CN112593013B

CN112593013B - 牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重rpa检测试剂盒

Info

Publication number: CN112593013B
Application number: CN202011602492.3A
Authority: CN
Inventors: 赵晓民; 童德文; 王凯丽; 刘丹
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112593013A

Abstract

本发明公开了一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重RPA检测试剂盒，包括由SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.5所示核苷酸序列组成的牛副流感病毒RPA检测引物组，以及由SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.10所示核苷酸序列组成的牛呼吸道合胞体病毒RPA检测引物组。所述试剂盒基于重组酶聚合酶扩增法，以利用RNA反转录形成的cDNA为模板并在优化的反应温度和时间下进行扩增反应，利用核酸凝胶电泳获得检测结果。本发明可用于同时对牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行检测，操作简单，并且具有较高的灵敏度和特异性，为牛病原体的现场筛查提供了快速检测试剂。

Description

牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重RPA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

牛副流行性感冒是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza-3virus，BPIV-3)感染引起的一种以高热、呼吸困难和咳嗽为特征并以呼吸道症状为主的疾病，常与其他呼吸道病毒出现混合感染。BPIV-3感染可引起牛呼吸功能损伤以及免疫抑制，并导致牛死亡，对舍饲育肥牛的危害极大，被认为是全球集约化养殖中造成重大经济损失的肺炎的主要病原体。牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，感染后可导致流产和永久性肺损伤，促进机会性继发性病原体侵袭，对动物生产性能造成长期损失。

养殖场多位于偏远的农村，条件简陋、交通不便，这就要求病原体的检测方法应具有较高的稳定性和便捷性。目前，常用于检测牛呼吸道病毒的方法包括病原体的分离鉴定、间接免疫荧光反应、聚合酶链式扩增(PCR)法、电镜检查等。这些方法均需要专业人员操作并且依赖于复杂、昂贵的专业仪器设备，不适合在养殖场现场使用。

RPA技术采用恒温扩增反应，与PCR不同的是RPA利用重组酶UvsX打开模板链，而不是通过高热变性，可以在更短的时间内实现对目的核酸的扩增。例如，中国专利CN108315491A“牛副流感病毒3型的RPA-侧流层析检测引物、探针及试剂盒”。RPA相比于PCR，对引物设计的要求更为严苛，无法完全依照软件设计实现，筛选有效的特异性扩增引物和反应条件是实现多重RPA检测的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重RPA检测试剂盒，可以实现一次对两种病毒的同时检测，具有广泛应用前景。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测引物组，该RPA检测引物组包括牛副流感病毒反转录本扩增引物对P1以及牛呼吸道合胞体病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F2：5'-GAGTATGATCAAGACAATATGTTGCAAAATGG-3'(SEQ.ID.NO.2)下游引物R3：5'-CTGATTGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCTG-3'(SEQ.ID.NO.5)；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'3：5'-GGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGG-3'(SEQ.ID.NO.8)

下游引物R'2：5'-CTCCACCTAACTTTTGTGCATATTCATAGACTTC-3'(SEQ.ID.NO.10)。

一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上述RPA检测引物组。

优选地，所述RPA检测引物组中，各引物的工作浓度均为5～20μM。

优选地，所述RPA检测引物组中，根据引物对扩增片段的大小差异，扩增片段较小的引物对P2在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大的引物对P1在该反应体系中的含量，从而确保两种病毒的RPA检测结果达到相对一致的稳定性，避免错误判读。

优选地，所述RPA检测引物组中，F2:R3:F'3:R'2的用量体积比为(1.1～1.2):(1.1～1.2):(1.2～1.3):(1.2～1.3)。

优选地，所述试剂盒还包括重组酶UvsX和DNA聚合酶(例如，含于RPA Basic冻干粉中)、RPA缓冲液(例如，Rehydration Buffer)和MgOAc。

一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测方法，包括以下步骤：

1)从采集自待测牛的生物样品中提取RNA，以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，采用上述RPA检测引物组在同一个反应体系中进行RPA扩增，得到扩增产物；

2)将扩增产物进行核酸电泳检测，若电泳结果出现409bp条带，则所述生物样品含有感染获得的牛副流感病毒；若电泳结果出现186bp条带，则所述生物样品含有感染获得的牛呼吸道合胞体病毒；若电泳结果同时出现409bp和186bp的两种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒；若电泳结果无条带出现，则所述生物样品不含有牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒。

优选地，所述反应体系包括5～20μM上游引物F2 1.1～1.2μL、5～20μM下游引物R31.1～1.2μL、5～20μM上游引物F'3 1.2～1.3μL、5～20μM下游引物R'2 1.2～1.3μL、280mmol/L MgOAc 0.5～3μL、RPA缓冲液7～30μL以及≤2μL的模板。

优选地，所述反应体系中，模板的含量为30～100ng。

优选地，所述RPA扩增的反应条件为：40～45℃扩增20～30min，冰上终止反应。

优选地，所述生物样品选自牛血清或牛鼻拭子。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过设计和筛选针对牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的RPA引物，实现了对两种病毒的双重RPA检测，检测结果采用核酸电泳分析进行判读，具有检测速度快、成本低、灵敏度和稳定性高，以及特异性强的优势，不需基因扩增仪，方便在现场开展牛病原体的快速筛查。

进一步地，本发明利用所述的RPA检测引物组结合反应体系优化，在核酸电泳中可以获得更清晰的产物条带，降低了检测结果受到RPA扩增产物在反应期间发生降解的影响。

附图说明

图1为本发明实施例中BPIV-3的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对F1-R1(扩增目的片段为363bp)；泳道2：引物对F1-R2(扩增目的片段为382bp)；泳道3：引物对F1-R3(扩增目的片段为452bp)；泳道4：引物对F2-R1(扩增目的片段为320bp)；泳道5：引物对F2-R2(扩增目的片段为339bp)；泳道6：引物对F2-R3(扩增目的片段为409bp)；泳道7：阴性对照(阴性对照的模板是ddH₂O)。

图2为本发明实施例中BRSV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对F'1-R'1(扩增目的片段为118bp)；泳道2：引物对F'2-R'1(扩增目的片段为114bp)；泳道3：引物对F'3-R'1(扩增目的片段为169bp)；泳道4：引物对F'1-R'2(扩增目的片段为232bp)；泳道5：引物对F'2-R'2(扩增目的片段为131bp)；泳道6：引物对F'3-R'2(扩增目的片段为186bp)；泳道7：阴性对照。

图3为本发明实施例中BPIV-3和BRSV双重RPA扩增结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BPIV-3和BRSV双重RPA扩增；泳道2：阴性对照。

图4为本发明实施例中BPIV-3和BRSV双重RPA扩增反应温度优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：30℃；泳道2：35℃；泳道3：40℃；泳道4：45℃；泳道5：50℃。

图5为本发明实施例中BPIV-3和BRSV双重RPA扩增反应时间优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：10min；泳道2：20min；泳道3：30min；泳道4：40min；泳道5：50min；泳道6：阴性对照。

图6为本发明实施例中BPIV-3和BRSV双重RPA扩增反应特异性检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BRSV(186bp)；泳道2：BPIV-3(409bp)；泳道3：BVDV；泳道4：BCoV；泳道5：BRV；泳道6：VSV；泳道7：FMDV；泳道8：BHV；泳道9：阴性对照。

图7为本发明实施例中BPIV-3和BRSV双重RPA扩增反应灵敏度检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BRSV浓度为60.3ng/μL、BPIV-3浓度为74.5ng/μL；泳道2：BRSV浓度为6.33ng/μL、BPIV-3浓度为7.45ng/μL；泳道3：BRSV浓度为6.33×10^-1ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-1ng/μL；泳道4：BRSV浓度为6.33×10^-2ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-2ng/μL；泳道5：BRSV浓度为6.33×10^-3ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-3ng/μL；泳道6：BRSV浓度为6.33×10^-4ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-4ng/μL；泳道7：BRSV浓度为6.33×10^-5ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-5ng/μL；泳道8：BRSV浓度为6.33×10^-6ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-6ng/μL；泳道9：BRSV浓度为6.33×10^-7ng/μL、BPIV-3浓度为7.45×10^-7ng/μL；泳道10：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)引物设计与筛选

(1)在GeneBank中收集牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)这两种病毒的全基因组序列，利用MegAlign对序列进行比对分析(BPIV-3为12条全基因组序列，BRSV为5条全基因组)，选取种内保守且种间特异的区域作为每种病毒的检测靶基因，确定BPIV-3的NP基因和BRSV的N基因为靶基因，进一步比对靶基因序列，确定拟扩增的基因序列候选区域，然后根据确定的基因序列设计引物。其中BPIV-3的RPA引物设计是参考NP基因并在其候选区域内进行匹配设计，BRSV的RPA引物设计是参考N基因并在其候选区域内进行匹配设计。

采用以下引物筛选原则，剔除根据引物碱基互补配对等引物一般设计要求获得的候选引物中不符合以下要求的引物，从而提高了引物筛选效率：

A.引物长度在30～35bp之间；

B.引物的TM值不作为参考，但是GC含量应在40％～60％之间；

C.引物不存在发卡结构，避免二聚体和错配；

D.引物的5'端前3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤，3'端最后3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤；

E.引物中避免出现特殊结构，例如，回文序列、长串的聚嘌呤或聚嘧啶(不超过5个)等。

筛选出的引物送上海生工合成，上、下游引物序列如下。

BPIV-3上游引物：

F1：5'-GGTTTATGAAAAGACAACTGACTGGATGTTCGGGA-3'(SEQ.ID.NO.1)

F2：5'-GAGTATGATCAAGACAATATGTTGCAAAATGG-3'(SEQ.ID.NO.2)

BPIV-3下游引物：

R1：5'-CCTGCCTGTGTTCATTGTTATCAGTGTTTC-3'(SEQ.ID.NO.3)

R2：5'-CTATCGTTGTCAAGTCATTCCTGCCTGTGTTC-3'(SEQ.ID.NO.4)

R3：5'-CTGATTGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCTG-3'(SEQ.ID.NO.5)

BRSV上游引物：

F'1：5'-GGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTG-3'(SEQ.ID.NO.6)

F'2：5'-CAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTACTAGCC-3'(SEQ.ID.NO.7)

F'3：5'-GGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGG-3'(SEQ.ID.NO.8)

BRSV下游引物：

R'1：5'-GCATATTCATAGACTTCTACAACCTGTTCCATTTC-3'(SEQ.ID.NO.9)

R'2：5'-CTCCACCTAACTTTTGTGCATATTCATAGACTTC-3'(SEQ.ID.NO.10)

(2)模板构建

受病原体来源限制，人工合成病原体基因组序列，并以这些人工合成的BPIV-3和BRSV基因组序列作为模板(2020年6月合成)进行后续实验。

BPIV-3模板序列：

5'-CTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACTGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGACAATATGTTGCAAAATGGTAGAAGCACTTCTACAATCGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGATATCCATCATGTCTTGGAGCCCTTATAATCCAGGTTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGATTCTTTACTCGGTTAGAAGCATTTAGACAAGATGGAACAGTTAAATCCAGTTTGGTGTTGAGCGGTGATGCAGTAGAACAAATTGGATCAATTATGAGGTCCCAACAGAGCTTAGTAACACTCATGGTTGAAACACTGATAACAATGAACACAGGCAGGAATGACTTGACAACGATAGAAAAGAATATACAGATTGTAGGAAACTACATCAGGGATGCAGGTCTTGCTTCATTTTTCAACACAATCAGATATGGC-3'(SEQ.ID.NO.11)

BRSV模板序列：

5'-CCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTACTAGCCAAATCAGTCAAGAACATTATGCTTGGTCATGCCAGCGTACAAGCAGAAATGGAACAGGTTGTAGAAGTCTATGAATATGCACAAAAGTTAGGTGGAGAAGCTGGTTTTTATCACATATTGAACAACCCTAAAGCATCATTGTTATCCTTAACACAATTCCCCAACTTCTCTAGTGTAGTCCTAGGCAATGCTGCAGGACTAGGTATAATGGGTGAGTATAGAGGTACACCAAGAAACCAAGACTTGTATGATGCTGCC-3'(SEQ.ID.NO.12)

(3)RPA的反应体系

50μL反应体系：模板0.5μL(60.3ng/μL BRSV或74.5ng/μL BPIV-3)、RehydrationBuffer 29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、ddH₂O 12.7μL以及280mM MgOAc2.5μL。

(4)RPA恒温扩增反应

将配好的50μL体系加入一管RPA Basic冻干粉(含重组酶)中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(5)依据扩增结果筛选引物

将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，BPIV-3引物筛选结果如图1所示，其中引物对F1-R1没有扩增出目的条带，引物对F1-R2、F2-R1，及F2-R2扩增出非特异性条带，不能用于后续实验，引物对F1-R3和F2-R3扩增出特异性条带，但是F2-R3的条带更亮(即扩增稳定性和产物含量更高)，因此针对BPIV-3选用引物对F2-R3进行后续实验；BRSV引物筛选结果如图2所示，针对BRSV选用引物对F'3-R'2进行后续实验。

(二)BPIV-3和BRSV的双重RPA检测方法建立

将人工合成的BPIV-3和BRSV模板混合，并以筛选出的引物组(F2-R3、F'3-R'2)进行RPA恒温扩增反应。

(1)双重RPA反应体系为50μL：BPIV-3和BRSV模板各0.5μL、Rehydration Buffer29.5μL、10μM BPIV-3上、下游引物各1.1μL、10μM BRSV上、下游引物各1.3μL、ddH₂O 12.2μL、280mM MgOAc 2.5μL。

将配好的50μL体系加入一管RPA Basic冻干粉中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(2)将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，双重RPA反应体系成功扩增出BPIV-3的大小为409bp条带，以及BRSV的大小为186bp条带。

(3)利用上述双重RPA反应体系，将扩增反应温度设置为：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，分别进行RPA扩增40min，扩增结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应温度下的扩增产物检测结果如图4所示，在45℃时，条带最为清晰且亮度较高，因此确定最佳反应温度为45℃。

(4)利用上述双重RPA反应体系，将扩增反应时间设置为：10min、20min、30min、40min、50min，在确定的最佳反应温度45℃下进行RPA扩增，扩增结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应时间下的扩增产物检测结果如图5所示，可见在30min内随时间增长，条带逐渐变亮，超过30min条带变暗，而且20min和30min的条带明暗度差异不大，因此确定最佳反应时间为20min。

(三)检测特异性

分别以牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(BHV)的基因片段作为模板，加入与(一)中相同的反应体系，利用(一)中筛选出的引物组(F2-R3、F'3-R'2)和(二)中确定的最佳反应时间和温度进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。从图6可知，针对引物组(F2-R3、F'3-R'2)建立的RPA反应体系和反应条件能够快速准确的检测出BPIV-3和BRSV，而且引物组不与另外6种病原体发生非特异性扩增，表明引物组(F2-R3、F'3-R'2)特异性高、通用性好。

(四)检测灵敏度

为了考察本发明针对牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒建立的双重RPA检测方法的灵敏度，用nanodrop 2000超微量分光光度计测得人工合成的模板浓度，分别以60.3ng/μL BRSV及74.5ng/μL BPIV-3为母液，将其进行10倍梯度稀释后作为模板，按照(一)中筛选出的引物组(F2-R3、F'3-R'2)，以及(二)中的双重RPA反应体系及最佳反应温度和时间进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示。从图7可知，以上建立的双重RPA检测方法的最低检测限为1×10^-5ng/μL，具有很高的灵敏度。

(五)检测实例

为了考察本发明建立的牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测方法对实际样本的检测效果，于陕西省咸阳市(2019年4月)随机采集60份牛血清样品、20份牛鼻拭子样品，采用Trizol法提取总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，同时以人工合成的基因模板为阳性对照，以水为阴性对照，按照(一)中筛选出的引物组(F2-R3、F'3-R'2)，以及(二)中确定的双重RPA反应体系和最佳反应温度和时间进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。同时使用基于PCR技术的BPIV-3和BRSV检测方法进行检测。检测结果见表1、表2。

RPA扩增产物检测结果判读：使用琼脂糖凝胶电泳检测后，检测结果中若出现409bp条带，则待测样品来自感染牛副流感病毒的个体；若出现186bp条带，则待测样品来自感染牛呼吸道合胞体病毒的个体；若同时出现409bp和186bp条带，则待测样品来自同时感染牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒的个体；若无条带出现，则待测样品来自没有感染牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒的个体。

表1.应用不同方法检测牛血清样品结果

表2.应用不同方法检测牛鼻拭子样品结果

由表1和表2可知，本发明建立的双重RPA检测方法与现有PCR检测方法的结果一致，表明本发明的双重RPA检测方法能够用于BPIV-3和BRSV的实际检测，且由于无需使用复杂的仪器设备，反应时间更短，更适合在养殖场现场进行检测。

为了方便上述双重RPA检测方法的应用，本发明提出了BPIV-3和BRSV的双重RPA检测试剂盒，该试剂盒包括RPA检测引物组的成套核酸(具体由F2、R3、F'3及R'2组成)、TwistDx冻干态(RPA)试剂(内含RPA Basic冻干粉、Rehydration Buffer、MgOAc)。

本发明具有以下优点：

(1)本发明检测牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒的方法操作简单，不需要昂贵复杂的仪器设备，可用于样本采集现场或实验室快速检测。

(2)本发明可以在一个反应体系内同时检测出牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒，显著缩短了牛病原体检测时间、提高检测效率且节约了成本，具有良好的应用前景。

(3)本发明的RPA检测引物组是针对牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒保守基因序列设计，利用该引物组对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒进行检测，均未扩增出条带，表明引物组的特异性强。

(4)本发明对牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒的检测灵敏度高，可达到10^-5ng/μL。

(5)本发明的检测结果通过核酸凝胶电泳分析进行判读，通过对RPA引物的筛选以及优化RPA反应体系，提高了检测结果的稳定性，可以同时获得两种病毒的清晰的扩增产物电泳条带，从而在降低检测成本的同时，解决了RPA检测方法稳定性不足的难题，可以有效的控制检测误差。

<110> 西北农林科技大学

<120> 牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重RPA检测试剂盒

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<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> F1

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<210> 4

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<212> DNA

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<210>11

<211>470

<212>DNA

<213> BPIV-3

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<211> 403

<212> DNA

<213> BRSV

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cgtacaagca gaaatggaac aggttgtaga agtctatgaa tatgcacaaa agttaggtgg 240

agaagctggt ttttatcaca tattgaacaa ccctaaagca tcattgttat ccttaacaca 300

attccccaac ttctctagtg tagtcctagg caatgctgca ggactaggta taatgggtga 360

gtatagaggt acaccaagaa accaagactt gtatgatgct gcc 403

Claims

1.一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测引物组，其特征在于：该RPA检测引物组包括牛副流感病毒反转录本扩增引物对P1以及牛呼吸道合胞体病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F2：5'-GAGTATGATCAAGACAATATGTTGCAAAATGG-3'

下游引物R3：5'-CTGATTGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCTG-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'3：5'-GGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGG-3'

下游引物R'2：5'-CTCCACCTAACTTTTGTGCATATTCATAGACTTC-3'。

2.一种牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括RPA检测引物组；所述RPA检测引物组包括牛副流感病毒反转录本扩增引物对P1以及牛呼吸道合胞体病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F2：5'-GAGTATGATCAAGACAATATGTTGCAAAATGG-3'

下游引物R3：5'-CTGATTGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCTG-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'3：5'-GGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGG-3'

下游引物R'2：5'-CTCCACCTAACTTTTGTGCATATTCATAGACTTC-3'。

3.根据权利要求2所述的双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，引物的工作浓度为5~20 μM。

4.根据权利要求3所述的双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，根据扩增片段的大小差异，扩增片段较小的引物对P2在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大的引物对P1在该反应体系中的含量。

5.根据权利要求3所述的双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，F2:R3:F'3:R'2的用量体积比为（1.1~1.2）:（1.1~1.2）:（1.2~1.3）:（1.2~1.3）。