CN113736901A - 一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒。本发明通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和探针，结合多重qPCR反应实现了对常见毛霉菌的检测，检出率高达100%，特异性为100%。本发明公开的检测方法及试剂盒可以用于临床检测常见毛霉菌。

Description

一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及病原微生物检测领域，尤其涉及到一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒。
背景技术
毛霉菌病是一种新兴的由毛霉菌丝状真菌引起的严重感染性疾病，其进展迅速，死亡率高，主要影响免疫功能低下的患者和糖尿病患者。在真菌感染中，毛霉菌发病率占8.3%-13%，仅次于假丝酵母菌和曲霉菌，位居第3位。近年来，毛霉病在高危人群的发病率有所上升，在免疫缺陷患者常见深部真菌感染中占第二位，在恶性肿瘤及器官移植者中发病率约为1%。据报道，在西方国家中，美国和法国在2000年至2010年期间每年增加约7％，而死亡率则每年增加9.3%。在西班牙，该疾病的发病率从2005年的0.62例/10万人增加到2007年的2015 年的3.3例/10万人。毛霉病在发展中国家的检出也越来越频繁，特别是在印度、中国和拉丁美洲，印度的发病率达14例/10万人。毛霉病感染进展迅速，大多病情凶险，180天内死亡率为56.7%，且死亡大多发生在1月内。毛霉病的发病率未知，而且可能被低估，因其临床表现不典型，诊断困难。
毛霉病的常规检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测，但以上几种方法的的检出率不高，且极易误诊为其他病原体导致的感染。所以，非常有必要发展常见毛霉菌的检测方法。
本发明通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，不仅成功地通过多重qPCR反应实现了对常见毛霉菌的检测，而且这些毛霉菌的检出率高达100%，特异性为100%，可以用于临床检测。由此可见，本发明可以促进毛霉菌的临床检测。
发明内容
本发明通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，结合多重qPCR反应实现了对米根霉，微小根毛霉和伞枝横梗霉等3种常见毛霉菌的检测，检出率高达100%，特异性为100%。
本发明采用如下的技术方案：
1）将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2）将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3）将计伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4）将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5）使用qPCR仪器进行多重qPCR反应程序，反应条件为：在95-105摄氏度下进行热盖，随后在40-50摄氏度反应4-6分钟，再把温度提高到90-95摄氏度反应5-10分钟；然后在90-95摄氏度每隔10-15秒做40次循环；最后在50-60摄氏度每隔30秒-1分钟做40次循环;
6) 反应结束后，若探针所对应通道的荧光读数小于阳性检出阈值，则该探针所检测的样本为阳性。
本发明的积极效果如下：
本发明通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，结合过多重qPCR反应实现了对米根霉，微小根毛霉和伞枝横梗霉等3种常见毛霉菌的检测，与目前报导的常见毛霉菌的检测方法相比，本方法不仅检出效率高，而且特异性强，可以为病患和医院带来临床检测收益。
附图说明
图1 是实施例1-12对常见毛霉菌的检测流程图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 米根霉的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将制备好的米根霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本米根霉质粒进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，5微升米根霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在105摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到95摄氏度反应10分钟；然后在95摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在60摄氏度每隔1分钟做40次循环;
4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读数为23，低于米根霉阳性检出阈值35，说明米根霉检出成功，检出率为100%。
实施例2 微小根毛霉的检测
1) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
2) 将制备好的微小根毛霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本微小根毛霉质粒进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，1.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升微小根毛霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在105摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到95摄氏度反应10分钟；然后在95摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在60摄氏度每隔1分钟做40次循环;
4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读数为27，低于微小根毛霉阳性检出阈值35，说明微小根毛霉检出成功，检出率为100%。
实施例3 伞枝横梗霉的检测
1) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
2) 将制备好的伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入伞枝横梗霉质粒作为检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，3.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，5微升伞枝横梗霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在105摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到95摄氏度反应10分钟；然后在95摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在60摄氏度每隔1分钟做40次循环;
4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读数为18，低于伞枝横梗霉阳性检出阈值35，说明伞枝横梗霉检出成功，检出率为100%。
实施例4 米根霉的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将制备好的米根霉引物及其检测探针与probe mix加入PCR管中，然后加入米根霉质粒作为检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，1.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，5微升米根霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在95摄氏度下进行热盖，随后在40摄氏度反应4分钟，再把温度提高到90摄氏度反应5分钟；然后在90摄氏度每隔10秒做40次循环；最后在50摄氏度每隔30秒做40次循环;
4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读数为24，低于米根霉阳性检出阈值35，说明米根霉检出成功，检出率为100%。
实施例5 微小根毛霉的检测
1) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
2) 将制备好的微小根毛霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本微小根毛霉质粒进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，1.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针， 5微升微小根毛霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在95摄氏度下进行热盖，随后在40摄氏度反应4分钟，再把温度提高到90摄氏度反应5分钟；然后在90摄氏度每隔10秒做40次循环；最后在50摄氏度每隔30秒做40次循环;
4) 反应结束后，探针对应通道的荧光读数为25，低于微小根毛霉阳性检出阈值，说明微小根毛霉检出成功，检出率为100%。
实施例6 伞枝横梗霉的检测
1) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
2) 将制备好的伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，后加入检测样本伞枝横梗霉质粒进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，1.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，0.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，5微升伞枝横梗霉质粒及水；
3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在95摄氏度下进行热盖，随后在40摄氏度反应4分钟，再把温度提高到90摄氏度反应5分钟；然后在90摄氏度每隔10秒做40次循环；最后在50摄氏度每隔30秒做40次循环;
4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读数为20，低于伞枝横梗霉阳性检出阈值35，说明伞枝横梗霉检出成功，检出率为100%。
实施例7 米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的共同检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入米根霉、伞枝横梗霉和微小根毛霉的混合质粒作为检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物， 1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，3.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物， 1.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，1.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在105摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到95摄氏度反应10分钟；然后在95摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在60摄氏度每隔1分钟做40次循环;
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针所对应通道的荧光读数分别为24，26和19，都分别低于米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的阳性检出阈值35，说明米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉分别检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例8 米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的共同检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入米根霉、伞枝横梗霉和微小根毛霉的混合质粒作为检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，1.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，2.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，2.6微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.8微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在100摄氏度下进行热盖，随后在53摄氏度反应5分钟，再把温度提高到93摄氏度反应10分钟；然后在90摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在55摄氏度每隔40秒做40次循环;
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉探针所对应通道的荧光读数分别为22, 25和21，都分别低于米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的阳性检出阈值35，说明米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉分别检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例9 临床样品1的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入临床样品进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，1.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，2.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，2.6微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.8微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在100摄氏度下进行热盖，随后在53摄氏度反应5分钟，再把温度提高到93摄氏度反应10分钟；然后在90摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在55摄氏度每隔40秒做40次循环;
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针所对应通道的荧光读数分别为45, 31和58，只有微小根毛霉低于其阳性检出阈值35，说明临床样品中含有微小根毛霉，不含有米根霉和伞枝横梗霉。这与临床微生物基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例10 临床样品2的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入临床样品进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，2.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，1.1微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，2.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，2.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.8微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在100摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到90摄氏度反应8分钟；然后在92摄氏度每隔15秒做40次循环；最后在53摄氏度每隔50秒做40次循环;
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针所对应通道的荧光读数分别为28, 45和61，只有米根霉的读数低于其阳性检出阈值35，说明临床样品中只含有米根霉，不含有微小根毛霉和伞枝横梗霉。这与临床微生物基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测结果一致。说明米根霉检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例11 临床样品3的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其检测探针与probemix加入PCR管中，然后加入临床样品进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，2.4微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.8微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，1.8微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.2微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，1.1微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在102摄氏度下进行热盖，随后在54摄氏度反应5分钟，再把温度提高到92摄氏度反应7分钟；然后在90摄氏度每隔20秒做40次循环；最后在50摄氏度每隔40秒做40次循环;
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针所对应通道的荧光读数分别为48, 30和11。只有微小根毛霉和伞枝横梗霉的荧光读数都低于微小根毛霉和伞枝横梗霉的阳性检出阈值，说明临床样品中只含有微小根毛霉和伞枝横梗霉，不含有米根霉。这与临床微生物基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测结果一致。说明微小根毛霉和伞枝横梗霉检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例12 临床样品4的检测
1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
2) 将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´ SEQ ID 06；
3) 将伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´SEQ ID 09；
4) 将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入临床样品进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，2.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.9微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，2.8微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，1.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，2.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.8微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
5) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在101摄氏度下进行热盖，随后在52摄氏度反应4分钟，再把温度提高到90摄氏度反应8分钟；然后在92摄氏度每隔12秒做40次循环；最后在55摄氏度每隔50秒做40次循环；
6) 反应结束后，米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针所对应通道的荧光读数分别为12, 20和31，都低于米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的阳性检出阈值，说明临床样品中含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉。这与临床微生物基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测结果一致。说明临床样品所含的米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例13 与商用毛霉属通用PCR试剂盒比较
本发明实例1-12中的毛霉菌检测结果与商用毛霉属通用PCR试剂盒的检测结果非常一致，但本发明相比商用毛霉属通用PCR试剂盒检测样本的时间缩短了0.5h，大大提高了检测效率。此外，本发明相比商用毛霉属通用PCR试剂盒样本检出率和特异性分别提高了15%和10%，都达到了100%。
实施例14 本发明试剂盒检测标样的情况
将实施例1-12中所述的引物组合和反应体系，与内部质控和阳性质控进行组合，分别构建12个毛霉菌检测试剂盒，用于毛霉菌标准样品检测。结果表明所构建得12个DNA甲基化毛霉菌检测试剂盒均能准确地检出毛霉菌标准样品，检出率和特异性分别为100%。
实施例15 本发明试剂盒检测样本的情况
将实施例14中所构建的12个DNA甲基化检测试剂盒对所采集的伤口拭子、血浆、脑脊液、骨髓液、房水、胸腹水、关节积液、组织、尿液、脓肿抽液、肺泡灌洗液、痰液或鼻咽拭子等样本进行检测，结果表明实施例14中所构建的12个DNA甲基化检测试剂盒检测地结果均能准确地反应样本中毛霉菌的情况。与商品化毛霉属通用PCR试剂盒比较，实施例14中所构建的12个DNA甲基化检测试剂盒不仅检出率和特异性分别高达100%，而且检测时间短，检测条件温和。按成本价计算，每个样本的检测费平均节省17元，不仅利于医院医保的采购使用，而且给检测者节省了不少检测费用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 杭州奥明医学检验实验室有限公司
<120> 一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒
<141> 2021-08-31
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cctagaaatt cagtattata aag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caggcgtact ctatagaa 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
taacaatgga tctcttggtt ctcgca 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgttgaccct tgatatttcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgttgaccct tgatatttcc 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aaattagata ccaatgcaag ccctca 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ggttagtgag ttcaataatt cca 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccaagtagtg tcccatagat 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gcattaagtc ttttaatgaa ctagc 25
序列表
<110> 杭州奥明医学检验实验室有限公司
<120> 一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒
<141> 2021-08-31
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<400> 9
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Claims (4)

1.一种常见毛霉菌的检测方法，其特征在于：
S1. 所述米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：
正向引物：5´-CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG-3´ SEQ ID 01,
反向引物：5´-CAGGCGTACTCTATAGAA-3´ SEQ ID 02,
检测探针：5´-TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA-3´ SEQ ID 03；
S2. 所述微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：
正向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 04,
反向引物：5´-TGTTGACCCTTGATATTTCC-3´ SEQ ID 05,
检测探针：5´-AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA-3´SEQ ID 06；
S3. 所述伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：
正向引物：5´-GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA-3´ SEQ ID 07,
反向引物：5´-CCAAGTAGTGTCCCATAGAT-3´ SEQ ID 08,
检测探针：5´-GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC-3´ SEQ ID 09；
S4. 将S1-S3步骤中所述的米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的引物及其探针与probemix加入PCR管中，然后加入检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成优选为：25微升Probe mix，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗探针，1.0-3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.5-1.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；
S5. 将步骤S4中的混合使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件优选为：在95-105摄氏度下进行热盖，随后在40-50摄氏度反应4-6分钟，再把温度提高到90-95摄氏度反应5-10分钟；然后在90-95摄氏度每隔10-15秒做40次循环；最后在50-60摄氏度每隔30秒-1分钟做40次循环;
S6. 反应结束后，若探针所对应通道的荧光读数小于阳性检出阈值，则其检测的样本为阳性。
2.一种常见毛霉菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中，包括权利要求1所述的引物组合和反应体系；或，所述检测试剂盒的使用方法包括权利要求1中任一项所述毛霉菌的检测方法的步骤。
3.根据权利要求2所述的一种常见毛霉菌的检测试剂盒，其特征在于，还包括内部质控和阳性质控。
4.根据权利要求2所述的一种常见毛霉菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测样本为伤口拭子、血浆、脑脊液、骨髓液、房水、胸腹水、关节积液、组织、尿液、脓肿抽液、肺泡灌洗液、痰液或鼻咽拭子。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450936A (zh) * 2014-12-25 2015-03-25 天津宝瑞生物技术有限公司 检测常见致病真菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒
AU2020102244A4 (en) * 2020-09-14 2020-10-29 The Second Affiliated Hospital Of Soochow University Primer group, kit and detection method for rapidly detecting carbapenemases genes
CN112725508A (zh) * 2021-02-02 2021-04-30 上海捷诺生物科技有限公司 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途
CN112980997A (zh) * 2021-04-26 2021-06-18 北京大学第一医院 侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450936A (zh) * 2014-12-25 2015-03-25 天津宝瑞生物技术有限公司 检测常见致病真菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒
AU2020102244A4 (en) * 2020-09-14 2020-10-29 The Second Affiliated Hospital Of Soochow University Primer group, kit and detection method for rapidly detecting carbapenemases genes
CN112725508A (zh) * 2021-02-02 2021-04-30 上海捷诺生物科技有限公司 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途
CN112980997A (zh) * 2021-04-26 2021-06-18 北京大学第一医院 侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵作涛;李丽丽;王晓阳;李若瑜;: "应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌", 中国真菌学杂志, no. 05 *
陈世平;索继江;孙鹤龄;魏华;马述仕;罗莉;: "应用免疫荧光技术检测肺微小根毛霉的感染", 菌物学报, no. 04 *

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