CN114574609B

CN114574609B - 检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN114574609B
Application number: CN202111603663.9A
Authority: CN
Inventors: 黄超杰; 张萌; 黄华香; 张涛
Original assignee: Guangdong Runpon Bioscience Co Ltd
Current assignee: Guangdong Runpon Bioscience Co Ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114574609A

Abstract

本发明公开了一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法。该试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中的至少一种：毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5；或毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6。本申请结合主要针对于引起毛霉菌6个属和1个种的18s rDNA序列设计通用引物，以及针对于以上种属设计各自的特异性探针，该引物探针组合适配于PCR仪平台，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上出检测结果。

Description

检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法。

背景技术

毛霉菌病(mucormycosis)是一种侵袭性真菌病，以前称为接合菌病，是由毛霉菌目真菌引起的危害较大的感染性疾病。其特征为菌丝侵犯血管，引起血栓形成及坏死，产生鼻、脑、消化道及呼吸道等处病变，预后严重。“毛霉菌病”可能造成眼、鼻发红疼痛，并伴有发烧、头疼、咳嗽、呼吸急促等症状，严重情况下还可能造成上颌骨受损甚至失明。毛霉菌病是一种严重但罕见的真菌感染，可能导致病人失明或其他严重问题，致死率高达50％。对免疫力低下的人群(比如糖尿病、癌症、器官移植、艾滋病以及长期应用细胞毒类药物与皮质类固醇等患者)致死率甚至达到80％。

作为机会性感染病的致病菌，ICU中的新冠患者往往会使用大剂量的类固醇用于治疗炎症，但这同时也会抑制人体免疫系统，给毛霉菌可乘之机。

毛霉菌目包括了55个属261个钟，其中至少有38种能明确导致人类感染，主要致病菌包括根霉属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucor spp)和横梗霉属(Lichtheimia spp，旧称Absidia spp)，其次是根毛霉属(Rhizomucor spp)、小克银汉霉属(Cunninghamellaspp)、鳞质霉属 (Apophysomyces spp)等。

目前，毛霉病诊断方法主要包括常规检查法、血清免疫方法、分子生物学方法等，其中常规检查法主要包括影像学、组织病理学和真菌培养等。即采用MRI或CT等影像学检查的方式可以确定疾病程度，但是不能鉴定病原菌。采用组织病理切片HE、PAS或银染色或直接镜检，根据真菌特征进行判断进行初步判断，但不具有特异性，鉴定不准确。真菌培养可以进行属和种鉴定及抗真菌药敏试验等，但是周期较长，通常需要几天到几周的时间，导致病情延误或用药不准，增加死亡率。血清免疫学检测特异性交叉，同时很难覆盖毛霉菌多种病原体，因此在应用时难以排出真菌间的抗原交叉反应导致假阳性或假阴性从而导致误判，比如2012年美国加州大学洛杉矶海滨分校医学中心的洛杉矶生物医学研究所申请的《利用CotH 的毛霉菌病的免疫疗法和诊断》(专利号：103998057A)可以用于检测米根霉(R.oryzae)引起的毛霉菌病，但是对于其他类型的毛霉菌可能会存在漏检。分子检测方法是《2019年欧洲毛霉病诊疗指南》中强烈推荐的方法，分子鉴定相对于形态学更可靠，优先推荐内部转录间隔区(ITS)测序，是分子鉴定的最佳技术，可以用于流行病学研究，用于临床相对周期较长。 MALDI-TOF鉴定依赖内部数据库，许多实验室不具备此条件。博奥生物2018年申请的专利《引物组及其应用》(CN109706145B)采用了LAMP技术，提供的引物组合鉴定用于检测常见的四种毛霉目真菌，即稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)和/或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)等4种毛霉菌病致病菌，具有高特异性和高灵敏度，但是该专利检测的毛霉菌种类较少，只针对于4种毛霉菌病致病菌进行检测，在临床上存在假阴性的问题。因此综上所述，由于引起毛霉菌病的致病菌种类较多，主要涉及毛霉菌目12个属38个种，不同地区毛霉病致病菌存在一些差异，比如Apophysomyces variabilis和Apophysomyces elegans在全球范围比较罕见，但是在印度引起的毛霉病占总发病率的7.9％～25％，仅次于米根霉引起的毛霉病，目前市面上针对于毛霉菌检测的产品或专利均是根据国际上最常见的几种毛霉菌致病菌株进行设计和检测，不能很好地覆盖印度地区的毛霉病致病菌种类，因此存在很大漏检的风险。

另外，市面上基于荧光定量PCR技术的毛霉菌核酸检测试剂盒采用常规qPCR技术，运行时间长，不包括核酸提取，仅仅核酸扩增环节一般需要1～1.5小时，甚至更长，满足不了患者的现场检测需求。进一步的，市面上或专利中基于荧光定量PCR技术的毛霉菌核酸检测试剂盒均采用液体试剂的形式，该产品形式需要-20℃的环境运输和保存，这种产品形式不适合长时间运输，也不利于保存。

发明内容

本发明旨在提供一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法，以实现准确的检测毛霉菌病病原体。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒。该试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中的至少一种：毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1：5'-AGTCATAATAAACAVGCCCAA-3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2：5'-AGTCAAAAGAAACACGCCCAA-3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3：5'-AGCCTTAATAGCCAAGCCC-3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4： 5'-TGTCCAAAGGATCAAGCC-3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5： 5'-AAGCCATAGAGCAAACCC-3'；或毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6： 5'-CTGCCAGTGGCGAGGAC-3'。

进一步地，试剂盒还包括：毛霉菌病病原体正向引物1： 5'-ACCACAAACTATGCCGACTAGAGAT-3'和毛霉菌病病原体反向引物1： 5'-CCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAG-3'；或毛霉菌病病原体正向引物2：5'-GGGATCGAAGACGATTAGATACCG-3'和毛霉菌病病原体反向引物2：5'-CAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGC-3'。

进一步地，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团和/或MGB。

进一步地，荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、 CY5或Texas Red。

进一步地，荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。

进一步地，试剂盒还包括PCR反应液和酶制剂。

进一步地，PCR反应液包括dATPs、dUTPs、dGTPs和dCTPs四种核苷酸及含有镁离子的缓冲液。

进一步地，酶制剂为包含有热启动的Taq DNA聚合酶和UDG酶；可选地，试剂盒还包括质控品，优选为阳性质控品。

根据本发明的另一个方面，提供一种检测毛霉菌病病原体的方法。该方法包括采用上述任一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒进行PCR检测，包括以下步骤：样本DNA提取，得到样本DNA；将样本DNA、毛霉菌病病原体寡核苷酸探针加入到复溶液复溶的酶制剂中制得 PCR反应体系进行PCR扩增，检测毛霉菌病病原体。

进一步地，PCR扩增的程序为：93～97℃1～3min，93～97℃3～7S和58～62℃18～22S 45个循环；优选的，PCR反应体系中还包括：毛霉菌病病原体正向引物和毛霉菌病病原体反向引物：优选的，PCR检测为荧光PCR检测，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，PCR扩增采用的PCR仪设定包括信号收集：FAM通道信号收集和VIC通道信号收集。

本申请结合国际上毛霉菌病和印度毛霉菌病致病菌流行病学研究资料，主要针对于引起毛霉菌的根霉属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucor spp)、横梗霉属(Lichtheimiaspp)、根毛霉属 (Rhizomucor spp)、鳞质霉属(Apophysomyces spp)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)、以及伞状犁头霉(absidia corymbifera)等6个属和1个种的18srDNA序列设计通用引物，以及针对于以上种属设计各自的特异性探针，该引物探针组合适配于PCR仪平台，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上出检测结果。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增米根霉(Rhizopus oryzae)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图2示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增同合根霉(Rhizopushomothallicus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图3示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增小孢根霉(Rhizopus microsporus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图4示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增刺囊毛霉(Mucor spinosus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图5示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增暗褐色毛霉(Mucor fuscus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图6示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增横梗霉(lichtheimia ramosa)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图7示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图8示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans) 阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图9示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增雅致鳞质霉(Apophysomyceselegans)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图10示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增黑曲霉(Aspergillus niger)样本核酸、健康人唾液样本核酸和阴性对照的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；

图11示出了灵敏度实验数据(上：米根霉(Rhizopus oryzae)1000copies/mL浓度扩增曲线；中：米根霉500copies/mL浓度扩增曲线；下：米根霉250copies/mL浓度扩增曲线)；

图12a、图12b和图12c示出了灵敏度实验数据(1：米根霉(Rhizopus oryzae)500copies/mL 浓度扩增曲线；2：同合根霉(Rhizopus homothallicus)500copies/mL浓度扩增曲线；3：小孢根霉(Rhizopus microsporus)500copies/mL浓度扩增曲线；4：刺囊毛霉(Mucor spinosus) 500copies/mL浓度扩增曲线；5：暗褐色毛霉(Mucor fuscus)500copies/mL浓度扩增曲线；6：横梗霉(lichtheimia ramosa)500copies/mL浓度扩增曲线；7：微小根毛霉(Rhizomucor pusillus) 500copies/mL浓度扩增曲线；8：雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)500copies/mL浓度扩增曲线；9：雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)500copies/mL浓度扩增曲线)；

图13示出了特异性检测实验扩增曲线数据；以及

图14示出了精密度实验数据(上：米根霉(Rhizopus oryzae)1.0E+05copies/mL浓度扩增曲线；下：米根霉500copies/mL浓度扩增曲线)。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

针对本申请背景技术中提到的一系列技术问题，本申请提出了下列技术方案。

根据本发明一种典型的实施方式，提供检测毛霉菌病病原体的试剂盒。该试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中的至少一种：

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1(SEQ ID NO.1)：5'-AGTCATAATAAACAVGCCCAA-3'，其中V代表A或G或C，其中，V代表A时检测毛霉属，V代表G时检测多变根毛霉，V代表C是检测根霉属；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2(SEQ ID NO.2)：5'-AGTCAAAAGAAACACGCCCAA-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3(SEQ ID NO.3)：5'-AGCCTTAATAGCCAAGCCC-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4(SEQ ID NO.4)：5'-TGTCCAAAGGATCAAGCC-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5(SEQ ID NO.5)：5'-AAGCCATAGAGCAAACCC-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6(SEQ ID NO.6)：5'-CTGCCAGTGGCGAGGAC-3'。

为了方便检测且检测结果准确，该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为本发明的进一步改进，以上荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、 JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red；荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ等。另外，还可以采用MGB(Minor GrooveBinder) 修饰基团对探针进行进一步改良。探针3’端连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高 10℃左右，从而可以加大的加强定量PCR反应过程中的特异性。

为了进一步提高本发明试剂盒的检测准确性，该试剂盒还还包括：毛霉菌病病原体正向引物1(SEQ ID NO.7)：5'-ACCACAAACTATGCCGACTAGAGAT-3'和毛霉菌病病原体反向引物1(SEQ ID NO.8)：5'-CCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAG-3'；或毛霉菌病病原体正向引物 2(SEQ ID NO.9)：5'-GGGATCGAAGACGATTAGATACCG-3'和毛霉菌病病原体反向引物2 (SEQ IDNO.10)：5'-CAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGC-3'。

该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为本发明的进一步改进，以上荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed；荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ等。另外，还可以采用MGB(Minor GrooveBinder)修饰基团对探针进行进一步改良。探针3’端连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，从而可以加大的加强定量PCR反应过程中的特异性。

根据本发明一种典型的实施方式，本发明的试剂盒还包含PCR反应液、酶制剂、阳性质控品、阴性质控品、复溶液等6个组分。其中PCR反应液主要包括dATPs、dUTPs、dGTPs、dCTPs等四种核苷酸、用于检测毛霉菌病病原体的荧光PCR引物和荧光探针、含有镁离子的缓冲液组成。其中酶制剂为包含有热启动的Taq DNA聚合酶和UDG酶等干粉制剂。其中阳性质控品为含插入米根霉(Rhizopus oryzae)特异性保守序列的质粒载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释。其中优选的阳性质控品的浓度为1.0×10⁶copies/mL。其中阴性质控品可以为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用分子级水配制。其中复溶液为分子级水。

在本发明一优选的实施例中，基于荧光PCR技术的检测毛霉菌病病原体的方法，包括如下操作步骤：

1)样本DNA提取：样本DNA提取得到的核酸产物用于接下来的核酸检测步骤。

2)首先吸取900μL加入到复溶液复溶酶冻干制剂的西林瓶中，涡旋混匀，然后按照下表 1配制反应体系：

表1

组分	1人份	N人份(N+1阳性+1阴性)
			复溶酶冻干制剂	5μL	5×(N+3)
PCR反应液	10μL	10×(N+3)

3)然后按照每反应15μL的体系进行分装，然后加入5μL提取得到的核酸产物，混匀后按照下列程序进行设置扩增检测。

4)常规qPCR仪博日Gene-9660上扩增程序设置表2：

表2

采用该程序40分钟以内可以完成全部扩增。

5)结果分析：

5.1实验结束后保存检测数据文件。

5.2分析条件设置：根据分析后图像调节基线(Baseline)的Start值、Stop值以及阈值 (Threshold)的Value值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、end值可以在 5-20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，使仪器给出正确的结果。

(1)质量控制

阴性对照：FAM通道和VIC通道均无扩增曲线；

阳性对照：FAM通道和VIC通道均有扩增曲线，且Ct值均≤32；

以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

(2)结果判读

当FAM通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时可判定毛霉菌病病原体核酸阳性；

当FAM通道无扩增曲线，且Ct值显示为Undet或No Ct，VIC通道有扩增曲线且Ct值均≤35时可判定毛霉菌病病原体核酸阴性；

当FAM通道有扩增曲线，35＜Ct值≤40，VIC通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时建议重复一次实验，如果结果同上，可判定为毛霉菌病病原体阳性，如果无扩增，可判定为毛霉菌病病原体阴性；

当FAM通道和ROX通道均无扩增曲线，且Ct值显示为Undet或No Ct，实验无效、建议更换一批试剂重新实验。

其中，Ct值(cycle threshold，Ct)的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。

下面结合具体实施例，进一步详细陈述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

引物探针的设计

根据毛霉菌病病原体各个亚型的18s RNA序列，分析其基因的保守区域，并在这些保守区域设计多组特异性引物和探针序列。

在上述引物和探针的设计过程中，尽可能避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成等。通过对NCBI Blast在线数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 对上述设计的毛霉菌病病原体特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他致病菌或人类基因发生非特异结合和扩增。

在常规实时荧光定量PCR仪上进行多轮筛选和优化后，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。

表3毛霉菌病病原体特异性引物和探针序列

其中，V代表A或G或C；Y代表C或T；R代表A或G。

为了筛选最佳的靶标引物探针组合，本发明合成了以下代表株的靶基因的目标片段，并将这些序列插入克隆载体，通过单克隆筛选出纯化的含有阳性片段的质粒。

其中米根霉(Rhizopus oryzae)(KF698703.1)序列，命名为RHO(SEQ ID NO.19)：

CTAAAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTAT GCCGACTAGAGATTGGGCGTGTTTATTATGACTCGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGT TTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGG

其中同合根霉(Rhizopus homothallicus)(AB250175.1)序列，命名为RHH(SEQ IDNO.20)：

AAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCC GACTAGAGATTGGGCGTGTTTCTTATGACTCGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAA

其中小孢根霉(Rhizopus microsporus)(AF113438.1)序列，命名为RHM(SEQ IDNO.21)：

AAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCC GACTAGAGATTGGGCGTGTTTCTTTTGACTCGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAA

其中刺囊毛霉(Mucor spinosus)(JF723689.2)序列，命名为MUS(SEQ ID NO.22)：

AAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCC GACTAGAGATTGGGCTTGTTTATTATGACTAGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAA

其中暗褐色毛霉(Mucor fuscus)(JF723639.2)序列，命名为MUF(SEQ ID NO.23)：

AAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCC GACTAGAGATTGGGCCTGTTTATTATGACTGGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAA

其中横梗霉(lichtheimia ramosa)(JQ775425.1)序列，命名为LIR(SEQ IDNO.24)：

AAGTTGAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACGATGCC GACTAGAGATCGGGCTTGGCTATTAAGGCTTGCTCGGGATCTTAGCGAAAGCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTACGGCTCGCAA

其中微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(AF113434.1)序列，命名为RHZM(SEQ IDNO.25)：

AAGGTTAAGGGATCGAAAACGATTAGATACCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACGATGC CGACTAGAGATCAGGCTTGATCCTTTGGACAAGCTTGGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGCTCTGGGGGGAGTATGGACGCAAG

其中雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)(AH009069.2)序列，命名为CUE(SEQ ID NO.26)：

AAGTTGAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCC GACTAGCGATTGGATCCTCGCCACTGGCAGGATTCAGCAGCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAAG

其中雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)(AF113411.1)序列，命名为APE(SEQID NO.27)：

AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGC CGACTAGGGATCGGGTTTGCTCTATGGCTTACTCGGAACCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGCTCTGGGGGGAGTATGGTACGCAAGA

采用下列扩增体系配制三组引物探针组合，对比三组引物探针组合的扩增效率。

表4引物探针组合单重扩增体系表

注：“单重”的意思是同一管加6个探针，但是只放一种阳性质粒。

模板采用上述构建的9种毛霉菌代表株目标片段阳性质粒梯度稀释产物，选择其中浓度为1×10⁷copies/mL、1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL三个梯度，分别标记为A7、A6、A5。

扩增程序采用下表5所示。

表5常规荧光定量PCR仪-ABI7500扩增程序

扩增结果如下表6所示：

表6第1组引物探针组合在ABI7500扩增数据

表7第2组引物探针组合在ABI7500扩增数据

表8第3组引物探针组合在ABI7500扩增数据

结果参见附图，其中，图1示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增米根霉(Rhizopus oryzae)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图2示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增同合根霉(Rhizopus homothallicus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图3示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增小孢根霉(Rhizopus microsporus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图4示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增刺囊毛霉(Mucor spinosus)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图5示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增暗褐色毛霉(Mucor fuscus) 阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图6示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增横梗霉(lichtheimia ramosa)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图7示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增微小根毛霉(Rhizomucor pusillus) 阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图8示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增雅致小克银汉霉 (Cunninghamella elegans)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图9示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)阳性质粒的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；图10示出了引物筛选-三组引物探针组合扩增黑曲霉(Aspergillus niger)样本核酸；健康人唾液样本核酸和阴性对照的扩增曲线图(上：第1组引物探针数据；中：第2组引物探针数据；下：第3组引物探针数据)；从上述结果可以看出：第二组引物探针在相同体系下扩增相同模板时性能表现较差，Ct值相对于另外两组有一定的滞后；第一、三组引物探针在相同体系下扩增相同模板时性能表现较好。

实施例2

灵敏度检测

合成构建含有目的片段的质粒样本(9种含有毛霉菌阳性片段的质粒)，通过浓度测定后将相关的阳性质粒稀释到合适的浓度后再进行2倍倍比稀释，浓度分别为1000copies/mL、 500copies/mL、250copies/mL。采用上述确定的检测体系、产品形式以及循环参数对上述构建的阳性质粒进行检测，部分结果可以参考图11，分别针对构建的9个毛霉菌菌种的浓度为 500copies/mL阳性质粒进行确认，结果参考图12a、图12b和图12c。结果表明，本发明的检测方法具有较高灵敏度，灵敏度能够达到500copies/mL。

实施例3

特异性检测(参见实施例1，采用ABI7500设备完成)

本发明采用大肠杆菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇艺变形杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽假食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、毕赤酵母等作为特异性样本进行检测。

检测结果如图13所示，检测特异性阳性质粒(大肠杆菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇艺变形杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽假食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、毕赤酵母)。检测结果均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性良好。

实施例4

重复性检测

本发明选取浓度为1.0E+05copies/mL、500copies/mL的阳性质粒样本(含有9种毛霉菌阳性片段的质粒)进行检测，采用上述确定的检测体系和循环参数，进行重复测试。

检测结果参考图14，结果表明本发明的试剂盒和检测方法重复性较好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东润鹏生物技术有限公司

<120> 检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法

<130> PN168429FPSW

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1

<220>

<221> primer_bind

<222> (15)..(15)

<223> v代表a或g或c

<400> 1

agtcataata aacavgccca a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2

<400> 2

agtcaaaaga aacacgccca a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3

<400> 3

agccttaata gccaagccc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4

<400> 4

tgtccaaagg atcaagcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5

<400> 5

aagccataga gcaaaccc 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(17)

<223> 毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6

<400> 6

ctgccagtgg cgaggac 17

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> 毛霉菌病病原体正向引物1

<400> 7

accacaaact atgccgacta gagat 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<223> 毛霉菌病病原体反向引物1

<400> 8

cccaaaaact ttactttcgc taag 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<223> 毛霉菌病病原体正向引物2

<400> 9

gggatcgaag acgattagat accg 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> 毛霉菌病病原体反向引物2

<400> 10

cagaacccaa aaactttact ttcgc 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<223> 引物MuF-1

<400> 11

gggatcgaag acgattagat accg 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> 引物MuR-1

<400> 12

cagaacccaa aaactttact ttcgc 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> 探针MucP-1

<220>

<221> primer_bind

<222> (15)..(15)

<223> y代表c或t

<400> 13

tgagcgagtc ataayaaaca cgcccaa 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> 探针MucP-3

<220>

<221> primer_bind

<222> (6)..(6)

<223> y代表c或t

<220>

<221> primer_bind

<222> (15)..(15)

<223> r代表a或g

<400> 14

tgagcyagtc ataataaaca rgcccaa 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> 探针MucP-3

<400> 15

ccgagcaagc cttaatagcc aagcc 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> 探针MucP-4

<400> 16

cttgtccaaa ggatcaagcc tgatctc 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<223> 探针MucP-5

<400> 17

tgaatcctgc cagtggcgag gatc 24

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> 探针MucP-6

<400> 18

aaggttccga gtaagccata gagcaaa 27

<210> 19

<211> 142

<212> DNA

<213> Rhizopus oryzae

<400> 19

ctaaagttaa gggatcgaag acgattagat accgtcgtag tcttaaccac aaactatgcc 60

gactagagat tgggcgtgtt tattatgact cgctcagcat cttagcgaaa gtaaagtttt 120

tgggttctgg ggggagtatg gg 142

<210> 20

<211> 145

<212> DNA

<213> rhizopus homothallicus

<400> 20

aagttaaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 60

tagagattgg gcgtgtttct tatgactcgc tcagcatctt agcgaaagta aagtttttgg 120

gttctggggg gagtatggga cgcaa 145

<210> 21

<211> 145

<212> DNA

<213> Rhizopus microsporus

<400> 21

aagttaaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 60

tagagattgg gcgtgtttct tttgactcgc tcagcatctt agcgaaagta aagtttttgg 120

gttctggggg gagtatggga cgcaa 145

<210> 22

<211> 145

<212> DNA

<213> mucor spinosus

<400> 22

aagttaaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 60

tagagattgg gcttgtttat tatgactagc tcagcatctt agcgaaagta aagtttttgg 120

gttctggggg gagtatggga cgcaa 145

<210> 23

<211> 145

<212> DNA

<213> mucor fuscus

<400> 23

aagttaaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 60

tagagattgg gcctgtttat tatgactggc tcagcatctt agcgaaagta aagtttttgg 120

gttctggggg gagtatggga cgcaa 145

<210> 24

<211> 145

<212> DNA

<213> lichtheimia ramosa

<400> 24

aagttgaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa cgatgccgac 60

tagagatcgg gcttggctat taaggcttgc tcgggatctt agcgaaagca aagtttttgg 120

gttctggggg gagtacggct cgcaa 145

<210> 25

<211> 146

<212> DNA

<213> Rhizomucor pusillus

<400> 25

aaggttaagg gatcgaaaac gattagatac cgttgtagtc ttaacagtaa acgatgccga 60

ctagagatca ggcttgatcc tttggacaag cttggcatct tagcgaaagt aaagtttttg 120

ggctctgggg ggagtatgga cgcaag 146

<210> 26

<211> 146

<212> DNA

<213> Cunninghamella elegans

<400> 26

aagttgaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 60

tagcgattgg atcctcgcca ctggcaggat tcagcagctt agcgaaagta aagtttttgg 120

gttctggggg gagtatggga cgcaag 146

<210> 27

<211> 146

<212> DNA

<213> apophysomyces elegans

<400> 27

aaagttaggg gatcgaagac gattagatac cgtcgtagtc ctaaccataa actatgccga 60

ctagggatcg ggtttgctct atggcttact cggaacctta gcgaaagtaa agtttttggg 120

ctctgggggg agtatggtac gcaaga 146

Claims

1.一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，所述毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针：

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1 ：5'-AGTCATAATAAACAVGCCCAA-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2：5'-AGTCAAAAGAAACACGCCCAA-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3：5'-AGCCTTAATAGCCAAGCCC-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4：5'-TGTCCAAAGGATCAAGCC-3'；

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5：5'-AAGCCATAGAGCAAACCC-3'；和

毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6：5'-CTGCCAGTGGCGAGGAC-3'；

所述试剂盒还包括：

毛霉菌病病原体正向引物1：5'-ACCACAAACTATGCCGACTAGAGAT-3'和毛霉菌病病原体反向引物1：5'-CCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAG-3'；或

毛霉菌病病原体正向引物2：5'- GGGATCGAAGACGATTAGATACCG-3'和毛霉菌病病原体反向引物2：5'- CAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGC-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述毛霉菌病病原体寡核苷酸探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团和/或MGB。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液和酶制剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dATPs、dUTPs、dGTPs和dCTPs四种核苷酸及含有镁离子的缓冲液。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶制剂为包含有热启动的Taq DNA聚合酶和UDG酶。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品为阳性质控品。

10.一种检测毛霉菌病病原体的方法，所述方法为非疾病诊断目的，其特征在于，包括采用如权利要求1至9中任一项所述的检测毛霉菌病病原体的试剂盒进行荧光PCR检测，包括以下步骤：

从样本中提取DNA，得到样本DNA；

将所述样本DNA、毛霉菌病病原体寡核苷酸探针加入到复溶液复溶的酶制剂中制得PCR反应体系进行荧光PCR扩增，检测毛霉菌病病原体；

所述毛霉菌病病原体为根霉属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucor spp)、横梗霉属(Lichtheimia spp)、根毛霉属（Rhizomucor spp）、鳞质霉属（Apophysomyces spp）、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)以及伞状犁头霉（absidia corymbifera）。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的程序为：93~97℃，1~3min；93~97℃，3~7S和58~62℃，18~22S，45个循环。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述毛霉菌病病原体寡核苷酸探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，PCR扩增采用的PCR仪设定包括信号收集：FAM通道信号收集和VIC通道信号收集。