CN112980997A - 侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统 - Google Patents

侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统，所述方法包括：对已获取的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因；利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。利用本发明所设计的引物和探针，可以提高侵袭性曲霉病病原菌检测的灵敏度和特异度、可检测包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉在内的多种菌种，适用于BALF及FFPE组织、渗出液(脓液)等不同临床样本。

Description

侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统
技术领域
本发明涉及一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法和检测系统。
背景技术
近年来，侵袭性毛霉病患病率不断增加，病程进展迅速，死亡率可达40％-80％。致病菌种最常见为根霉属、毛霉属、横梗霉属及根毛霉属。
早期诊断有助于精准治疗，改善预后。然而临床常用的侵袭性毛霉病病原菌检测方法灵敏度及特异度低，难以快速准确地检测不同临床样本中的致病菌种。
已有的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)方法诊断毛霉病的研究中，靶基因设立在18s、28s、线粒体基因，毛霉目菌种间基因差异较大，难以设计通用引物。
发明内容
本发明实施例提供一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统，以至少解决因毛霉目菌种间基因差异较大，通用引物设计困难的问题。
本发明实施例提供一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针，所述引物和探针包括基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针中的至少一个，其中：所述基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：正向引物：5’-CTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAA-3’；反向引物：5’-ACTACGGACGTTTTAACTGCAACA-3’；探针：FAM-ACGAGGATCAATTGGAGG-MGB；
所述基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-TCAA/GAGTTCTTTTCAA/TCTTTCCCT-3’；
探针：FAM-CGAA/GAA/GACCGATAGCA/GAACAAGTACCGT-BHQ1。
进一步地，所述引物和探针还包括用于检测侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括以下至少一个：
少根根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-CGACCCATTACCACATAAACAAATG-3’；
探针：VIC-TAGAGTACGCCTGCTTC-MGB；
多枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GTCGTCAAGCTCGCGAAAGT-3’；
反向引物：5’-GCAATTTAAGACGCCGGTATTC-3’；
探针：FAM-TTGTCTTACAACATCAAGC-MGB；
伞枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TTAAGGTTCCTCACAGTTATGTGCAA-3’；
反向引物：5’-CCCTAAGGCCAGCCCATT-3’；
探针：TAMRA-TTGGGTCACCTTGGTTG-MGB；
微小根毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCTTTGGTGTACTATCAGGCTATTT-3’；
反向引物：5’-GGCTTCCGCAAAGGTCTCTT-3’；
探针：FAM-CGGCCAACTTTCA-MGB；
总状毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CATCGAGTCTTTGAACGCAACT-3’；
反向引物：5’-GATCGAGAGGCCCCCAATAA-3’；
探针：FAM-TCCAATGAGCACGCCTG-MGB；
小孢根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3’；
反向引物：5’-CAAACAATACCAGGAGGAGAGGAT-3’；
探针：FAM-CATTAACTAAATGTATCGGCACTT-MGB；
匍枝根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-AGGGTTATAAAGGCGGTTAATGG-3’；
反向引物：5’-TCGCACTTTGCTACGTTCTTCA-3’；
探针：FAM-ACAACTTTTAACAACGGATCT-MGB；
不规则毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ATATGTGGATGCCGACGAAGA-3’；
反向引物：5’-GCACCGTATTGAGCGGTCAT-3’；
探针：FAM-AAACTGCCATGATTTGTATG-MGB。
本发明实施例还提供一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的实现方法，所述方法包括：对已获取的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因；利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
进一步地，所述利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针包括：对于每个保守基因，通过在侵袭性毛霉病病原菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定侵袭性毛霉病病原菌的保守片段以及每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段；利用从所述保守基因中得到的侵袭性毛霉病病原菌的保守片段，设计用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段，设计用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针；对已设计的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
其中，所述侵袭性毛霉病病原菌包括少根根霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、总状毛霉、小孢根霉、匍枝根霉、不规则毛霉中的两个或以上。
其中，所述用于特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针是上述的基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针中的至少一个。
其中，所述用于特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针包括上述的少根根霉的种特异性引物和探针、多枝横梗霉的种特异性引物和探针、伞枝横梗霉的种特异性引物和探针、微小根毛霉的种特异性引物和探针、总状毛霉的种特异性引物和探针、小孢根霉的种特异性引物和探针、匍枝根霉的种特异性引物和探针、不规则毛霉的种特异性引物和探针中的至少一个。
本发明实施例还提供一种侵袭性毛霉病病原菌的检测系统，所述系统包括：第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的如前述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如前述的通用引物和探针的第一混合物；检测装置，用于对所述待测样本DNA与如前述的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在侵袭性毛霉病病原菌。
进一步地，所述系统还包括：第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的如前述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如前述的种特异性引物和探针的第二混合物；相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与如前述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在相应地的侵袭性毛霉病病原菌。
本发明实施例具有如下有益效果：
1、本发明实施例提供的特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针，可以用于准确鉴定是否存在毛霉病病原菌；
2、本发明实施例提供的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，可以用于准确鉴定毛霉病病原菌种类；
3、本发明实施例的检测系统采用侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各的菌种种特异性引物和探针进行双重验证，可提高毛霉病诊断准确性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的实现方法的示意性流程框图；
图2是本发明实施例提供的侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的设计和验证的示意性流程框图；
图3a是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的WB-28检测少根根霉的比较结果图；
图3b是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测匍枝根霉的示意图；
图3c是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测不规则毛霉的比较结果图；
图3d是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测微小根毛霉的示意图；
图3e是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测总状毛霉的比较结果图；
图3f是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测小孢根霉的比较结果图；
图3g是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测多枝横梗霉的比较结果图；
图3h是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的的WB-28检测伞枝横梗霉的比较结果图；
图4a是采用本发明实施例提供的Muc-18s和采用已有文献提供的WB-28在菌株间交叉反应的比较结果图；
图4b是采用本发明实施例提供的Muc-28s和采用已有文献提供的WB-28在菌株间交叉反应的比较结果图；
图5是本发明少根根霉引物及探针(ory与Wenxian-ory)菌株水平比较结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明，应当理解，以下所说明的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
为便于说明，现对本发明涉及的常用术语进行说明。引物指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。通用引物是可与多种病原菌的DNA模板链结合的引物。种特异性引物：即该引物对某种病原菌特异，只能与该种病原菌的DNA链模板特异结合，不结合其他病原菌的DNA。探针是一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。保守片段指在进化过程中基本保持不变的DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核酸序列(如RNA或DNA序列)，蛋白质序列，蛋白质结构或糖类中的序列，这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。靶基因即目的基因(gene ofinterest)，也称靶标基因，是从保守基因中选取的最有代表性的基因，是在实验中研究或操纵的特定基因。
图1是本发明实施例提供的一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的实现方法的示意性流程框图，如图1所示，上述方法可以包括：
步骤1：对已获取的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因。
步骤2：利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
已有研究中利用既往文献报道的某个DNA片段(长度大约是几百bp)，设计引物和探针，随着基因组数据逐渐健全，本发明利用全基因组数据(长度大约是30-50Mb)，设计引物和探针，数据庞大，得到的结果更加可靠。
所述步骤2的利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针包括：
步骤21：对于每个保守基因，通过在侵袭性毛霉病病原菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定侵袭性毛霉病病原菌目水平的保守片段以及每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段。
步骤22：利用从所述保守基因中得到的侵袭性毛霉病病原菌的保守片段，设计用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段，设计用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针。
步骤23：对已设计的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
其中，所述侵袭性毛霉病病原菌种包括少根根霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、总状毛霉、小孢根霉、匍枝根霉、不规则毛霉中的两个或以上。
以所述侵袭性毛霉病病原菌种包括上述8种毛霉为例。
通过比对8种毛霉基因组数据，找到保守片段，再设计通用引物和探针，该通用引物和探针基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原的通用引物和探针和基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针中的至少一个。其中：
所述基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAA-3’；
反向引物：5’-ACTACGGACGTTTTAACTGCAACA-3’；
探针：FAM-ACGAGGATCAATTGGAGG-MGB；
所述基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-TCAA/GAGTTCTTTTCAA/TCTTTCCCT-3’；
探针：FAM-CGAA/GAA/GACCGATAGCA/GAACAAGTACCGT-BHQ1。
通过将毛霉目中不同菌种之间进行比较，找到每种毛霉与其他种类毛霉之间的碱基不同的片段，然后再设计种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括：少根根霉的种特异性引物和探针、多枝横梗霉的种特异性引物和探针、伞枝横梗霉的种特异性引物和探针、微小根毛霉的种特异性引物和探针、总状毛霉的种特异性引物和探针、小孢根霉的种特异性引物和探针、匍枝根霉的种特异性引物和探针、不规则毛霉的种特异性引物和探针中的两个或以上。其中：
少根根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-CGACCCATTACCACATAAACAAATG-3’；
探针：VIC-tagagtacgcctgcttc-MGB；
多枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GTCGTCAAGCTCGCGAAAGT-3’；
反向引物：5’-GCAATTTAAGACGCCGGTATTC-3’；
探针：FAM-TTGTCTTACAACATCAAGC-MGB；
伞枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TTAAGGTTCCTCACAGTTATGTGCAA-3’；
反向引物：5’-CCCTAAGGCCAGCCCATT-3’；
探针：TAMRA-TTGGGTCACCTTGGTTG-MGB；
微小根毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCTTTGGTGTACTATCAGGCTATTT-3’；
反向引物：5’-GGCTTCCGCAAAGGTCTCTT-3’；
探针：FAM-CGGCCAACTTTCA-MGB；
总状毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CATCGAGTCTTTGAACGCAACT-3’；
反向引物：5’-GATCGAGAGGCCCCCAATAA-3’；
探针：FAM-TCCAATGAGCACGCCTG-MGB；
小孢根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3’；
反向引物：5’-CAAACAATACCAGGAGGAGAGGAT-3’；
探针：FAM-CATTAACTAAATGTATCGGCACTT-MGB。
匍枝根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-AGGGTTATAAAGGCGGTTAATGG-3’；
反向引物：5’-TCGCACTTTGCTACGTTCTTCA-3’；
探针：FAM-ACAACTTTTAACAACGGATCT-MGB；
不规则毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ATATGTGGATGCCGACGAAGA-3’；
反向引物：5’-GCACCGTATTGAGCGGTCAT-3’；
探针：FAM-AAACTGCCATGATTTGTATG-MGB。
在保守基因(或靶基因)中找到目水平的保守片段和种水平的种特异性片段，进而设计相应的引物及探针。进一步地，本发明的通用引物在18s及28s区域设计，所有毛霉目菌种均可在此区域找到保守序列，因此可以检测多种毛霉目真菌，本发明的种特异性引物，是某种毛霉目真菌(比如总状毛霉)所特有，其他毛霉(如伞枝横梗霉等)不能扩增出来。相应引物的探针都有其对应的靶基因位点。
通过本发明实施例提供的特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针，可以准确鉴定是否存在毛霉目真菌，通过本发明实施例提供的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，可以准确鉴定毛霉目真菌种类，另外，同时采用侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，可以进行双重验证，提高毛霉目真菌的诊断准确性。
下面对侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的实现方法进行详细说明。
第一步、对北京大学真菌和真菌病研究中心保藏的常见致病性毛霉目真菌菌株转种培养后，提取DNA，采用常用ITS区域引物用PCR仪进行扩增，利用测序仪器对扩增产物进行Sanger测序，得到基因序列，所得到的基因序列均已上传NCBI数据库。
第二步、结合NCBI数据库已报道毛霉目相应菌种(例如总状毛霉、不规则毛霉、微小根毛霉、少根根霉、匍枝根霉、微小根毛霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉)的全基因组数据，(每个菌种的基因组大小约为40-50Mb)，在设计毛霉通用引物时，选择上述8种毛霉的不同菌株基因组序列进行数次自动比对，同时人工逐个碱基比对，查找相应菌种的保守基因(本发明中查找到8种毛霉的总共7个保守基因)，即种内基因的相似区域。
第三步、选取上述所得保守基因，在种间及种内(选择10株及以上菌株)序列中逐个碱基进行比对，筛选获得保守片段和种特异性片段以用于扩增。
第四步、利用所筛选保守片段设计通用引物及探针，利用所筛选的种特异性片段设计种特异性引物及探针，具体可以采用NCBI-blast设计。
通过重复上述第三步和第四步，本实施例可设计毛霉目真菌通用的引物及探针4组，各菌种的种水平引物及探针均2组以上。
第五步、在NCBI数据库中比对基于已设计的引物所扩增的DNA序列，确保引物特异性。
结果显示本发明所设计引物及探针的特异性均达到100％，即毛霉目通用引物仅可检测到不同种毛霉，种水平引物及探针未检测到其他病原真菌。
第六步、选择6种曲霉(共12株)、8种毛霉(共16株)、2镰刀菌(共6株)、2种赛多孢(共4株)、5种念珠菌(共10株)、3种隐球菌(共6株)接种至沙氏培养基培养3-7天。制备一定浓度的菌悬液，提取DNA，Nanodrop2000超微量分光光度计定量。倍比稀释验证所设计的引物及探针的最低检测限及种间有无交叉反应。重复多次后，例如2-3次，最终确定引物及探针如表1所示。
表1.引物及探针的序列信息表.
Figure BDA0003039310160000081
Figure BDA0003039310160000091
本发明对毛霉目菌株进行测序，结合Ensemble及NCBI数据库查找的相应菌种的基因组序列。逐个碱基比对，查找包含总状毛霉、不规则毛霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、少根根霉、匍枝根霉、小孢根霉、微小根毛霉在内的菌株间的保守序列，在18S rRNA区域找到靶基因，设计引物及探针。引物扩增片段在NCBI数据库中Blast比对,均为毛霉菌种。同样方法可以应用于5.8S rRNA-ITS2、ITS1-5.8S rRNA、18S rRNA-ITS1、ITS1以设计种水平特异性引物及探针。
如图2所示，在设计引物及探针后，对已设计的引物和探针进行菌株水平验证，具体如下：
选择北京大学真菌和真菌病研究中心保藏的烟曲霉、土曲霉、黑曲霉、黄曲霉、聚多曲霉、构巢曲霉、总状毛霉、不规则毛霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、少根根霉、匍枝根霉、小孢根霉、微小根毛霉、新生隐球菌及格特隐球菌进行验证。毛霉菌种计数孢子，考虑提取效率为100％，倍比稀释检测引物及探针可检测最低DNA浓度及稳定性,其他菌株最高浓度检测菌株间有无交叉反应。结果如表2所示。
表2.菌株水平验证结果表.
引物名称 检测低限 毛霉种间、曲霉、镰刀菌、赛多孢有无交叉反应
Muc-18s 32.4fg 无
Muc-28s 32.4fg 无
Ory 32.4fg 无
Pus 7.8fg 无
Sto1 0.66pg 无
Ram 3.6fg 无
Cor 6.6fg 无
Muc 1.13pg 无
Mic 6.2fg 无
Irre1 0.13ng 无
下面将本发明的毛霉通用引物和探针Muc-18s与已有文献(如Springer J,Goldenberger D,Schmidt F,Weisser M,Wehrle-Wieland E,Einsele H,FreiR,
Figure BDA0003039310160000101
J.Development and application of two independent real-time PCR assays todetect clinically relevant Mucorales species.J Med Microbiol.2016Mar；65(3):227-234.doi:10.1099/jmm.0.000218.Epub 2016Jan 7.PMID:26743820.)中的毛霉通用引物和探针WB-28进行比较，比较结果参见表3。
表3.Muc-18s和WB-28的检测结果对比表.
Figure BDA0003039310160000102
Figure BDA0003039310160000111
从表3可以看出，在灵敏度方面，检测相同浓度菌株DNA，以Muc-18s为例，在检测多种常见的毛霉目真菌时的CT值更低，更为灵敏，可检测更低限度菌株DNA浓度，且稳定性较好。具体如附图3a-3g所示。
另外，在特异性方面，将本发明的Muc-18s引物及探针与上述文献的WB-28引物和探针在菌株间交叉反应的比较，如图4a所示，WB-28引物及探针与念珠菌及曲霉均存在交叉反应，特异性较差，而采用本发明的Muc-18s引物及探针检测发现,与念珠菌及曲霉均无交叉反应，特异性较好。将本发明的Muc-28s引物及探针与上述文献的WB-28引物和探针在菌株间交叉反应的比较，如图4b所示，WB-28引物及探针与念珠菌及曲霉均存在交叉反应，特异性较差，而采用本发明的Muc-28s引物及探针检测发现，与念珠菌及曲霉均无交叉反应，特异性较好。
将本发明的少根根霉的引物和探针Ory及已有文献(Ibrahim AS,Bowman JC,Avanessian V,et al.Caspofungin inhibits Rhizopus oryzae1,3-beta-D-glucansynthase,lowers burden in brain measured by quantitative PCR,and improvessurvival at a low but not a high dose during murine disseminatedzygomycosis.Antimicrob Agents Chemother.2005Feb；49(2):721-7)中的少根根霉的引物和探针Wenxian-ory进行比较，如图5所示，本发明所设计的引物及探针Ory可检测更低浓度DNA，检测相同浓度菌株DNA时，CT值更低，说明敏感性更强；该已有文献中少根根霉引物及探针Wenxian-ory可检测到烟曲霉、黑曲霉及念珠菌、隐球菌，菌株间存在交叉反应，说明特异性不好。
需要指出的是，已有技术中没有匍枝根霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、不规则毛霉、总状毛霉等菌种的种特异性引物和探针。本发明基于基因组水平设计了上述毛霉菌种的引物和探针，实现毛霉目真菌检测鉴定至种水平，有利于为临床治疗选择方向。
将本发明所设计的引物及探针的灵敏度及特异度与传统PCR及已有文献中引物及探针的灵敏度及特异度进行比较，如表4所示。
表4.灵敏度及特异度的对比结果表.
Figure BDA0003039310160000112
Figure BDA0003039310160000121
从表4可以看出，采用本发明的引物及探针进行检测时，灵敏度及特异度更佳。
如上所述，本发明能够提高侵袭性毛霉病病原菌诊断的灵敏度及特异度，快速精准的鉴定低病原菌丰度样本中的致病菌。
本发明基于基因组水平设计引物和探针，更加精准，且经过菌株水平验证，具有较高稳定性，可检测低至32.4fg(即飞克，重量单位)水平的DNA浓度。另外，本发明所设计引物及探针包含目水平及种水平，可进行双重验证，提高诊断准确性，适用于不同临床样本，例如BALF及FFPE组织、渗出液(脓液)等，灵敏度较高，可提示临床完善相关病原学诊断，利于早期诊断治疗。
如图2所示，在进行菌株水平验证后，进行临床样本检测，具体如下：
1、对100例半乳甘露聚糖试验(GM试验)检测的肺泡灌洗液(BALF)进行检测，其中GM阳性样本52例，GM阴性标本48例。
真菌培养：检出率为0；
本发明所设计的通用引物及探针(即Muc-18s或Muc-28s)的毛霉目真菌检出率为25.0％(25/100)，其中，GM+组中毛霉目的检出率明显高于GM-组(34.60％vs 10.40％)。
2、对确诊侵袭性真菌病患者的FFPE组织进行检测，应用激光捕获显微切割技术精准捕获确诊侵袭性真菌病患者FFPE组织中的病原真菌，基于本发明设计的引物和探针进行qPCR系统检测病原真菌。共检测12例侵袭性真菌病样本，病理科病理鉴定(即通过对组织病理特殊染色后，根据组织中的真菌形态来鉴定的)结果为：均未鉴定至种水平，1例诊断为可疑隐球菌感染，4例诊断为曲霉属，7例诊断为可见真菌菌团，无毛霉诊断。本发明通过所设计的通用引物及探针(即Muc-18s或Muc-28s)，采用qPCR系统诊断结果为：毛霉DNA的检出率为25％，其中2例为Cunninghamella elegans(雅致小克银汉霉，属于毛霉目真菌的一种)，显然，相对于病理鉴定，提高了临床样本中毛霉目真菌的检出率。
本发明在已报道的靶基因外，获取新的靶基因，设计针对毛霉目及临床常见致病毛霉菌的种水平特异性引物及探针。菌株水平灵敏度较好，可检测DNA浓度为fg水平的样本；菌株间无交叉反应；在临床样本中应用，具有较高的灵敏度，适用于肺泡灌洗液、渗出液、组织样本等不同临床样本。
本发明实施例还提供了一种侵袭性毛霉病病原菌的检测系统，所述系统可以包括：
第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的前述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与前述的通用引物和探针的第一混合物；
检测装置，用于对所述待测样本DNA与前述的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在侵袭性毛霉病病原菌。
先通过人工方式生成通用引物及探针，在生成的探针上标记可指示是否有毛霉的特定荧光；然后将待测样本DNA与已进行荧光标记的通用引物及探针混合后，将得到的第一混合物提供给检测装置，从而检测出待测样本中是否存在侵袭性毛霉病病原菌。
进一步地，所述系统还可以包括：
第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的前述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与前述的种特异性引物和探针的第二混合物；
相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与前述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在相应地的侵袭性毛霉病病原菌。
在检测出待测样本中存在侵袭性毛霉病病原菌的情况下，以总状毛霉为例，先通过人工方式生成总状毛霉的引物及探针，在生成的探针上标记可指示是否有总状毛霉的特定荧光；然后将待测样本DAN与已进行荧光标记的总状毛霉的引物及探针混合后提供给检测装置，从而检测出待测样本中的侵袭性毛霉病病原菌的种类。
需要说明的是，目水平检测可以和种水平检测同时进行，也可以分开进行，同样地，多种毛霉的种水平检测可以同时进行，也可以分开进行。
上述检测装置可以是qPCR检测装置，该PCR检测装置对输入的由待测样本DNA和本发明的引物及探针组成的混合物进行检测，可快速、准确检测不同临床样本中是否具有毛霉以及毛霉目菌种，指导临床治疗，利于早期侵袭性真菌病精准治疗，改善预后。
具体实施过程如下：
首先，对本发明设计的通用引物及探针，种特异性引物及探针进行人工合成，并在探针的两端标记特定的荧光，不同种的探针，标记的荧光不同，合成后将引物和探针，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量其浓度后备用；
其次，临床样本取材后进行总DNA提取，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量样本的核酸浓度，定量备用；
最后，将上述合成的引物及探针与临床样本DNA进行等比例加样混合后，上机，通过qPCR仪器检测，该仪器可以通过可视化的信号改变来实时检测样本反应情况。
结果判读：如果临床样本含有毛霉病病原菌，会和设计的引物及探针结合，产生不同颜色的荧光信号，该信号在qPCR仪上的显示是不同颜色的指数扩增曲线及相应的Ct值，并通过阴性对照和阳性对照品的曲线和Ct值来质控每次的检测准确度，再通过待测样品的曲线颜色和Ct值来判定待测样本中的病原菌种类。
所述Ct值是指每个PCR反应管内荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数(cycle)。
本发明实施例提供了一种适用于不同临床样本的qPCR检测系统，能够提高毛霉目真菌检测的灵敏度及特异度，可直接用于疑诊侵袭性毛霉病患者样本的病原真菌从目水平至种水平的快速检测，利于早期精准治疗，改善预后，适用于肺泡灌洗液、组织样本、渗出液等不同临床样本。
尽管上文对本发明进行了详细说明，但是本发明不限于此，本技术领域技术人员可以根据本发明的原理进行各种修改。因此，凡按照本发明原理所作的修改，都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针中的至少一个，其中：
所述基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAA-3’；
反向引物：5’-ACTACGGACGTTTTAACTGCAACA-3’；
探针：FAM-ACGAGGATCAATTGGAGG-MGB；
所述基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-TCAA/GAGTTCTTTTCAA/TCTTTCCCT-3’；
探针：FAM-CGAA/GAA/GACCGATAGCA/GAACAAGTACCGT-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针还包括用于检测侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括以下至少一个：
少根根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA-3’；
反向引物：5’-CGACCCATTACCACATAAACAAATG-3’；
探针：VIC-TAGAGTACGCCTGCTTC-MGB；
多枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GTCGTCAAGCTCGCGAAAGT-3’；
反向引物：5’-GCAATTTAAGACGCCGGTATTC-3’；
探针：FAM-TTGTCTTACAACATCAAGC-MGB；
伞枝横梗霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TTAAGGTTCCTCACAGTTATGTGCAA-3’；
反向引物：5’-CCCTAAGGCCAGCCCATT-3’；
探针：TAMRA-TTGGGTCACCTTGGTTG-MGB；
微小根毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCTTTGGTGTACTATCAGGCTATTT-3’；
反向引物：5’-GGCTTCCGCAAAGGTCTCTT-3’；
探针：FAM-CGGCCAACTTTCA-MGB；
总状毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CATCGAGTCTTTGAACGCAACT-3’；
反向引物：5’-GATCGAGAGGCCCCCAATAA-3’；
探针：FAM-TCCAATGAGCACGCCTG-MGB；
小孢根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3’；
反向引物：5’-CAAACAATACCAGGAGGAGAGGAT-3’；
探针：FAM-CATTAACTAAATGTATCGGCACTT-MGB；
匍枝根霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-AGGGTTATAAAGGCGGTTAATGG-3’；
反向引物：5’-TCGCACTTTGCTACGTTCTTCA-3’；
探针：FAM-ACAACTTTTAACAACGGATCT-MGB；
不规则毛霉的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ATATGTGGATGCCGACGAAGA-3’；
反向引物：5’-GCACCGTATTGAGCGGTCAT-3’；
探针：FAM-AAACTGCCATGATTTGTATG-MGB。
3.一种侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针的实现方法，其特征在于，所述方法包括：
对已获取的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因；
利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用通过全基因组数据比对得到的侵袭性毛霉病病原菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针包括：
对于每个保守基因，通过在侵袭性毛霉病病原菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定侵袭性毛霉病病原菌的保守片段以及每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段；
利用从所述保守基因中得到的侵袭性毛霉病病原菌的保守片段，设计用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性片段，设计用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针；
对已设计的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和用于检测每种侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针以及侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述侵袭性毛霉病病原菌包括少根根霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、总状毛霉、小孢根霉、匍枝根霉、不规则毛霉中的两个或以上。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述用于特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针是权利要求1所述的基于18srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针和基于28srRNA的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针中的至少一个。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述用于特异性满足要求的侵袭性毛霉病病原菌各菌种的种特异性引物和探针包括权利要求2所述的少根根霉的种特异性引物和探针、多枝横梗霉的种特异性引物和探针、伞枝横梗霉的种特异性引物和探针、微小根毛霉的种特异性引物和探针、总状毛霉的种特异性引物和探针、小孢根霉的种特异性引物和探针、匍枝根霉的种特异性引物和探针、不规则毛霉的种特异性引物和探针中的至少一个。
8.一种侵袭性毛霉病病原菌的检测系统，其特征在于，所述系统包括：
第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的如权利要求1所述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如权利要求1所述的通用引物和探针的第一混合物；
检测装置，用于对所述待测样本DNA与如权利要求1所述的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在侵袭性毛霉病病原菌。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述系统还包括：
第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的如权利要求2所述的用于检测侵袭性毛霉病病原菌的种特异性引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如权利要求2所述的种特异性引物和探针的第二混合物；
相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与如权利要求2所述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定所述待测样本中是否存在相应地的侵袭性毛霉病病原菌。
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