CN107937578A - 15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病原体检测试剂，具体公开了15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。本发明针对肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌和脓肿分枝杆菌的基因序列保守区域特异的靶序列，通过设计互相不存在交叉反应的引物和探针，既克服了针对不同病原菌的检测探针易产生相互影响或干扰的问题，又保证了不同引物和探针的组合和匹配，还可实现在相同温度下同时进行高效的特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及病原体检测试剂，具体地说，涉及15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
在成年人和儿童中，发热伴呼吸道症候群是最普通的急性传染病，主要由多种病原体引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变，其中包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。
由于临床症状均表现为发热(体温≥38℃)，并伴有乏力、头痛、咳嗽、咽喉疼痛、全身酸痛等上呼吸道症状，对各种病原体的诊断需要大量的实验筛查，操作步骤繁琐、耗费时间较长，工作效率较低。
目前，常见的社区性呼吸道感染病原体包括肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌，脓肿分枝杆菌。
为提高临床检测效率，快速确认病原体，为后续的用药和治疗进行指导，急需更简便、更快速并且能够联合检测的方案。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。
然而，目前还没有可对以上15种病原菌进行同时PCR法检测，并保证检测准确性和特异性的有效方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明针对肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌和脓肿分枝杆菌的基因序列保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，之后经过严格筛选，获得一套互相不存在交叉反应的引物探针组合，可利用Real-time PCR的方法，快速联合检测样品中是否存在以上15种病原体的核酸。
所述引物探针组合包括如下引物和探针：
(1)肺炎克雷伯菌
P1：5’-TGCCCACTTTGTTAACGCCT-3’；
P2：5’-AGATAAAACGCCAGGCCAAGA-3’；
探针1：5’-X1-CGGCGTGGGATTCGCTTTCGAGCCT-Y-3’；
(2)流感嗜血杆菌
P3：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；
P4：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；
探针2：5’-X2-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；
(3)化脓链球菌
P5：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；
P6：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；
探针3：5’-X3-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；
(4)金黄色葡萄球菌
P7：5’-TGTTATCCATCGCCTACGCC-3’；
P8：5’-AGTGAGAATGCCGGTGTGAG-3’；
探针4：5’-X4-TCGGCCTCAGCTTAGGACCCTAACCC-Y-3’；
(5)大肠埃希菌
P9：5’-TATCCTTTGTTGCCAGCGGT-3’；
P10：5’-CGCTTCTCTTTGTATGCGCC-3’；
探针5：5’-X1-CGGCCGGGAACTCAAAGGAGACT-Y-3’；
(6)肺炎衣原体
P11：5’-GTCCTTGCCGTAAACGATGC-3’；
P12：5’-AGGTAAGGTCCTTCGCGTTG-3’；
探针6：5’-X2-CCCCATCCGTGTCGGAGCTAACG-Y-3’；
(7)结核分枝杆菌
P13：5’-CGTAATAGGTGTCCGGCTCG-3’；
P14：5’-TAAGGGGCCTTTTGACGGTG-3’；
探针7：5’-X3-CGATCGGGGGCAAGTCATCGGC-Y-3’；
(8)嗜麦芽窄食单胞菌
P15：5’-TGCGCTTTAATTGCTGCGTT-3’；
P16：5’-CAGGGCATGTTTTCTGGCAC-3’；
探针8：5’-X4-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG-Y-3’；
(9)鲍曼不动杆菌
P17：5’-AGGGCCATGATGACTTGACG-3’；
P18：5’-TCGTGTCGTGAGATGTTGGG-3’；
探针9：5’-X1-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGY-3’；
(10)肺炎支原体
P19：5’-CAATTGTTGCTGGTGCCCTC-3’；
P20：5’-CCGGAGATCAGAGCGTTACC-3’；
探针10：5’-X2-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG-Y-3’；
(11)粪肠球菌
P21：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；
P22：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；
探针11：5’-X3-AGCACGATGCATAGCCGACCTGAGA-Y-3’；
(12)嗜肺军团杆菌
P23：5’-CCGTCCGCTGACTGGATAAA-3’；
P24：5’-ACAGACGGCAACTGGTACTG-3’；
探针12：5’-X4-TGCTGCGGTACCCTGCGATTC-Y-3’；
(13)肺炎链球菌
P25：5’-TGCTAAGGGCAGTACGAACC-3’；
P26：5’-GTTCGGTCAGTCGGATGTGG-3’；
探针13：5’-X1-TGCAGAAGAACGGTTTAAGGAGCTGAGCT GGC-Y-3’；
(14)绿脓假单胞菌
P27：5’-AAGCCTATCGCAAGGCTGAC-3’；
P2：5’-CCTATTACTTGCGGCTGGCT-3’；
探针14：5’-X2-CTCTCGCTGCTCAGAAAGCTCAGCAGAC-Y-3’；
(15)脓肿分枝杆菌
P29：5’-ACAAGCGGTGGAGTATGTGG-3’；
P30：5’-CCCAACATCTCACGACACGA-3’；
探针15：5’-X3-TGGTTTGATCATGGCCGGAGGCGC-Y-3’；
其中，上述探针中的X1、X2、X3和X4分别为不同的荧光基团，Y为淬灭基团。
所述荧光基团可为FAM、Cy3、Cy5和Texas red等，淬灭基团可为BHQ1或TAMRA。实际运用中不限于以上所列的荧光基团种类，替换或者交换探针的荧光基团或者淬灭基团同样受到本发明的保护。
在本发明的具体实施方式中，上述探针中的X1采用荧光基团FAM，X2采用荧光基团Cy3，X3采用荧光基团Cy5，X4采用荧光基团Texas red，Y采用淬灭基团BHQ1或TAMRA。
本发明所提供的引物探针组合，可对以上15种常见呼吸道病原体进行同时检测，并表现为强特异性，且针对不同病原菌的检测引物探针不产生相互影响或干扰，保证了不同引物和探针组合的匹配，并可实现在相同温度下同时进行高效的特异性检测。
基于上述技术方案，含有本发明所述引物探针组合的试剂也属于本发明的保护范围。
在所述试剂的实际应用中，为了更好的确保检测的准确性，所述试剂中还引入了一套针对内参基因GAPDH设计的引物和探针：
P31：5’-TTTGGCTACAGCAACAGGGT-3’；
P32：5’-TTTGGCTACAGCAACAGGGT-3’；
探针16：5’-X4-CTCTGGGCGCTGCTCAGGCTCAGCAGAC-Y-3’。
进一步地，含有本发明所述引物探针组合的试剂盒，以及含有前述试剂的试剂盒，也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒还含有本领域常规选用的其他成分，例如反应缓冲液、Mg2+、dNTP、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。
其中，所述酶混合液主要含有热启动Taq酶，所述阴性质控品为无RNase和DNase水，所述阳性质控品为含有15种病原菌检测靶序列的重组质粒。
所述试剂盒的PCR反应体系为20μL：包括2*PCR缓冲液液10μL、10mmol/L dNTP 1.0μL、25μmol/L引物各0.5μL、10μmol/L探针0.2μL、热启动Taq酶混合液0.4μL、样品DNA 2μL，加灭菌水至终体系20μL。
所述试剂盒的PCR反应条件为：
94℃预变性2min；
94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。
进一步地，经过实验探索，15种呼吸道病原菌和内参基因的检测分为4个反应体系进行检测，最优的反应体系配比与组合见表1和表2，变换组合形式会使检测效率大大降低。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果在于：
本发明针对肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌和脓肿分枝杆菌的基因序列保守区域特异的靶序列，通过设计互相不存在交叉反应的引物和探针，既克服了针对不同病原菌的检测探针易产生相互影响或干扰的问题，又保证了不同引物和探针的组合和匹配，还可实现在相同温度下同时进行高效的特异性检测，达到对15中呼吸道病原菌快速检测的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中针对肺炎克雷伯菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图2为本发明实施例1中针对流感嗜血杆菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图3为本发明实施例1中针对化脓链球菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图4为本发明实施例1中针对金黄色葡萄球菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图5为本发明实施例1中针对大肠埃希菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图6为本发明实施例1中针对肺炎衣原体进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图7为本发明实施例1中针对结核分枝杆菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图8为本发明实施例1中针对嗜麦芽窄食单胞菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图9为本发明实施例1中针对鲍曼不动杆菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图10为本发明实施例1中针对肺炎支原体进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图11为本发明实施例1中针对粪肠球菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图12为本发明实施例1中针对嗜肺军团杆菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图13为本发明实施例1中针对肺炎链球菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图14为本发明实施例1中针对绿脓假单胞菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线
图15为本发明实施例1中针对脓肿分枝杆菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图16为本发明实施例1中针对内参基因GAPDH进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图17-图20为16个探针每个反应孔内的组合1-组合4对检测对象的反应情况。
图21为本发明实施例1中16个探针组合同时针对同一反应体系内肺炎克雷博菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌和肺炎链球菌四种菌进行的realtime PCR反应的扩增曲线。
图22-图25为更改16个探针组合方式后的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明一种特异性检测样品中15种呼吸道病原菌的试剂盒，其组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有15种病原菌检测靶序列的重组质粒。
其中PCR反应液中用于核酸扩增的引物和探针如表1所列，为针对15种呼吸道病原菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物以及用于荧光信号监测的寡核苷酸探针，以及内参基因的引物和探针。探针中荧光报告基团X和荧光淬灭基团Y如表2所列。经过实验探索，15种呼吸道病原菌和内参基因的检测分为4个反应体系进行检测，表1所示为最优的反应体系配比与组合，变换组合形式会使检测效率大大降低。
表1检测15种呼吸道病原菌的引物和探针序列
表2荧光基团和淬灭基团列表
| 名称 | 荧光基团/淬灭基团 |
| X1 | FAM |
| X2 | Cy3 |
| X3 | Cy5 |
| X4 | Texas red |
| Y | BHQ1或TAMRA |
PCR反应体系为20μL：包括2*PCR缓冲液液10μL、10mmol/L dNTP 1.0μL、25μmol/L引物各0.5μL、10μmol/L探针0.2μL、热启动Taq酶混合液0.4μL、样品DNA 2μL，加灭菌水至终体系20μL。试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。
以标准菌和人基因组DNA为检测对象，分别应用上述16个组合的引物探针单独进行反应，得到扩增曲线如图1～16所示，如图可以看出，扩增曲线单一且平滑，显示出探针对于目的序列优越的识别能力。
图17-20为16个探针每个反应孔内的组合对检测对象的反应情况，图21为16个探针组合同时进行检测的结果。如图可以看出，扩增曲线单一且平滑，显示出探针具有良好的特异性，并且无交叉影响。
图22-25为更改组合方式后的检测结果，如图可以看出，扩增曲线无法形成，显示出探针之间存在相互干扰，各组引物探针均无法扩增到靶序列。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 西安九安生物技术有限公司
<120> 15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒
<130> KHP171117022.2
<141> 2017-12-06
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcccacttt gttaacgcct 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agataaaacg ccaggccaag a 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggcgtggga ttcgctttcg agcct 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgaccaggt gcgtgatagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgaccaggt gcgtgatagg 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcccaccac gatccgattc cac 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaggagcac ggattccagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctaggagcac ggattccagc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcccaccac gatccgattc cac 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgttatccat cgcctacgcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtgagaatg ccggtgtgag 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcggcctcag cttaggaccc taaccc 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
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tatcctttgt tgccagcggt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcttctctt tgtatgcgcc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggccgggaa ctcaaaggag act 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtccttgccg taaacgatgc 20
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<212> DNA
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aggtaaggtc cttcgcgttg 20
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<211> 23
<212> DNA
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ccccatccgt gtcggagcta acg 23
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgtaataggt gtccggctcg 20
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<212> DNA
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taaggggcct tttgacggtg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgatcggggg caagtcatcg gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcgctttaa ttgctgcgtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cagggcatgt tttctggcac 20
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgatgcaacg cgaagaacct tacctg 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggccatga tgacttgacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgtgtcgtg agatgttggg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgatgcaacg cgaagaacct tacctggy 28
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caattgttgc tggtgccctc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
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ccggagatca gagcgttacc 20
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<211> 27
<212> DNA
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cgatgcaacg cgaagaacct tacctgg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttggtgagg taacggctca 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttggtgagg taacggctca 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agcacgatgc atagccgacc tgaga 25
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccgtccgctg actggataaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acagacggca actggtactg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctgcggta ccctgcgatt c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgctaagggc agtacgaacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttcggtcag tcggatgtgg 20
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcagaagaa cggtttaagg agctgagctg gc 32
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagcctatcg caaggctgac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctattactt gcggctggct 20
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctctcgctgc tcagaaagct cagcagac 28
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acaagcggtg gagtatgtgg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccaacatct cacgacacga 20
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tggtttgatc atggccggag gcgc 24
Claims (9)
1.一种15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合，其特征在于，包括如下引物和探针：
(1)肺炎克雷伯菌
P1：5’-TGCCCACTTTGTTAACGCCT-3’；
P2：5’-AGATAAAACGCCAGGCCAAGA-3’；
探针1：5’-X1-CGGCGTGGGATTCGCTTTCGAGCCT-Y-3’；
(2)流感嗜血杆菌
P3：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；
P4：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；
探针2：5’-X2-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；
(3)化脓链球菌
P5：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；
P6：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；
探针3：5’-X3-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；
(4)金黄色葡萄球菌
P7：5’-TGTTATCCATCGCCTACGCC-3’；
P8：5’-AGTGAGAATGCCGGTGTGAG-3’；
探针4：5’-X4-TCGGCCTCAGCTTAGGACCCTAACCC-Y-3’；
(5)大肠埃希菌
P9：5’-TATCCTTTGTTGCCAGCGGT-3’；
P10：5’-CGCTTCTCTTTGTATGCGCC-3’；
探针5：5’-X1-CGGCCGGGAACTCAAAGGAGACT-Y-3’；
(6)肺炎衣原体
P11：5’-GTCCTTGCCGTAAACGATGC-3’；
P12：5’-AGGTAAGGTCCTTCGCGTTG-3’；
探针6：5’-X2-CCCCATCCGTGTCGGAGCTAACG-Y-3’；
(7)结核分枝杆菌
P13：5’-CGTAATAGGTGTCCGGCTCG-3’；
P14：5’-TAAGGGGCCTTTTGACGGTG-3’；
探针7：5’-X3-CGATCGGGGGCAAGTCATCGGC-Y-3’；
(8)嗜麦芽窄食单胞菌
P15：5’-TGCGCTTTAATTGCTGCGTT-3’；
P16：5’-CAGGGCATGTTTTCTGGCAC-3’；
探针8：5’-X4-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG-Y-3’；
(9)鲍曼不动杆菌
P17：5’-AGGGCCATGATGACTTGACG-3’；
P18：5’-TCGTGTCGTGAGATGTTGGG-3’；
探针9：5’-X1-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGY-3’；
(10)肺炎支原体
P19：5’-CAATTGTTGCTGGTGCCCTC-3’；
P20：5’-CCGGAGATCAGAGCGTTACC-3’；
探针10：5’-X2-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG-Y-3’；
(11)粪肠球菌
P21：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；
P22：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；
探针11：5’-X3-AGCACGATGCATAGCCGACCTGAGA-Y-3’；
(12)嗜肺军团杆菌
P23：5’-CCGTCCGCTGACTGGATAAA-3’；
P24：5’-ACAGACGGCAACTGGTACTG-3’；
探针12：5’-X4-TGCTGCGGTACCCTGCGATTC-Y-3’；
(13)肺炎链球菌
P25：5’-TGCTAAGGGCAGTACGAACC-3’；
P26：5’-GTTCGGTCAGTCGGATGTGG-3’；
探针13：5’-X1-TGCAGAAGAACGGTTTAAGGAGCTGAGCTGGC-Y-3’；
(14)绿脓假单胞菌
P27：5’-AAGCCTATCGCAAGGCTGAC-3’；
P2：5’-CCTATTACTTGCGGCTGGCT-3’；
探针14：5’-X2-CTCTCGCTGCTCAGAAAGCTCAGCAGAC-Y-3’；
(15)脓肿分枝杆菌
P29：5’-ACAAGCGGTGGAGTATGTGG-3’；
P30：5’-CCCAACATCTCACGACACGA-3’；
探针15：5’-X3-TGGTTTGATCATGGCCGGAGGCGC-Y-3’；
其中，上述探针中的X1、X2、X3和X4分别为不同的荧光基团，Y为淬灭基团。
2.含有权利要求1所述引物探针组合的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，还含有针对内参基因的引物和探针：
P31：5’-TTTGGCTACAGCAACAGGGT-3’；
P32：5’-TTTGGCTACAGCAACAGGGT-3’；
探针16：5’-X4-CTCTGGGCGCTGCTCAGGCTCAGCAGAC-Y-3’。
4.含有权利要求1所述引物探针组合的试剂盒。
5.含有权利要求2或3所述试剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有反应缓冲液、Mg2+、dNTP、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液含有热启动Taq酶。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为无RNase和DNase水。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有15种病原菌检测靶序列的重组质粒。
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