACCTATTATTGTCGATTTACGTCAACAAAATTTCACTATTGAAGGATTAGCGGTAGGTGTGATTCGCAATGGTGATTGGTGTTAA SEQ ID NO.14
>P.alcalifaciens（产碱普罗威登斯菌）
ATGAAAGCACTGACAGCTCGACAGCAGCAAGTTTACGATCTGGTGCGTGACCACATTTCGCAGACGGGCATGCCACCAACACGCGCTGAAATAGCAGCAAGTTTGGGATTTCGTTCGCCTAATGCGGCAGAAGAACATTTAAAAGCCTTAGCTCGTAAAGGGGTTATTGAAATTGTTTCTGGAGCTTCCAGAGGCATTCGTCTGTTGTTAGAAGAAGAAACCGAAGATTTAGGGCTTCCTCTGATTGGGCGTGTCGCCGCCGGCGAACCATTGCTTGCACAAGAACATATTGAAAGTCACTACCAAGTTGACCCAGAGTTATTTAAACCTCATGCGGATTTTTTATTGCGTGTGAATGGTATGTCGATGAAGGATATCGGCATCATGGATGGTGATTTACTCGCGGTGCATAAAACTCAGAATGTCCATAATGGACAAATAGTTGTGGCTCGTATCGAGGATGAAGTCACCGTTAAGCGCTTTAAACAACAAGGCAATCGCGTTGAATTGATTGCTGAAAACCCTGAGTTTGCGCCAATCGTTGTTGATTTACGCGAACAGAATTTTACTATTGAAGGGTTAGCTGTTGGGGTTATCCGTAATAGTGACTGGCATTGA SEQ ID NO.15
检测雷氏普罗威登斯菌的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9所示；
检测斯氏普罗威登斯菌的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10所示；
检测产碱普罗威登斯菌的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11所示；
SEQ ID NO.9所示的探针中，5’端核苷酸标记有FAM发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
SEQ ID NO.10所示的探针中，5’端核苷酸标记有VIC发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
SEQ ID NO.11所示的探针中，5’端核苷酸标记有CY5发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团。
2、样本处理
Chelex树脂购自于Biorad公司（货号：142282），配置成5%的悬浊液。
样本来源：雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、产碱普罗威登斯：来自临床培养；其他菌均来自外购灭活菌。
DNA提取过程：采用1mL生理盐水充分混匀菌液，12000rpm离心5min，弃上清；加入200μL的5%Chelex悬浊液，充分震荡5min，瞬时离心，沸水煮5min，12000rpm离心5min，取上清液备用。
3、构建数字PCR检测体系
按照表3配制反应体系：
表3
检测结果判定：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效：
若FAM通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有雷氏普罗威登斯菌；
若VIC通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有斯氏普罗威登斯菌；
若CY5通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有产碱普罗威登斯菌。
实施例2 特异性和灵敏度测定
雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、产碱普罗威登斯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌来自外购灭活菌。
对实施例1中设计的普罗威登斯菌特异性引物对和探针进行评估和验证。反应体系与实施例1相同，进行数字PCR扩增。选择FAM、VIC、CY5和A425作为报告基团，反应程序与实施例1一致。
PCR扩增结果判断：空白对照和阴性对照成立；
结果如表4，检测雷氏普罗威登斯菌DNA，在FAM通道和内控A425通道有检测数值，表示SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列能够检测出雷氏普罗威登斯菌，而且4个重复结果稳定；
检测斯氏普罗威登斯菌DNA，在VIC通道和内控A425通道有检测数值，表示SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列能够检测出斯氏普罗威登斯菌，而且4个重复结果稳定；
检测产碱普罗威登斯菌DNA，在CY5通道和内控A425通道有检测数值，表示SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列能够检测出产碱普罗威登斯菌，而且4个重复结果稳定。
检测铜绿假单胞菌DNA、大肠杆菌DNA、肺炎克雷伯菌DNA、鲍曼不动杆菌DNA、金黄葡萄球菌DNA、屎肠球菌DNA、粪肠球菌DNA和肺炎链球菌DNA，仅在内控A425通道有检测数值，表示本组检测体系与常见的病原微生物无交叉反应。
表4
最低检出限验证
将雷氏普罗威登斯菌DNA、斯氏普罗威登斯菌DNA和产碱普罗威登斯菌DNA分别稀释至1拷贝/μL、0.5拷贝/μL、0.25拷贝/μL。按照上述反应体系的反应程序进行验证，体系配置与实施例1相同。
反应结果显示（表5）：空白对照和阴性对照成立，否则视为实验结果无效；FAM通道有检测值，表示SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列能够检测出0.5 拷贝/μL的雷氏普罗威登斯菌DNA；VIC通道有检测值，表示SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列能够检测出0.5 拷贝/μL的斯氏普罗威登斯菌DNA；CY5通道有检测值，表示SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列能够检测出0.5 拷贝/μL的产碱普罗威登斯菌DNA。结果显示，本体系对三种普罗威登斯菌的最低检出限均为0.5拷贝/μL。
表5
可见，本公开使用数字PCR技术检测三种普罗威登斯菌，检测体系中含有外源内控作为对照，能够对检测过程进行质控；检测结果具有良好的灵敏度和特异性。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种用于检测普罗威登斯菌的核酸试剂和数字PCR试剂盒
<130> 25575-Y-LHJY
<141> 2022-05-05
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccactatcaa gttgaccctg agctg 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 16
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<400> 13
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cagacgggta tgcctcctac acgcgctgag atagcagcaa gccttggttt tcgttcgcct 120
aatgcggcag aagagcattt aaaggcctta gcgcgtaaag gggttattga aatcgtctca 180
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ctgattggac gtgtagccgc tggcgaacca ttattagcac aggaacatat tgagagccac 300
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aatgcggcag aagagcatct taaggcctta gctcgtaaag gggtgataga gattgtttca 180
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aatgggatgt cgatgaaaga tatcgggatt atggatggtg acctgttagc tgttcataaa 420
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attcgcaatg gtgattggtg ttaa 624
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ctgattgggc gtgtcgccgc cggcgaacca ttgcttgcac aagaacatat tgaaagtcac 300
taccaagttg acccagagtt atttaaacct catgcggatt ttttattgcg tgtgaatggt 360
atgtcgatga aggatatcgg catcatggat ggtgatttac tcgcggtgca taaaactcag 420
aatgtccata atggacaaat agttgtggct cgtatcgagg atgaagtcac cgttaagcgc 480
tttaaacaac aaggcaatcg cgttgaattg attgctgaaa accctgagtt tgcgccaatc 540
gttgttgatt tacgcgaaca gaattttact attgaagggt tagctgttgg ggttatccgt 600
aatagtgact ggcattga 618
Claims (9)
1.一种用于检测普罗威登斯菌核酸的核酸试剂，其特征在于，该核酸试剂包括SEQ IDNO.1-6所示的引物和SEQ ID NO.9-11所示的探针。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述SEQ ID NO.9所示的探针中，5’端核苷酸标记有FAM发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
所述SEQ ID NO.10所示的探针中，5’端核苷酸标记有VIC发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团；
所述SEQ ID NO.11所示的探针中，5’端核苷酸标记有CY5发光基团，3’端核苷酸标记有MGB淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂中还包括SEQ ID NO.7-8所示的引物和SEQ ID NO.12所示的探针；
其中，所述SEQ ID NO.12所示的探针中，5’端核苷酸标记有A425发光基团，3’端核苷酸标记有BHQ1淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述普罗威登斯菌包括雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌和产碱普罗威登斯菌中的至少一种。
5.一种用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸试剂和数字PCR扩增试剂，所述核酸试剂为权利要求1~4中任意一项所述的核酸试剂。
6.根据权利要求5所述的数字PCR试剂盒，其中，所述数字PCR扩增试剂包括：阳性对照DNA模板、DNA聚合酶、dNTP和反应体系缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒，其中，所述阳性对照DNA模板为编码LexA基因的DNA或编码LexA基因的DNA的片段。
8.根据权利要求7所述的数字PCR试剂盒，其中，所述编码LexA基因的核苷酸序列如SEQID NO.13、14、15中的任意一项所示。
9.权利要求1~4任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测普罗威登斯菌的数字PCR试剂盒中的用途。
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