CN109680081B - 检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 - Google Patents

检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法。该检测多种病原体的核酸组合物包括扩增引物对及对应的检测探针，上述检测多种病原体的试剂盒能够同时检测至少三种院内感染常见的病原体，并且检测灵敏度高、特异性好。

Description

检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法。
背景技术
感染可分为医院获得性感染和社区获得性感染，医院获得性感染也称医院内感染或医院感染，其定义是发生在医院内的一切感染。具体而言，医院内感染为患者在住院期间发生的感染，住院前获得的感染、住院时正值潜伏期或于住院后发病者不能作为医院内感染；反之，住院期内获得的感染，出院后才发病者，应为医院内感染。住院患者因病理直接伤害其免疫能力后或有减弱的或受损的免疫防御，所以对一般感染并且特别是医院内感染敏感，平均病发率在5～10％。尤其是重症监护病房内的医院内感染的发生率明显高于其他医院病房。
医院内感染的相关病原体主要包括鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、肺炎杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌和热带念珠菌等。院内感染会造成患者住院时间延长、新增病症、死亡率升高、治疗成本升高等。因此，需要快速检测院内感染的方法来确认感染病原体，指导医生有针对性的使用药物和对应策略，降低治疗风险，并解决临床一线需求。
医院内感染的相关病原体的检测方法分为培养法和分子生物学检测法。院内感染鉴定方法现阶段法多采用培养法，而培养细菌或病毒需要长时间，通常是一天或几天，而临床上往往没办法等到结果出来再治疗。所以，一般医生都不等培养结果出来就会经验性地用药，存在很大的医疗事故风险。分子生物学检测方法，包括核酸杂交方法、基因芯片技术以及聚合酶链式反应技术等。然而传统的检测方法往往是针对一种病原体进行特异检测，多种病原体的混合物的检测过程繁琐，往往是针对不同病原体分别检测、耗时长；而将多种病原体的多种引物混合而同时检测多种病原体时，多种病原体的多种引物之间又容易产生干扰，因而特异性差，灵敏度也不高。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测简便、特异性好和灵敏度高的检测多种病原体的核酸组合物。此外，还提供一种检测简便、特异性好和灵敏度高的检测多种病原体的试剂盒及一种简捷的检测多种病原体的试剂盒的使用方法。
一种检测多种病原体的核酸组合物，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的检测探针，所述扩增引物对包括如下引物对中的至少三种：序列如SEQ ID No.1及SEQ IDNo.2所示的鲍式不动杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的金黄色葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的表皮葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ IDNo.9及SEQ ID No.10所示的绿脓假单胞菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示的肺炎克雷伯菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的粪肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示的屎肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.17及SEQ ID No.18所示的大肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.19及SEQID No.20所示的阴沟肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示的奇异变形杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.23及SEQ ID No.24所示的白色念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.26所示的嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对、序列如SEQID No.27及SEQ ID No.28所示的光滑假丝酵母扩增引物对、序列如SEQ ID No.29及SEQ IDNo.30所示的近平滑念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示的热带念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.33及SEQ ID No.34所示的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对和序列如SEQ ID No.35及SEQ ID No.36所示的鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对；与所述扩增引物对对应的检测探针的序列或其互补序列如SEQ ID No.35～SEQ IDNo.54所示，不同检测探针上有不同种类的荧光基团。
上述检测多种病原体的核酸组合物，通过扩增引物对及对应检测探针的精心设计，至少能够同时检测鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、嗜麦芽寡养单胞菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌、热带念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及鲍式不动杆菌耐药菌中的三种菌。使用上述检测多种病原体的核酸组合物的进行实时荧光检测的结果显示，上述检测多种病原体的核酸组合物的特异性高，各个病原体对应的扩增引物和对应的检测探针之间相互影响小，并且检测的灵敏度高，能够达到103copies/mL。
附图说明
图1～图2分别为实施例1的阳性对照及阴性对照的扩增曲线图；图3～图20分别为实施例1的鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、嗜麦芽寡养单胞菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌、热带念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄菌、和鲍式不动杆菌耐药菌的特异性验证图；图21为实施例1的内标的特异性验证图；图22为实施例2的阳性对照的扩增曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种检测多种病原体的核酸组合物，该检测多种病原体的核酸组合物至少能够同时检测鲍式不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negativestaphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、白色念珠菌(candida Albicans)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilokis)、热带念珠菌(C.tropical)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)及鲍式不动杆菌耐药菌中的三种菌。其中，鲍式不动杆菌耐药菌是指对头孢哌酮等具有耐药性的鲍式不动杆菌。使用上述检测多种病原体的核酸组合物的进行实时荧光检测结果显示，上述检测多种病原体的核酸组合物的特异性高，各个病原体对应的扩增引物和对应的检测探针之间相互影响小，并且检测的灵敏度高，能够达到103copies/mL。
该检测多种病原体的核酸组合物包括扩增引物对及与扩增引物对应的检测探针。扩增引物对包括如下引物对中的至少三种：序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的鲍式不动杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的金黄色葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQID No.7及SEQ ID No.8所示的表皮葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.9及SEQ IDNo.10所示的绿脓假单胞菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示的肺炎克雷伯菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的粪肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示的屎肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.17及SEQ ID No.18所示的大肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的阴沟肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示的奇异变形杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.23及SEQ ID No.24所示的白色念珠菌扩增引物对、序列如SEQ IDNo.25及SEQ ID No.26所示的嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.27及SEQID No.28所示的光滑假丝酵母扩增引物对、序列如SEQ ID No.29及SEQ ID No.30所示的近平滑念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示的热带念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.33及SEQ ID No.34所示的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对、和序列如SEQ ID No.35及SEQ ID No.36所示的鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对。
鲍式不动杆菌扩增引物对、金黄色葡萄球菌扩增引物对、凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、表皮葡萄球菌扩增引物对、绿脓假单胞菌扩增引物对、肺炎克雷伯菌扩增引物对、粪肠球菌扩增引物对、屎肠球菌扩增引物对、大肠杆菌扩增引物对、阴沟肠杆菌扩增引物对、奇异变形杆菌扩增引物对、白色念珠菌扩增引物对、嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对、光滑假丝酵母扩增引物对、近平滑念珠菌扩增引物对、热带念珠菌扩增引物对、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、和鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对分别对应检测鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、嗜麦芽寡养单胞菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌、热带念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、和鲍式不动杆菌耐药菌。
具体地，鲍式不动杆菌扩增引物为序列如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。金黄色葡萄球菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.3所示的上游引物及序列如SEQ ID No.4所示的下游引物。凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.5所示的上游引物及序列如SEQ ID No.6所示的下游引物。表皮葡萄球菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.7所示的上游引物F4及序列如SEQ ID No.8所示的下游引物。绿脓假单胞菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.9所示的上游引物及序列如SEQ ID No.10所示的下游引物。肺炎克雷伯菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.11所示的上游引物及序列如SEQID No.12所示的下游引物。粪肠球菌的扩增引物对为SEQ ID No.13所示的上游引物及序列如SEQ ID No.14所示的下游引物。屎肠球菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.15所示的上游引物及序列如SEQ ID No.16所示的下游引物。扩增大肠杆菌扩增引物对为SEQ ID No.17所示的上游引物及序列如SEQ ID No.18所示的下游引物。阴沟肠杆菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.19所示的上游引物及序列如SEQ ID No.20所示的下游引物。奇异变形杆菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.21所示的上游引物及序列如SEQ ID No.22所示的下游引物。白色念珠菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.23所示的上游引物及序列如SEQ ID No.24所示的下游引物。嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.25所示的上游引物及序列如SEQ ID No.26所示的下游引物。光滑假丝酵母扩增引物对为序列如SEQ ID No.27所示的上游引物及序列如SEQ ID No.28所示的下游引物。近平滑念珠菌扩增引物对为SEQ IDNo.29所示的上游引物及序列如SEQ ID No.30所示的下游引物。热带念珠菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.31所示的上游引物及序列如SEQ ID No.32所示的下游引物。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对为SEQ ID No.33所示的上游引物及序列如SEQ ID No.34所示的下游引物。鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对为序列如SEQ ID No.35所示的上游引物及序列如SEQ ID No.36所示的下游引物。与扩增引物对对应的检测探针的序列或者与扩增引物对对应的检测探针的互补序列分别如SEQ ID No.35～SEQ ID No.54所示，检测探针上连接有荧光基团。
进一步地，与鲍式不动杆菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.37所示。与金黄色葡萄球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.38所示。与凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.39所示。与表皮葡萄球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.40所示。与绿脓假单胞菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQID No.41所示。与肺炎克雷伯菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.42所示。与粪肠球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.43所示。与屎肠球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.44所示。与大肠杆菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ IDNo.45所示。与阴沟肠杆菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.46所示。与奇异变形杆菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.47所示。与白色念珠菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.48所示。与嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.49所示。与光滑假丝酵母扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.50所示。与近平滑念珠菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.51所示。与热带念珠菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.52所示。与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.53所示。与鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.54所示。
检测探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。优选地，荧光基团位于检测探针的5’端，淬灭基团位于检测探针的3’端。
在其中一个实施例中，检测探针上的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。
在其中一个实施例中，扩增引物对包括鲍式不动杆菌扩增引物对、金黄色葡萄球菌扩增引物对、凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、表皮葡萄球菌扩增引物对、绿脓假单胞菌扩增引物对、肺炎克雷伯菌扩增引物对、粪肠球菌扩增引物对、屎肠球菌扩增引物对、大肠杆菌扩增引物对、阴沟肠杆菌扩增引物对、奇异变形杆菌扩增引物对、白色念珠菌扩增引物对、嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对、光滑假丝酵母扩增引物对、近平滑念珠菌扩增引物对、热带念珠菌扩增引物对、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、和鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对；扩增引物对为多组，同一组内的不同扩增引物对的检测探针上标记的荧光基团不同。
进一步地，扩增引物对为六组；其中，第一组包括鲍式不动杆菌扩增引物对、粪肠球菌扩增引物对和嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对；第二组包括金黄色葡萄球菌扩增引物对、屎肠球菌扩增引物对和光滑假丝酵母扩增引物对；第三组包括凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、大肠杆菌扩增引物对和近平滑念珠菌扩增引物对；第四组包括表皮葡萄球菌扩增引物对、阴沟肠杆菌扩增引物对和热带念珠菌扩增引物对；第五组包括绿脓假单胞菌扩增引物对、奇异变形杆菌扩增引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对；第六组包括肺炎克雷伯菌扩增引物对、白色念珠菌扩增引物对和鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对。
进一步地，各组内的各检测探针上的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。具体地，第一组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第二组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第三组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第四组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第五组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第六组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5。
在其中一个实施例中，核酸组合物还包括的序列如SEQ ID No.55及SEQ ID No.56所示内标引物对和与内标引物对对应的检测探针，与内标引物对对应的检测探针的序列或其互补序列如SEQ ID No.57所示，与内标引物对对应的检测探针上连接有与扩增引物对对应的检测探针不同的荧光基团。
进一步地，各组内均包括的序列如SEQ ID No.55及SEQ ID No.56所示内标引物对和的序列如SEQ ID No.57所示的与内标引物对对应的检测探针。同一组内的与内标引物对对应的检测探针上的荧光基团与扩增引物对对应的检测探针的荧光基团不同。具体地，第一组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第二组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第三组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第四组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第五组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；第六组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；各组内的内标探针上的荧光基因均为ROX。
上述检测多种病原体的核酸组合物，通过扩增引物对及检测探针的精心设计，避免了多个扩增引物及对应的检测探针之间的相互干扰，能够一次同时检测十八种病原体。并且经证实，使用上述检测多种病原体的核酸组合物检测时灵敏度高、特异性好。
本发明一实施方式提供了一种检测多种病原体的试剂盒，该检测多种病原体的试剂盒包括上述检测多种病原体的核酸组合物。
在其中一个实施例中，上述检测多种病原体的试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA提取试剂、PCR增强剂及PCR稳定剂中的至少一种。具体地，PCR反应缓冲液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20、硫酸镁、Taq DNA聚合酶、dNTPs及BSA。
在其中一个实施例中，上述检测多种病原体的试剂盒还包括阳性对照及阴性对照。进一步地，阳性对照为含有多种病原体的特异性片段的克隆质粒的混合物，阴性对照为人类基因组DNA。
本发明一实施方式提供了一种检测多种病原体的试剂盒的使用方法，该检测多种病原体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S110、提取待测样本的核酸，得到核酸样本。
具体地，核酸样本为从临床样本中提取得到的DNA。临床样本为鼻拭子、咽拭子或分泌物等类型。
S130、以核酸样本为模板，加入上述检测多种病原体的核酸组合物中的扩增引物对和对应的检测探针，进行实时荧光PCR扩增反应。
具体地，将核酸样本与PCR反应缓冲液及上述的检测多种病原体的核酸组合物中的扩增引物对和对应的检测探针混合，得到反应液。然后将反应液进行实时荧光PCR扩增反应。进一步地，将PCR反应缓冲液及上述的检测多种病原体的核酸组合物中的扩增引物对和对应的检测探针混合得到预反应液，然后将预反应液与核酸样本混合，得到反应液。其中，反应液中核酸样本的DNA的浓度为10ng～100ng；反应液中每个扩增引物对的上游引物和下游引物的终浓度分别为0.1μM～0.5μM和0.1μM～0.5μM；反应液中每个扩增引物对对应的检测探针的终浓度为0.1μM～0.5μM。其中，反应液还包括50mM～150mM的Tris-HCl、30mM～60mM的(NH4)2SO4、5mM～10mM的MgSO4、体积百分含量为5％～10％的甘油、体积百分含量为0.66％～1％的牛血清白蛋白(即BSA)、体积百分含量为0.12％～0.5％的乙基苯基聚乙二醇(即NP-40)、体积百分含量为0.05％～0.2％的吐温20、100mM～150mM的KCl、4mM～6mM的MgCl2、1mM～2mM的二硫苏糖醇(即DTT)、体积百分含量为3％～6％的DMSO及80μg/mL～100μg/mL的BT(牛凝血酶)。更进一步地，反应液还包括0.4mM～0.8mM的dNTPs。
在其中一个实施例中，将核酸样本分为多组，将上述的检测多种病原体的核酸组合物中的扩增引物对和对应的检测探针和PCR反应缓冲液分别与各组的核酸样本混合，得到多组反应液。其中，每组反应液中核酸样本的DNA的浓度为10ng～100ng；每组反应液中每个扩增引物对的上游引物和下游引物的终浓度分别为0.1μM～0.5μM和0.1μM～0.5μM；每组反应液中每个扩增引物对对应的检测探针的终浓度为0.1μM～0.5μM。
具体地，实时荧光PCR扩增反应的扩增条件为：90℃～98℃，1min～10min；90℃～98℃、10s～30s，55℃～65℃、10s～30s，30～40个循环。在其中一个实施例中，实时荧光PCR扩增反应的扩增条件为：95℃、3min，1个循环；95℃、15s，60℃、30s，40个循环。
S130、在实时荧光PCR扩增反应过程检测荧光信号，得到检测结果。
上述检测多种病原体的试剂盒的使用方法简便，快速。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)使用DNA提取试剂盒(天根，全式金的细菌DNA提取试剂盒)，分别对18个含有不同病原体的阳性样本进行DNA提取，得到18个只含有一种病原体的DNA的阳性待测样本。18个阳性样本分别对应于是只含鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、嗜麦芽寡养单胞菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌、热带念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、或鲍式不动杆菌耐药菌的阳性样本。每种阳性待测样本的具体获得步骤如下：取含有病原体样品的保存液1mL于1.5mL离心管中，8000rpm离心5min，弃上清；加入180μL溶菌酶消化液，涡旋混匀，37℃消化30min；加入20μL蛋白酶K和200μL裂解液，涡旋混匀15s，56℃消化30min；加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，得到粗提液；将DNA SpinColumn置于收集管中，将粗提液转到DNA Spin Column中，10000rpm离心1min，弃滤液，将DNA Spin Column放回收集管中；加500μL Wash Buffer到DNA Spin Column中，10000rpm离心1min，弃去收集管中的滤液，将DNA Spin Column放回收集管中，重复清洗一次；再次10000rpm离心1min，以除尽残留的Wash Buffer W2；将DNA Spin Column置于新的、无菌1.5mL EP管中，加入50μLElution Buffer到DNA Spin Column滤膜中央，10000rpm离心1min，得到阳性待测样本。阳性待测样本于-20℃保存备用。
(2)将核酸组合物与的PCR缓冲液混合，配置成六组预反应液；将步骤(1)获得的18种阳性待测样本混合，得到待检样本。其中，待检样本中各阳性待测样本的DNA的浓度均为10ng/μL。分别取5μL待检样本与20μL的六组预反应液混合，得六组反应液。其中，核酸组合物包括扩增引物对及与扩增引物对应的检测探针。其中，扩增引物对为六组，每组扩增引物对由三个扩增引物对及对应的检测探针和一个内标引物及对应的检测探针组成。具体序列如表1所示，其中SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41及SEQ ID No.42的5’端的荧光基团为FAM；SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47及SEQ ID No.48的5’端的荧光基团为HEX；SEQ IDNo.49、SEQ ID No.50、SEQID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53及SEQ ID No.54的5’端的荧光基团为CY5；SEQ ID No.57的5’端的荧光基团为ROX。每组反应液中的每个扩增引物对、扩增引物对对应的检测探针、内标、内标对应的检测探针的终浓度均为分别为0.1μM。
表1
Figure BDA0001931472940000061
PCR缓冲液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20、硫酸镁、Taq DNA聚合酶、dNTPs及BSA。其中，Tris-HCl在反应液中的浓度为50mmol/L；硫酸铵在反应液中的浓度为60mmol/L；氯化钾在反应液中的浓度为20mmol/L；Tween 20在反应液中的浓度为0.05％；硫酸镁在反应液中的浓度为5mmol/L。
同步处理阳性对照及阴性对照，阳性对照为18组，18组阳性对照组分别对应只含有18种病原体中的一种的病原体的DNA，DNA的浓度为10ng/μL。阴性对照为10ng/μL人类基因组DNA。
(3)将步骤(2)所得的六组反应液、阳性对照及阴性对照进行实时荧光定量PCR。PCR条件如表2所示，在实时荧光PCR扩增反应过程检测荧光信号，结果如图1～21所示。图1～21中横坐标为循环数(Cycle)，纵坐标为荧光值(△Rn)。
表2
Figure BDA0001931472940000071
由图1～19可以看出，待检样本中的18种病原体均被检出，检测灵敏度可以达到103copies/mL，且特异性良好，18种病原体之间无干扰。
实施例2
实施例2的步骤及所使用的试剂与实施例1大致相同，区别在于，核酸组合物及待检样本不同。实施例2核酸组合物为一组，具体为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.38、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56及SEQ ID No.57，其中，SEQ ID No.37的5’端的荧光基团为FAM，SEQ ID No.38的5’端的荧光基团为HEX，SEQ ID No.53的5’端的荧光基团为CY5，SEQ ID No.53的5’端的荧光基团为ROX。实施例2的待检样本为鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的阳性待测样本反应液。其中，待检样本中各阳性待测样本的DNA的浓度均为10ng/μL。
实施例2的结果如图20所示。图20中，阳性对照4个都有扩增信号出现，而阴性对照均无扩增。
由图20中可知，阴性对照无扩增，阳性对照有扩增，样品<38CT值，为有效实验结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市刚竹医疗科技有限公司
<120> 检测多种病原体的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatatcggt acccaagtcg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttgtaagc aaactgtgcc tc 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtcctgaa gcaagtgca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctttgtcaaa ctcgacttc 19
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgataaga gttcctatat 20
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<211> 21
<212> DNA
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cttatttatt actatatccg g 21
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaactcgtaa gtatgtatat a 21
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctgggcca gatttcatta tt 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacaacgccc tcagcatcac 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accagccagt tcagcgacc 19
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaccatctcg gtacagtttc a 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcctgcatc agactgtcca gtac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccagttcact gccggtttca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgaattggc agaggacg 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgccgacact agaaccca 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatttgatca atgtgaagg 19
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caggcttttt tgatgccaga gat 23
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtaaccggc tcgtccagga 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagtcgagtt gcagactcc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agagaagcga cctcgcga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatcagatac aaagagaagc gac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catggagtcg agttgcagac t 21
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atttggtggt ggtagacatt ag 22
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taaccatcaa tagtccatct 20
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggcactcca tccccagc 18
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcactagaac acaacaggcg gttcc 25
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgtccttcaa tttccttcaa cg 22
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atatttgcct tcaagatatc tgcc 24
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gacgctcaaa caggcatgcc ct 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tatgattgca gatattcgag aat 23
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<212> DNA
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acgaggccca tcaggaccgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatactggag ctcagtgcct g 21
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaagttaga ttgggatcat agcgtca 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcacaattcc acattgtttc ggtctaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
caaactcggg gagttcatct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatacagca tcagcaattg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggctggtggg tcctttaaaa attactcc 28
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacgaaaaaa atggtagaaa atgctaagaa a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caatcatcac aacgatacaa tacatcc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgccccgtag taataccaaa tgca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgaacaagcc ggtgcgctac agc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcagcgtaa taacgtaggg cgtgtagcga 30
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtaaacagt agcaccaatg atttggtgat aa 32
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<212> DNA
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ggtttgacaa acatcggata aagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccgacgattt ctgcgcaaca ttttcatacc 30
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ccggactacg acgcacttta tgag 24
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cgcgagagca agcggaactc ataaag 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggggaaca atttgcttat gttca 25
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catgagcacg gtgcgcaaag cgcatc 26
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cccaaagagg tgaggatgat ttaacat 27
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ccaaagggcg caatgtgcgt tcaaagattc 30
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catccgcctc agccgcctgc aca 23
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<212> DNA
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aattccagga atgcagaaag accaaagcac c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagaacacct aaatgagata aagtaatttc 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatcaccat cttccaggag c 21
<210> 56
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gactccacga cgtactcagc g 21
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccagcatcgc cccacttgat tttg 24

Claims (7)

1.一种检测多种病原体的试剂盒，其特征在于，包括检测多种病原体的核酸组合物和PCR缓冲液，所述核酸组合物包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的检测探针；
所述扩增引物对包括如下扩增引物对：序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的鲍式不动杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的金黄色葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQID No.7及SEQ ID No.8所示的表皮葡萄球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.9及SEQ IDNo.10所示的绿脓假单胞菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示的肺炎克雷伯菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的粪肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示的屎肠球菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.17及SEQ ID No.18所示的大肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的阴沟肠杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示的奇异变形杆菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.23及SEQ ID No.24所示的白色念珠菌扩增引物对、序列如SEQ IDNo.25及SEQ ID No.26所示的嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.27及SEQID No.28所示的光滑假丝酵母扩增引物对、序列如SEQ ID No.29及SEQ ID No.30所示的近平滑念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示的热带念珠菌扩增引物对、序列如SEQ ID No.33及SEQ ID No.34所示的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对、和序列如SEQ ID No.35及SEQ ID No.36所示的鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对；
所述扩增引物对为六组；其中，第一组包括所述鲍式不动杆菌扩增引物对、所述粪肠球菌扩增引物对和所述嗜麦芽寡养单胞菌扩增引物对；第二组包括所述金黄色葡萄球菌扩增引物对、所述屎肠球菌扩增引物对和所述光滑假丝酵母扩增引物对；第三组包括所述凝固酶阴性葡萄球菌扩增引物对、所述大肠杆菌扩增引物对和所述近平滑念珠菌扩增引物对；第四组包括所述表皮葡萄球菌扩增引物对、所述阴沟肠杆菌扩增引物对和所述热带念珠菌扩增引物对；第五组包括所述绿脓假单胞菌扩增引物对、所述奇异变形杆菌扩增引物对和所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌扩增引物对；第六组包括所述肺炎克雷伯菌扩增引物对、所述白色念珠菌扩增引物对和所述鲍式不动杆菌耐药菌扩增引物对；
与所述扩增引物对对应的检测探针的序列或其互补序列分别如SEQ ID No.37～SEQID No.54所示，检测探针上有荧光基团；
所述PCR缓冲液与所述核酸组合物混合形成反应液，其中，所述反应液中核酸样本的DNA的浓度为10ng～100ng；所述反应液中每个扩增引物对的上游引物和下游引物的终浓度分别为0.1μM～0.5μM和0.1μM～0.5μM；反应液中每个扩增引物对对应的检测探针的终浓度为0.1μM～0.5μM；所述反应液还包括50mM～150mM的Tris-HCl、30mM～60mM的(NH4)2SO4、5mM～10mM的MgSO4、体积百分含量为5％～10％的甘油、体积百分含量为0.66％～1％的牛血清白蛋白、体积百分含量为0.12％～0.5％的乙基苯基聚乙二醇、体积百分含量为0.05％～0.2％的吐温20、100mM～150mM的KCl、4mM～6mM的MgCl2、1mM～2mM的二硫苏糖醇、体积百分含量为3％～6％的DMSO、80μg/mL～100μg/mL的牛凝血酶和0.4mM～0.8mM的dNTPs。
2.根据权利要求1所述的检测多种病原体的试剂盒，其特征在于，各组内的各所述检测探针上的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。
3.根据权利要求2所述的检测多种病原体的试剂盒，其特征在于，所述第一组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；所述第二组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；所述第三组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；所述第四组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；所述第五组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；所述第六组内的对应的检测探针上的荧光基团分别为FAM、HEX和CY5；各组内的与内标引物对对应的检测探针上的荧光基因均为ROX。
4.根据权利要求1～3任一项所述的检测多种病原体的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合物还包括序列如SEQ ID No.55及SEQ ID No.56所示内标引物对和与所述内标引物对对应的检测探针，与所述内标引物对对应的检测探针的序列或其互补序列如SEQ ID No.57所示，所述与内标引物对对应的检测探针上连接有与所述扩增引物对对应的检测探针不同的荧光基团。
5.根据权利要求1所述的检测多种病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR稳定剂及PCR增强剂中的至少一种。
6.一种检测多种病原体的试剂盒的使用方法，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以所述核酸样本为模板，加入权利要求1～5中任一项所述的检测多种病原体的试剂盒中的扩增引物对和对应的检测探针以及PCR缓冲液，进行实时荧光PCR扩增反应；及
在实时荧光PCR扩增反应过程检测荧光信号，得到检测结果。
7.根据权利要求6所述的检测多种病原体的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增反应的扩增条件为：90℃～98℃、1min～10min；及90℃～98℃、10s～30s，55℃～65℃、10s～30s，30～40个循环。
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