CN111455112A

CN111455112A - 一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的核酸初筛试剂盒

Info

Publication number: CN111455112A
Application number: CN202010344069.1A
Authority: CN
Inventors: 黄凤婷; 颛孙永勋
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a方式分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的crRNA以及检测试剂盒。本发明能精确的检测出甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒，且本发明的试剂盒相比于传统的核酸检测方法，该方案操作性简便，不依赖荧光定量PCR仪器。本发明试剂盒结合RAA等温扩增技术、免疫胶体金技术以及Cas12a技术，一次性扩增后，同时对多个病原体进行检测。

Description

一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的核酸初筛试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体设计一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的初筛试剂盒。

背景技术

甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒2019-nCoV均为单链RNA病毒，在入侵人体后通过自身编码的RNA依赖RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRP)直接进行RNA复制并大量扩增。病毒病原体能刺激免疫系统，产生因子风暴，引起机体器官损害。病毒能引发呼吸道感染，出现发烧、咳嗽等相似症状，并且能通过空气飞沫等途径在人群中造成大面积传播，三者早期症状并不容易区分。相比之下，2019-nCoV的基本增生速率(Basicreproduction rate,R0)值为2.2，远远高于其他流感；同时2019-nCoV造成重型肺炎的比例更高，重症率(20％以上)与死亡率(2％以上)也显著高于流感。因此，在有以上症状的患者中，若能通过核酸检测手段鉴别三个不同病原体，对于疾病控制，人民生命健康安全的保障具有重要意义。

目前针对以上三种病原的核酸检测有以下方法：荧光定量PCR法、环介导恒温扩增法、基于重组酶介导恒温核酸扩增法和重组酶聚合酶扩增法等。但是目前主要依赖荧光定量PCR法：患者拭子标本经核酸释放，逆转录后，用Taqman探针法对样品进行荧光定量PCR检测。该方法能在较短时间内得到准确结果。但需依托荧光定量PCR仪，单次少量检测成本高。

其他常用的核酸扩增方法包括：环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)，基于重组酶介导恒温核酸扩增法(recombinant enzyme mediatedisothermal nucleic acid amplification,RAA)和重组酶聚合酶扩增法(recombinasepolymerase amplification,RPA)等核酸恒温扩增方法，在恒定温度也能高效扩增核酸，摆脱了热循环仪的限制，但是容易产生假阳性信号。

发明内容

本发明于鉴于上述现有技术的不足，迫切需要一种既能不依赖于贵重的荧光定量PCR仪，同时能较特异的检测以上三种病原体核酸的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一方面本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a方式分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示。

优选地，所述检测甲型流感病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:7。

优选地，所述检测乙型流感病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:8。

优选地，所述检测新型冠状病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:9。

另一方面本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a方式分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括本发明所述的crRNA、Cas蛋白、单链DNA报告序列、扩增检测目的病毒的引物组、缓冲液、试纸条及分析缓冲液。

优选地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示。其中所述检测甲型流感病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:7。所述检测乙型流感病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:8。所述检测新型冠状病毒的crRNA为序列SEQ ID NO:9。

优选地，所述引物组包括如SEQ ID NO:1～6所述的核苷酸序列。其中所述检测甲型流感病毒的引物为序列SEQ ID NO:1～2。所述检测乙型流感病毒的引物为序列SEQ IDNO:8。所述检测新型冠状病毒的引物为序列SEQ ID NO:9。

优选地，所述单链DNA报告序列为5’端用FAM、FITC、RB200、TRITC、TET、PE、PI、AMCA、Atto425、PerCP、APC、Alexa Fluor 488、JOE、VIC、HEX、NED、Cy3、TAMRA、ROX、Texasred、Cy5、Quasar 670、Cy5.5和Cy7中的任意一种进行修饰，且所述单链DNA报告序列的3’端用quencher或生物素修饰的T和A的富集序列。

优选地，所述试纸条按液流方向依次包括样品垫、结合垫、检测线和对照线；所述结合垫上包被抗所述单链DNA报告序列的5’端的修饰标记抗体的金属颗粒，对照线上包被链霉亲和素，检测线上包被二抗。

优选地，所述Cas蛋白为Cas12蛋白。

本发明基于CRISPR/Cas12系统中Cas12蛋白具有非特性的剪切单链DNA的活性，其能剪切FAM-TTATT-biotin探针，该探针被剪切后能在免疫试纸条上显示出单带。CRISPR相关蛋白Cas12a是VA CRISPR系统的核酸内切酶，已应用于体内基因组编辑和体外DNA装配。Cas12a可以通过单个CRISPR RNA(crRNA)借助碱基互补配对的方法识别靶标DNA，如若识别成功，则能产生非特异性核酸酶活性。所以，待测核酸如果含有与crRNA互补配对的靶标DNA则能够对探针进行降解(如图1)。降解后的FAM-TTATT-biotin探针两端的FAM、biotin基团游离。试纸条如图2所示，在探针完好的条件下可以显示2条带，而探针断裂，则只能显示1条带。以上是Cas12a可用于作为核酸检测的基础。

本发明中我们采用RAA核酸扩增技术，即在39℃时能将样本RNA进行反转录并大量扩增。并将RAA扩增产物分别投入到三管Cas12a反应体系中，分别对甲流病毒、乙流病毒和新型冠状病毒进行反应，对探针进行剪切(如图2)。在Cas12a反应后的产物中浸入一次性核酸检测试纸条(彩虹型)(Tiosbio，Cat.No.JY0201)进行显色。该检测试纸条采用层析式双抗体夹心法快速检测核酸扩增产物(如图2)。若是阳性则显示单带，若是阴性则显示两条带。

本发明的有益效果：采用本发明的试剂盒检测甲流病毒、乙流病毒和新型冠状病毒相比于传统的核酸检测方法，该方案操作性简便，不依赖荧光定量PCR仪器。本发明试剂盒结合RAA等温扩增技术、免疫胶体金技术以及Cas12a技术，一次性扩增后，同时对多个病原体进行检测。

附图说明

图1为CRISPR/Cas12系统中Cas12蛋白反应原理示意图。

图2为本发明核酸检测试纸条显色原理示意图。

图3为实施例2反应流程图.

图4为实施例2甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒的检测结果。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1、获得甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒crRNA：由上海权阳生物科技有限公司制备。

2、获得Cas12a蛋白：购自Bio-lifesci(广州博徕斯生物科技股份有限公司)，(货号：M20301-100，规格：100pmol)

3、报告序列的制备：由上海权阳生物科技有限公司制备

4、试纸条的制备：一次性核酸检测试纸条(彩虹型)购自

(北京宝盈同汇生物技术有限公司)，(货号：Cat.No.JY0201，规格：10条/包×5)

实施例2采用试纸条检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒

1、分别针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒设计扩增引物序列如下：

A：甲型流感病毒

Forward：5’-GACCAAAGATGCAGAGAGAGGCAAGTTAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO:1)

Reverse：5’-GTTTGAGAACATTATGGGTGCCATGCTCAGGATGTT-3’(SEQ ID NO:2)

B：乙型流感病毒

Forward：5’-CCCCACCAAGCAACAAACGAACCCGGAA-3’(SEQ ID NO:3)

Reverse：5’-CCTTCCGACACATCAGCTTCACTGATT-3’(SEQ ID NO:4)

C：新型冠状病毒

Forward：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTA-3’(SEQ ID NO:5)

Reverse：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTT-3’(SEQ ID NO:6)

2、将采集的鼻或口咽拭子经核酸释放液释放核酸，采用上述引物在39℃下进行RT-RAA(RT-RAA试剂直接购自

北京宝盈同汇生物技术有限公司，货号：Cat.No.JY0203，规格：48kit)扩增反应1小时，反应体系如下：

缓冲液 25μl

引物组 10μl

样品RNA 15μl

3.将上述扩增反应产物分别投入到3管(A管、B管、C管)Cas12a反应体系中，在37℃下反应1小时：

本实施例中的Buffer购自New England Biolabs(NEB)(MA,USA)，货号：Cat.No.B7203S，规格：5ml，10×Buffe；1×Buffe的成分为：100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA、pH 7.9@25℃。

三管Cas12a反应液体主要成分一样，仅crRNA序列不同，其中：

A管中crRNA序列为：

A：AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCACAACAUUUGCCAGU(SEQ ID NO:7)

B管中crRNA序列为:

B：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCGGGGAUGGGUUCCGGG(SEQ ID NO:8)

C管crRNA序列为：

C：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCUGCUGCUUGACAGAUU(SEQ ID NO:9)

4、将一次性核酸检测试纸条(彩虹型)浸润反应液中，十分钟后观察条带。A管、B管、C管结果分别反应甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒展示结果(如图4所示)。

由于样品垫能在短时间内吸收样品溶液，之后在虹吸作用下向结合垫方向移动，样品溶液中未被切割和被切割的报告3’端FAM会与耦联抗FITC抗体的金纳米颗粒特异性结合，在毛细作用下金纳米颗粒随液体移动，未被切开的报告序列和被切掉带生物素的一端因生物素与链霉亲和素的强亲和作用而被富集，而被切掉带有FAM的一端与耦联抗FITC抗体的金纳米颗粒会继续向前移动，因二抗与抗FITC的作用而被截留显色。因此，如果报告序列被切割，包被链霉亲和素固定带则不显色，试纸条显色一条带，表示阳性，样品中含有对应的检测病毒；相反报告报告序列没有被切割，包被链霉亲和素固定带则显色，试纸条显色两条带，表示阴性，样品中不含有对应的检测病毒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas12a方式分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示。

2.如权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述检测甲型流感病毒的crRNA为序列SEQID NO:7。

3.如权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述检测乙型流感病毒的crRNA为序列SEQID NO:8。

4.如权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的crRNA为序列SEQID NO:9。

5.一种基于CRISPR/Cas12a方式分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括本发明所述的crRNA、Cas蛋白、单链DNA报告序列、扩增检测目的病毒的引物组、缓冲液、试纸条及分析缓冲液。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO:1～6所述的核苷酸序列。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告序列为5’端用FAM、FITC、RB200、TRITC、TET、PE、PI、AMCA、Atto425、PerCP、APC、Alexa Fluor 488、JOE、VIC、HEX、NED、Cy3、TAMRA、ROX、Texasred、Cy5、Quasar 670、Cy5.5和Cy7中的任意一种进行修饰，且所述单链DNA报告序列的3’端用quencher或生物素修饰的T和A的富集序列。

9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条按液流方向依次包括样品垫、结合垫、检测线和对照线；所述结合垫上包被抗所述单链DNA报告序列的5’端的修饰标记抗体的金属颗粒，对照线上包被链霉亲和素，检测线上包被二抗。

10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12蛋白。