CN111304366B - 一种新冠状病毒covid-19核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型冠状病毒COVID‑19核酸检测方法及试剂盒，所述检测方法包括：提取待测样品RNA，经反转录得到DNA，对反转录后得到的DNA以引物对P进行RPA(聚合酶合成酶扩增反应)扩增，得到扩增产物；将Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA与BIO‑6T‑FAM探针混合形成预混液；将所述扩增产物加入所述预混液中，对反应产物进行试纸检测。通过观察试纸的显示检测线条数，判断出是否被新型冠状病毒COVID‑19感染。本发明则通过恒温扩增技术，Cas12a蛋白核酸检测与免疫胶体金技术的结合，实现了社区就能完成的核酸检验流程。所需的设备仅仅只是一套移液器，一个37℃恒温装置。能大大减轻医院的核酸检测负担。同时也有利于携带者自查，病愈患者复查等。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测的技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法及试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19是引发“新冠肺炎”的主要病原体及病因。该病毒能引起干咳，嗓子疼痛，头晕，乏力等症状与普通感冒发烧不易区别，准确分辨COVID-19与普通流感病毒等对于疾病控制有重要意义。而核酸检测则是判定该病毒的金标准。
然而，现行通用的核酸检测试剂盒大多利用荧光定量PCR仪，每日处理的样本能力有限，并且漏检率高，而且一个病人往往需要3次甚至更多次的检测才能确定是否携带COVID-19，这对病人以及检测人员均不友好。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法及试剂盒，解决现有核酸检测试剂盒检测流程繁琐、漏检率高的问题。
本发明的技术方案如下：
一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法，其中，包括步骤：
提取待测样品RNA，经反转录后以引物对P进行扩增，得到扩增产物；所述引物对P包括序列号如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列号如SEQ ID No.2所示的下游引物；
将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，对反应产物进行检测。
所述的检测方法，其中，所述Cas12a预混液包括：Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA及DNA探针。
所述的检测方法，其中，所述crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCUGCU GCU UGA CAG AUU-3’。
所述的检测方法，其中，所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BHQ探针或FAM-TTTTTT-BIO探针。
所述的检测方法，其中，当所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BHQ探针时，检测为用荧光定量PCR仪或酶标仪检测。
所述的检测方法，其中，当所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BIO探针时，所述检测为用试纸检测。
所述的检测方法，其中，所述扩增为RPA扩增。
所述的检测方法，其中，所述将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，反应温度为37℃。
所述的检测方法，其中，所述荧光定量PCR法采集光波长范围为500-530nm。
一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测用试剂盒，其中，包括用于扩增待测DNA的引物对P，以及由Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA和BIO-TTTTTT-FAM探针构成的预混液；所述引物对P包括序列号如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列号如SEQ ID No.2所示的下游引物；所述crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCU GCU GCU UGA CAG AUU-3’。
有益效果：本发明通过提取待测样品RNA，将所述RNA进行反转录并以引物对P进行恒温扩增，得到扩增产物；将Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA与DNA探针混合形成预混液；将所述扩增产物加入所述预混液中进行反应，对反应产物进行检测；其中对产物可以根据所使用的DNA探针种类采用不同的方式进行检测，例如试纸条进行检测，简化了测试流程，无需过多的设备，完成了社区就能完成的核酸检验流程。大大减轻医院的核酸检测负担，同时也有利于携带者自查，病愈患者复查等。
附图说明
图1为本发明实施方式中的一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法的流程图。
图2为本发明实施方式中的一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法中，采用荧光定量PCR仪或酶标仪检测时反应原理示意图。
图3为本发明实施方式中的一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法中，采用试纸检测时反应原理示意图。
图4为本发明实施例1中，一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测结果示意图。
图5为本发明实施例1中，一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测特异性评价图。
图6为本发明实施例1中，一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法的灵敏度的评价图。
具体实施方式
本发明提供一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
参照图1，本发明实施例提供一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法，其中，包括步骤：
S10、提取待测样品RNA，经反转录后以引物对P进行扩增，得到扩增产物；所述引物对P包括序列号如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列号如SEQ ID No.2所示的下游引物。
S20、将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，对反应产物进行检测。
本实施例中，通过提取待测样品的RNA，将所获取到的RNA进行反转录，得到DNA，对所述DNA以特异引物对P进行RPA扩增，将扩增后得到的产物与含有Cas12a的预混液进行反应，反应产物可以使用检测试纸进行检测，具有检出率高，操作简便，检测结果的判定对检测设备以及检测人员要求低的好处。由于检测不依赖专业的检测设备及较为严苛的检测环境，因此可以大幅提升每日处理的样本能力。
在一些实施方式中，所述Cas12a预混液成分包括：Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA及DNA探针。
具体地，所述crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCU GCU GCU UGA CAGAUU-3’。所述crRNA制备方法可以是首先设计并合成序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGAUCU GCU GCU UGA CAG AUU-3’的crRNA，使用转录试剂盒合成的目的crRNA进行转录，转录后即可得到crRNA。所述缓冲液可以是Buffer。
在本实施例中，所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BHQ探针或FAM-TTTTTT-BIO探针。当所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BHQ探针时，所述将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，对反应产物进行检测，其中，所述检测为用荧光定量PCR仪或酶标仪检测。其反应原理可参照图2，如图所示，首先对待检样品进行核酸提取，例如采用鼻咽拭子进行采样，对采集得到的样品进行RNA提取，得到样本的RNA。然后对所得到的RNA进行反转录操作，如果待检样品中含有新型冠状病毒COVID-19，则会得到新型冠状病毒COVID-19的DNA，接着对所得到的DNA进行RPA扩增，扩增结束后得到的扩增产物与含有Cas12a的预混液进行混合反应，其中Cas12a/crRNA二元复合物识别靶标DNA序列进行匹配，形成三元复合物，并在PAM序列近端开始形成R-loop（low FRET态）。随着R-loop的进一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，活化的Cas12对FAM-TTTTTT-BHQ探针进行非特异性剪切，其中5’末端携带荧光基团FAM失去了3’端携带淬灭基团BHQ的抑制后在紫外光激发后发绿光，绿光信号可以通过荧光定量PCR仪或酶标仪进行采集。
在一种或多种实施方式中，当所述DNA探针为FAM-TTTTTT-BIO探针时，所述将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，对反应产物进行检测，其中，所述检测为用试纸检测。
具体地，首先对待检样品进行基因提取，例如采用鼻咽拭子进行采样，对采集得到的样品进行RNA提取，得到样本的RNA，然后对所得到的RNA进行反转录操作，如果待检样品中含有新型冠状病毒COVID-19，则会得到新型冠状病毒COVID-19的DNA，接着进行RPA扩增，扩增结束后得到的扩增产物与含有Cas12a的预混液进行混合反应，将反应产物浸润到Milenia试纸条上，进行显色检测。若试纸的远端出现一道横杠，则表示为阳性，在试纸上出现两道横杠则表示为阴性。结合图3，反应原理如下：
在Cas12a/crRNA二元复合物识别靶标DNA序列进行匹配，形成三元复合物，并在PAM序列近端开始形成R-loop（low FRET态）。随着R-loop的进一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，活化的Cas12对FAM-TTTTTT-BIO探针进行非特异性剪切，胶体金上面的FAM一抗同FAM结合后在试纸的远端同二抗结合，从而在试纸的远端显示出一条带。试纸的近端链霉亲和素与生物素结合，因为没有FAM，则试纸的近端没有条带出现。
在本实施例中，当待检样本中不含有新型冠状病毒COVID-19或者新型冠状病毒COVID-19的含量过低时，则FAM-TTTTTT-BIO探针在上述反应过程中不会发生断裂，试纸上的链霉亲和素与 FAM-TTTTTT-BIO探针上的生物素进行结合，FAM-TTTTTT-BIO探针的另一端FAM结合有胶体金，因此会在试纸的近端也出现一条带，同时试纸的远端二抗与带有胶体金的FAM结合，显示出一条带。可以理解的是，当将反应产物浸润到Milenia试纸条上后，如果在试纸的远端只显示一条带，则表示样本为阳性，如果在远端显示一条带的同时，在试纸的近端也显示一条带，则表明样本为阴性。
通过将恒温扩增技术，Cas12a蛋白核酸检测与免疫胶体金技术的结合，完成了社区就能完成的核酸检验流程。所需的设备仅仅只是一套移液器，一个37℃恒温装置。能大大减低医院的核酸检测负担。也有利于携带者自查，病愈患者复查等。
基于相同的发明构思，本发明还提供了一种试剂盒，用于检测新型冠状病毒COVID-19，所述试剂盒包括，用于对从待检样本提取的RNA经反转录得到的DNA进行扩增的引物对P，以及由Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA和BIO-TTTTTT-FAM（即BIO-6T-FAM探针）构成的预混液；所述引物对P包括序列号如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列号如SEQ ID No.2所示的下游引物；所述crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCU GCU GCU UGA CAGAUU-3’。
进一步，可以将上述Cas12预混液中BIO-TTTTTT-FAM探针用BHQ-6T-FAM探针替换，检测方法由试纸检测变换为荧光定量分析，因此可以满足不同的检测需求。
下面通过具体的实施例对上述检测方法做进一步的解释说明。
实施例1
步骤1：用圣湘生物核酸释放剂处理拭子。
步骤2：用诺唯赞反转录试（R323-01）剂盒对步骤1处理后的样本进行反转录。
具体反应条件为：
4x gDNA wiper Mix 4μl
步骤1处理产物 12μl
轻轻吹打混合后，放入42℃2min。
上述反应液体 16μl
5x HiScript III 4μl
轻轻吹打混匀后，放37℃15min。
步骤3：用重组酶合成酶扩增（RPA）试剂盒（安普未来，WLN8203KIT）对目标核酸进行扩增.扩增引物为：F: 5’-CTC CAG GCA GCA GTA GGG GAA CTT CTC CTG CTA GAA T-3’,R: 5’-TGT TGG CCT TTA CCA GAC ATT TTG CTC TCA AGC TG-3’
扩增体系为：
Buffer A（溶解粉末） 29.4μl
Buffer B 2.5μl
F（10μM） 2μl
R（10μM） 2μl
步骤2产物 5μl
灭菌水补齐至50μl
放至37℃水浴锅反应2h
步骤4：制备Cas12a反应体系。crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCUGCU GCU UGA CAG AUU-3’。
Cas12a蛋白 250nM
Buffer 2μl
crRNA 500nM
BIO-6T-FAM探针 500nM
RPA产物 2μl
放至37℃水浴锅30min。
步骤5：将步骤4产物浸润Milenia试纸条10min等待结果。如图4所示，图中左为阳性，在远端带显示一条带，右为阴性，显示两条带，其中远端带较弱。
实施例2
步骤1：用圣湘生物核酸释放剂处理拭子。
步骤2：用诺唯赞反转录试（R323-01）剂盒对步骤1处理后的样本进行反转录。
具体反应条件为：
4x gDNA wiper Mix 4μl
步骤1处理产物 12μl
轻轻吹打混合后，放入42℃2min。
上述反应液体 16μl
5x HiScript III 4μl
轻轻吹打混匀后，放37℃15min。
步骤3：用重组酶合成酶扩增（RPA）试剂盒（安普未来，WLN8203KIT）对目标核酸进行扩增.扩增引物为：F: 5’-CTC CAG GCA GCA GTA GGG GAA CTT CTC CTG CTA GAA T-3’,R: 5’-TGT TGG CCT TTA CCA GAC ATT TTG CTC TCA AGC TG-3’
扩增体系为：
Buffer A（溶解粉末） 29.4μl
Buffer B 2.5μl
F（10μM） 2μl
R（10μM） 2μl
步骤2产物 5μl
灭菌水补齐至50μl
放至37℃水浴锅反应2h
步骤4：制备Cas12a反应体系。crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCUGCU GCU UGA CAG AUU-3’。
Cas12a蛋白 250nM
Buffer 2μl
crRNA 500nM
BHQ-5T-FAM探针 500nM
RPA产物 2μl
放至37℃水浴锅30min。
步骤5：将步骤4产物采用荧光定量PCR法进行定量检测分析。
需要说明的是，可以将上述步骤3所采用的RPA扩增法替换为PCR扩增法，采用不同的扩增方法所得到的扩增产物与Cas12预混液进行反应后，得到的产物采用荧光定量PCR法进行定量检测分析，结果如图5、6 所示。
从图5中可以看出，PCR扩增产物与RPA扩增产物加入到Cas12a检测预混液中均能产生荧光报告值，但是RPA扩增产物信号明显强于PCR扩增产物。从图6中可以看出，本发明所提供的检测方法检测灵敏度可达10aM。
综上所述，本发明提供一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测方法及试剂盒，所述检测方法包括：提取待测样品RNA，将所述RNA进行反转录得到DNA，对所述DNA以引物对P进行RPA扩增，得到扩增产物；将Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA与BIO-TTTTTT-FAM探针混合形成预混液，将所述扩增产物加入所述预混液中，对反应产物进行试纸检测。通过观察试纸的显示检测线条数，判断出是否被新型冠状病毒COVID-19感染。本发明则通过恒温扩增技术，结合Cas12a蛋白核酸检测，免疫胶体金技术的结合，完成了社区就能完成的核酸检验流程。所需的设备仅仅只是一套移液器，一个37℃恒温装置。能大大减低医院的核酸检测负担。也有利于携带者自查，病愈患者复查等。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市众循精准医学研究院
<120> 一种新冠状病毒COVID-19核酸检测方法及试剂盒
<160> 2
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
ctccaggcag cagtagggga acttctcctg ctagaat 37
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
tgttggcctt taccagacat tttgctctca agctg 35
Claims (1)
1.一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测用试剂盒，其特征在于，包括：用于扩增待测DNA的引物对P，以及由Cas12a蛋白、缓冲液、crRNA和BIO-TTTTTT-FAM探针构成的预混液；所述引物对P包括序列号如SEQ ID No.1所示的上游引物及序列号如SEQ ID No.2所示的下游引物；所述crRNA序列为5’-pAAU UUC UAC UGU UGU AGA UCU GCU GCU UGA CAG AUU-3’；
核酸检测方法包括步骤：
提取待测样品RNA，经反转录后以所述引物对P进行扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物加入到所述预混液中进行反应，对反应产物进行检测；
所述将所述扩增产物加入到Cas12a预混液中进行反应，对反应产物进行检测，其中，所述检测为用试纸检测；
所述扩增为RPA扩增；反应温度为37℃。
Priority Applications (1)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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