CN112853000B

CN112853000B - 牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重rpa检测试剂盒

Info

Publication number: CN112853000B
Application number: CN202110156326.3A
Authority: CN
Inventors: 赵晓民; 童德文; 王凯丽; 刘志豪
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112853000A

Abstract

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，包括分别由SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.13以及SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.18所示核苷酸序列组成的牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒以及牛轮状病毒的RPA检测引物组。所述试剂盒基于重组酶聚合酶扩增法，以利用RNA反转录形成的cDNA为模板进行扩增反应，利用核酸凝胶电泳获得检测结果。本发明可用于同时对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒进行检测，操作简单，并且具有较高的灵敏度和特异性，为牛腹泻病毒的现场筛查提供了快速检测试剂。

Description

牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

腹泻是牛常见的一类疾病。引起牛腹泻发生的原因有很多种，其中病毒感染是主要原因。随着养牛规模的扩大，犊牛腹泻的发病率呈上升趋势，危害最为严重。就目前情况来看，引起牛腹泻的病毒主要包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)。

BVDV属于黄病毒科、瘟病毒属，其基因组为单股正链RNA，BVDV的天然宿主包括猪和牛、羊等多种反刍动物，可引起发热、黏膜糜烂、腹泻，也可以引起母牛繁殖障碍。牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)是由BVDV引起的牛接触性传染病。BCoV属于套式病毒目、冠状病毒科、β病毒属、β冠状病毒属A进化群，其基因组为单股正链RNA，编码5种结构蛋白。BCoV能引起的疾病包括犊牛腹泻(Calf diarrhea,CD)和成年牛冬痢(Winter dysentery of adultcattle,WD)以及呼吸道疾病。犊牛冠状病毒病多见于1～90日龄，而腹泻常发生于1～2周龄，与轮状病毒感染很相似，而且二者容易混合发生。BRV属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属。BRV基因组由一个11段双链RNA组成的，共编码6种结构蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和5种非结构蛋白(NSP1～NSP5)。牛轮状病毒病是能够导致多种低龄动物急性腹泻的传染病，并且BRV能在牛中持续存在，表现出高感染率，感染BRV可引起犊牛精神轻度沉郁、酸中毒，并会出现食欲废绝及水样腹泻等临床症状，经常伴有牛冠状病毒及大肠杆菌感染而导致死亡。在发生腹泻的犊牛中，常观察到多种病原的合并感染，其中，牛轮状病毒占27～36％，是引起犊牛腹泻的主要原因。

目前，用于检测牛腹泻病毒的方法主要包括病毒分离鉴定、抗原捕获ELISA法和IHC法、免疫过氧化物酶单层测定法(IPMA)、RT-PCR等。但这些方法耗费时间久、操作复杂，不适用于资源受限地区及突发传染病现场的应急检测，并且养牛场多位于偏远的地区，条件有限、交通不便，因此建立一种能够快速、敏感并且特异的检测多种牛腹泻病毒的方法非常必要。

重组酶聚合酶核酸等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)是由Piepenburg等建立的一种核酸等温扩增技术。RPA技术采用恒温扩增反应，模板不用进行热变性，短时间内即可完成扩增过程。同时，RPA技术操作简单，对设备要求低，使得利用其建立快速、便捷的现场病毒核酸检测技术成为可能。

目前仅见到应用RPA技术检测单一种类的牛腹泻病毒的报道，例如，涉及检测BVDV的中国专利CN104894118A和CN107974513A，以及涉及检测BRV的中国专利CN108546779A，而针对BCoV的检测尚未有报道涉及RPA技术。RPA相比于PCR，对引物设计的要求更为严苛，无法完全依照软件设计实现，筛选有效的特异性扩增引物和反应条件是实现多重RPA检测的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，可以实现一次对3种病毒的同时检测，具有广泛应用前景。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测引物组，该RPA检测引物组包括牛病毒性腹泻病毒反转录本扩增引物对P1、牛冠状病毒反转录本扩增引物对P2以及牛轮状病毒反转录本扩增引物对P3；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物Fv1：5'-GGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACA-3'(SEQ.ID.NO.1)

下游引物Rv2：5'-GATTTTTAGTAGCAATACAGTGGGCCTCTGCAGCA-3'(SEQ.ID.NO.5)；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物Fc1：5'-CAGCGTGTTGATGAGAACGGTGATAAATTAG-3'(SEQ.ID.NO.8)

下游引物Rc2：5'-GCCTACTAAGCCTACCTCCACCAATTTGTCTGC-3'(SEQ.ID.NO.13)；

所述引物对P3的核苷酸序列为：

上游引物Fr2：5'-CCAAACATTTTCCCTTACTCAGCGTCATTCAC-3'(SEQ.ID.NO.15)

下游引物Rr3：5'-CCAGCGACCTGAATTTCTGATCCCGCATTGAGCC-3'(SEQ.ID.NO.18)。

一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上述RPA检测引物组。

优选地，所述RPA检测引物组中，各引物的工作浓度均为5～20μM。

优选地，所述RPA检测引物组中，根据引物对扩增片段的大小差异，扩增片段最小的引物对P3在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大(与P3的扩增片段相比)的引物对P1和P2在该反应体系中的含量；扩增片段较小的引物对P1在所建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段最大的引物对P2并且小于扩增片段最小的引物对P3在该反应体系中的含量，从而确保3种病毒的RPA检测结果达到相对一致的稳定性，避免错误判读。

优选地，所述RPA检测引物组中，Fv1:Rv2:Fc1:Rc2:Fr2:Rr3的用量体积比为(1.1～1.2):(1.1～1.2):(1.0～1.1):(1.0～1.1):(1.2～1.3):(1.2～1.3)。

优选地，所述试剂盒还包括重组酶UvsX和DNA聚合酶(例如，含于RPA1Basic冻干粉中)、RPA缓冲液(例如，Rehydration Buffer)和MgOAc。

一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测方法，包括以下步骤：

1)从采集自待测牛的生物样品中提取RNA，以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，采用上述RPA检测引物组在同一个反应体系中进行RPA扩增，得到扩增产物；

2)将扩增产物进行核酸电泳检测，若电泳结果出现217bp条带，则所述生物样品含有感染获得的牛病毒性腹泻病毒；若电泳结果出现440bp条带，则所述生物样品含有感染获得的牛冠状病毒；若电泳结果出现112bp条带，则所述生物样品含有感染获得的牛轮状病毒；若电泳结果出现217bp、440bp、112bp中的任意两种或全部三种条带，则所述生物样品含有感染获得的牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒中相应两种或三种病毒(具体的：若电泳结果同时出现217bp和440bp的两种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒；若电泳结果同时出现217bp和112bp的两种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒；若电泳结果同时出现440bp和112bp的两种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的牛冠状病毒和牛轮状病毒；若电泳结果同时出现217bp、440bp和112bp的三种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒)；若电泳结果无条带出现，则所述生物样品不含有牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒。

优选地，所述反应体系包括5～20μM上游引物Fv1 1.1～1.2μL、5～20μM下游引物Rv2 1.1～1.2μL、5～20μM上游引物Fc1 1.0～1.1μL、5～20μM下游引物Rc2 1.0～1.1μL、5～20μM上游引物Fr2 1.2～1.3μL、5～20μM下游引物Rr3 1.2～1.3μL、280mmol/L MgOAc0.5～3μL、RPA缓冲液7～30μL以及≤2μL的模板。

优选地，所述反应体系中，模板是将提取自生物样品的总RNA反转录为cDNA而得到的，总RNA的用量为1000～2000ng。

优选地，所述RPA扩增的反应条件为：40～45℃扩增20～40min，冰上终止反应。

优选地，所述生物样品选自牛粪便。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过设计和筛选针对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒的RPA引物，实现了对3种病毒的三重RPA检测，检测结果采用核酸电泳分析进行判读，具有检测速度快、成本低、灵敏度和稳定性高，以及特异性强的优势，对基因扩增设备的要求低(不需要PCR仪)，方便在现场同时开展多种牛腹泻病毒的快速筛查。

进一步地，本发明利用所述的RPA检测引物组结合反应体系优化，在核酸电泳中可以获得更清晰的产物条带，降低了检测结果受到RPA扩增产物在反应期间发生降解的影响。

附图说明

图1为本发明实施例中BVDV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对Fv1-Rv1(扩增目的片段为225bp)；泳道2：引物对Fv1-Rv2(扩增目的片段为217bp)；泳道3：引物对Fv1-Rv3(扩增目的片段为185bp)；泳道4：引物对Fv1-Rv4(扩增目的片段为249bp)；泳道5：引物对Fv2-Rv1(扩增目的片段为255bp)；泳道6：引物对Fv2-Rv2(扩增目的片段为247bp)；泳道7：引物对Fv2-Rv3(扩增目的片段为215bp)；泳道8：引物对Fv2-Rv4(扩增目的片段为279bp)；泳道9：引物对Fv3-Rv1(扩增目的片段为261bp)；泳道10：引物对Fv3-Rv2(扩增目的片段为253bp)；泳道11：引物对Fv3-Rv3(扩增目的片段为221bp)；泳道12：引物对Fv3-Rv4(扩增目的片段为285bp)；泳道13：阴性对照(阴性对照的模板是ddH₂O)。

图2为本发明实施例中BCoV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对Fc1-Rc1(扩增目的片段为109bp)；泳道2：引物对Fc1-Rc2(扩增目的片段为440bp)；泳道3：引物对Fc2-Rc2(扩增目的片段为323bp)；泳道4：引物对Fc3-Rc2(扩增目的片段为188bp)；泳道5：引物对Fc4-Rc2(扩增目的片段为144bp)；泳道6：阴性对照。

图3为本发明实施例中BRV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000PlusMarker；泳道1：引物对Fr1-Rr1(扩增目的片段为267bp)；泳道2：引物对Fr1-Rr2(扩增目的片段为440bp)；泳道3：引物对Fr2-Rr1(扩增目的片段为453bp)；泳道4：引物对Fr2-Rr2(扩增目的片段为367bp)；泳道5：引物对Fr2-Rr3(扩增目的片段为112bp)；泳道6：阴性对照。

图4为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV目的片段的PCR扩增电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BVDV引物对Fv1-Rv2扩增产物(扩增目的片段为217bp)；泳道2：BCoV引物对Fc1-Rc2扩增产物(扩增目的片段为440bp)；泳道3：BRV引物对Fr2-Rr3扩增产物(扩增目的片段为112bp)。

图5为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增；泳道2：阴性对照。

图6为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增反应温度优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：30℃；泳道2：35℃；泳道3：40℃；泳道4：45℃；泳道5：50℃；泳道6：阴性对照。

图7为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增反应时间优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：10min；泳道2：20min；泳道3：30min；泳道4：40min；泳道5：50min；泳道6：阴性对照。

图8为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增反应特异性检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BCoV(440bp)；泳道2：BVDV(217bp)；泳道3：BRV(112bp)；泳道4：BRSV；泳道5：BPIV-3；泳道6：VSV；泳道7：FMDV；泳道8：BHV；泳道9：阴性对照。

图9为本发明实施例中BVDV、BCoV、BRV三重RPA扩增反应灵敏度检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：BVDV浓度为58.7ng/μL、BCoV浓度为60.9ng/μL、BRV浓度为69.5ng/μL；泳道2：BVDV浓度为5.87ng/μL、BCoV浓度为6.09ng/μL、BRV浓度为6.95ng/μL；泳道3：BVDV浓度为5.87×10^-1ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-1ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-1ng/μL；泳道4：BVDV浓度为5.87×10^-2ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-2ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-2ng/μL；泳道5：BVDV浓度为5.87×10^-3ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-3ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-3ng/μL；泳道6：BVDV浓度为5.87×10^-4ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^- ⁴ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-4ng/μL；泳道7：BVDV浓度为5.87×10^-5ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-5ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-5ng/μL；泳道8：BVDV浓度为5.87×10^-6ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-6ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-6ng/μL；泳道9：BVDV浓度为5.87×10^-7ng/μL、BCoV浓度为6.09×10^-7ng/μL、BRV浓度为6.95×10^-7ng/μL；泳道10：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)引物设计与筛选

(1)在GeneBank中收集BVDV基因组序列(57条)，利用MegAlign对序列进行比对分析，选取种内保守且种间特异的5’UTR区作为BVDV的检测靶基因；根据文献资料选择BCoV的RdRp基因、BRV的VP6基因作为检测靶基因，进一步比对靶基因序列，确定拟扩增的基因序列候选区域，然后根据确定的基因序列设计引物。

采用以下引物筛选原则，剔除根据引物碱基互补配对等引物一般设计要求获得的候选引物中不符合以下要求的引物，从而提高了引物筛选效率：

A.引物长度在30～35bp之间；

B.引物的TM值不作为参考，但是GC含量应在40％～60％之间；

C.引物不存在发卡结构，避免二聚体和错配；

D.引物的5'端前3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤，3'端最后4个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤；

E.引物中避免出现特殊结构，例如，回文序列、长串的聚嘌呤或聚嘧啶(不超过6个)等。

筛选出的引物送上海生工合成，上、下游引物序列如下。

BVDV上游引物：

Fv1：5'-GGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACA-3'(SEQ.ID.NO.1)

Fv2：5'-GACTAGCAAAATGAGGGGGGTAGCAACAGTGGTGA-3'(SEQ.ID.NO.2)

Fv3：5'-TAGTAGGACTAGCAAAATGAGGGGGGTAGCAACAG-3'(SEQ.ID.NO.3)

BVDV下游引物：

Rv1：5'-ACAGCAGAGATTTTTAGTAGCAATACAGTGGGCCT-3'(SEQ.ID.NO.4)

Rv2：5'-GATTTTTAGTAGCAATACAGTGGGCCTCTGCAGCA-3'(SEQ.ID.NO.5)

Rv3：5'-GCACCCTATCAGGCTGTATTCGTAACGGTTGGTTA-3'(SEQ.ID.NO.6)

Rv4：5'-TGTAATCAACTCCATGTGCCATGTACAGCAGAGAT-3'(SEQ.ID.NO.7)

BCoV上游引物：

Fc1：5'-CAGCGTGTTGATGAGAACGGTGATAAATTAG-3'(SEQ.ID.NO.8)

Fc2：5'-GTGGCTGAACACGATTTCTTTACATTTG-3'(SEQ.ID.NO.9)

Fc3：5'-CTGCTTTGTGACATTCTCTCTATATATGCTGG-3'(SEQ.ID.NO.10)

Fc4：5'-CTACTTTACTAAGAAGGATTGGTATGATTTTGTTG-3'(SEQ.ID.NO.11)

BCoV下游引物：

Rc1：5'-CAATCTTTTACACGCTCATAGCATTCCATC-3'(SEQ.ID.NO.12)

Rc2：5'-GCCTACTAAGCCTACCTCCACCAATTTGTCTGC-3'(SEQ.ID.NO.13)

BRV上游引物：

Fr1：5'-GTGTTGACTACAGCTACAATAACTCTTTTACCAG-3'(SEQ.ID.NO.14)

Fr2：5'-CCAAACATTTTCCCTTACTCAGCGTCATTCAC-3'(SEQ.ID.NO.15)

BRV下游引物：

Rr1：5'-CCGCTACCGCTGGTGTCATATTTGGTGGTCTCATC-3'(SEQ.ID.NO.16)

Rr2：5'-CTTGCTTGGTAAGTATTTATTATCTGCCCG-3'(SEQ.ID.NO.17)

Rr3：5'-CCAGCGACCTGAATTTCTGATCCCGCATTGAGCC-3'(SEQ.ID.NO.18)

(2)病毒核酸提取

采用Trizol法提取3种病毒的总RNA(病毒分离于陕西杨凌，分离时间2019年9月)。病毒液中加入Trizol，室温放置10min使其充分裂解。12000g、4℃离心10min后加入200μL氯仿，震荡至乳白色，室温静置10min。12000g、4℃离心15min。将上清移入另一EP管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻颠倒混匀液体，-80℃放置过夜。7500g、4℃离心10min，弃去上清，用75％的乙醇(RNase free，4℃)洗涤2次。室温干燥10min，加入适量DEPC水溶解，-80℃保存备用。

(3)逆转录合成病毒cDNA

加入步骤(2)提取的病毒核酸(2000ng)、随机引物(200ng/μL)1μL，70℃反应5min，迅速置于冰上冷却，然后向体系中加入5×RT buffer 5μL、dNTPs 5μL、反转录酶M-MLV 1μL、ddH₂O补体系至25μL，37℃孵育1h后4℃终止反应，-20℃保存备用。

(4)RPA的反应体系

50μL反应体系：步骤(3)模板(逆转录合成的cDNA)1μL、Rehydration Buffer 29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、ddH₂O 12.2μL以及280mM MgOAc 2.5μL。

(4)RPA恒温扩增反应

将配好的50μL体系加入一管RPA0Basic冻干粉(含重组酶)中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(5)依据扩增结果筛选引物

将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，BVDV引物筛选结果如图1所示，其中引物对Fv1-Rv2和Fv1-Rv4扩增出特异性条带，且引物对Fv1-Rv2扩增出的条带更亮(即扩增稳定性和产物含量更高)，因此BVDV选用引物对Fv1-Rv2进行后续实验；BCoV引物筛选结果如图2所示，引物对Fc1-Rc2扩增出特异性条带，因此BCoV选用引物对Fc1-Rc2进行后续实验；BRV引物筛选结果如图3所示，引物对Fr2-Rr1扩增出的条带亮度最好，但是存在非特异性扩增条带，引物对Fr2-Rr3的特异性最好，因此BRV选用引物对Fr2-Rr3进行后续实验。

(二)标准质粒构建

(1)目的片段扩增

以病毒cDNA为模板，利用以上筛选好的引物，按20μL PCR体系(2×Taq PCR Mix10μL、10mM上、下游引物各1μL、病毒cDNA 1μL，及ddH₂O 7μL)进行目的片段扩增，扩增条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃30min。扩增完成后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，并用胶回收试剂盒纯化目的片段。PCR扩增结果如图4所示。

(2)连接转化

将上述胶回收产物连接至pMd19-T载体(TaKaRa公司)，将连接产物加入到DH5α感受态细胞中(冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2min)。将菌液转移至无抗性的LB培养基中，在37℃、220rpm的条件下振荡培养45min。取50μL菌液，均匀涂布于含有氨苄的LB培养平板上，37℃恒温过夜培养。

(3)阳性克隆的筛选及鉴定

挑取LB培养平板上的单克隆菌落，加入到5mL具有氨苄抗性的LB培养基中，在37℃、220rpm条件下振荡培养12h。使用对应的引物，做菌液PCR验证(扩增对应的目的片段)、测序，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒备用。

(三)BVDV、BCoV、BRV三重RPA检测方法建立

以反转录得到的病毒cDNA为模板，利用筛选出的引物组(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2和Fr2-Rr3)进行RPA恒温扩增反应。

(1)三重RPA反应体系为50μL：BVDV、BCoV、BRV cDNA各0.5μL、Rehydration Buffer29.5μL、10μM BVDV上、下游引物各1.2μL、10μM BCoV上、下游引物各1.1μL、10μM BRV上、下游引物各1.3μL、ddH₂O 9.3μL，及280mM MgOAc 2.5μL。

将配好的50μL体系加入一管RPA0Basic冻干粉中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(2)将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，三重RPA反应体系成功扩增出BVDV的大小为217bp条带，BCoV的大小为440bp条带以及BRV的大小为112bp条带。

(3)利用上述三重RPA反应体系，将扩增反应温度设置为：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，分别进行RPA扩增40min，扩增结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应温度下的扩增产物检测结果如图6所示。结果表明，在40℃时，条带最为清晰且亮度较高，因此确定最佳反应温度为40℃。

(4)利用上述三重RPA反应体系，将扩增反应时间设置为：10min、20min、30min、40min、50min，在确定的最佳反应温度40℃下进行RPA扩增，扩增结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应时间下的扩增产物检测结果如图7所示。结果表明，20min时条带最为清晰，因此确定最佳反应时间为20min。

(四)检测特异性

分别以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(BHV)的基因序列为模板，其中，BVDV、BCoV、BRV的模板是反转录得到的病毒cDNA，按2000ng反转录，加入0.5μL；其余病毒的模板是人工构建的基因片段，模板含量30～50ng，加入0.5μL(BPIV-3扩增的目的片段位于NP基因内，BRSV扩增的目的片段位于N基因内，VSV扩增的目的片段位于N基因内，FMDV扩增的目的片段位于3D基因内，BHV扩增的目的片段位于gB基因内)。

利用(一)中筛选出的引物组(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2、Fr2-Rr3)和(三)中确定的最佳反应时间和温度进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示。结果表明，针对引物组(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2、Fr2-Rr3)建立的RPA反应体系和反应条件能够快速准确的检测出BVDV、BCoV和BRV，而且引物组不与另外5种病原体发生非特异性扩增，表明引物组(Fv1-Rv2、Fc13-Rc2、Fr2-Rr3)特异性高、通用性好。

(五)检测灵敏度

为了考察本发明针对BVDV、BCoV、BRV建立的三重RPA检测方法的灵敏度，用nanodrop 2000超微量分光光度计检测(二)中构建获得的标准质粒的浓度(BVDV：58.7ng/μL；BCoV：60.9ng/μL；BRV：69.5ng/μL)，并进行10倍梯度稀释后作为模板，按照(一)中筛选出的引物组(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2、Fr2-Rr3)，以及(三)中确定的三重RPA反应体系及最佳反应温度和时间进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示。结果表明，以上建立的三重RPA检测方法的最低检测限为1×10^-5ng/μL，具有很高的灵敏度。

(六)检测实例

为了考察本发明建立的BVDV、BCoV、BRV三重RPA检测方法对实际样本的检测效果，随机采集67份牛粪便样品，采用Trizol法提取总RNA(2000ng)，以反转录得到的cDNA为模板，同时以标准质粒为阳性对照，以ddH₂O为阴性对照，按照(一)中筛选出的引物组(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2、Fr2-Rr3)，以及(三)中确定的三重RPA反应体系(模板为0.5μL)和最佳反应温度和时间进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。同时使用聚合酶链式扩增反应(PCR法)检测样本。检测结果见表1。

RPA扩增产物检测结果判读：使用琼脂糖凝胶电泳检测后，检测结果中若出现217bp条带，则待测样品来自感染BVDV的个体；若出现440bp条带，则待测样品来自感染BCoV的个体；若出现112bp条带，则待测样品来自感染BRV的个体；若同时出现217bp和440bp条带，则待测样品来自同时感染BVDV和BCoV的个体；若同时出现217bp和112bp条带，则待测样品来自同时感染BVDV和BRV的个体；若同时出现440bp和112bp条带，则待测样品来自同时感染BCoV和BRV的个体；若同时出现217bp、440bp和112bp条带，则待测样品来自同时感染BVDV、BCoV和BRV的个体；若无条带出现，则待测样品来自未感染BVDV、BCoV和BRV的个体。

表1.应用不同方法检测牛粪便样品结果

由表1可知，本发明建立的三重RPA检测方法与现有PCR检测方法的结果一致，表明本发明的三重RPA检测方法能够用于BVDV、BCoV和BRV的实际检测，且由于该方法无需使用复杂的仪器设备，可一次性对3种病毒实现同时检出，反应时间更短，更适合在条件受限地区及突发传染病的现场进行检测。

为了方便上述三重RPA检测方法的应用，本发明提出了BVDV、BCoV、BRV三重RPA检测试剂盒，该试剂盒包括RPA检测引物组的成套核酸(Fv1-Rv2、Fc1-Rc2、Fr2-Rr3)、TwistDx冻干态(RPA)试剂(内含RPA Basic冻干粉、Rehydration Buffer、MgOAc)。

本发明具有以下优点：

(1)本发明检测方法操作简单，不需要昂贵复杂的仪器设备，非常适用于资源受限地区或实验室快速检测。

(2)本发明可以在一个反应体系内同时检测出BVDV、BCoV、BRV 3种病毒，显著缩短了检测时间，在提高检测效率的同时节约了成本，具有良好的应用前景。

(3)本发明的RPA检测引物组是针对BVDV、BCoV、BRV保守基因序列设计，利用该引物组对牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒进行检测，均未扩增出条带，表明引物组的特异性强。

(4)本发明对BVDV、BCoV、BRV的检测灵敏度高，可达到10^-5ng/μL。

(5)本发明的检测结果通过核酸凝胶电泳分析进行判读，通过对RPA引物的筛选以及优化RPA反应体系，提高了检测结果的稳定性，可以同时获得3种病毒的清晰的扩增产物电泳条带，从而在降低检测成本的同时，解决了RPA检测方法稳定性不足的难题，可以有效的控制检测误差。

<110> 西北农林科技大学

<120> 牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒

<160> 18

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Fv1

<400> 1

ggtgagttcg ttggatggct gaagccctga gtaca 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Fv2

<400> 2

gactagcaaa atgagggggg tagcaacagt ggtga 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Fv3

<400> 3

tagtaggact agcaaaatga ggggggtagc aacag 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Rv1

<400> 4

acagcagaga tttttagtag caatacagtg ggcct 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Rv2

<400> 5

gatttttagt agcaatacag tgggcctctg cagca 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Rv3

<400> 6

gcaccctatc aggctgtatt cgtaacggtt ggtta 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Rv4

<400> 7

tgtaatcaac tccatgtgcc atgtacagca gagat 35

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Fc1

<400> 8

cagcgtgttg atgagaacgg tgataaatta g 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> Fc2

<400> 9

gtggctgaac acgatttctt tacatttg 28

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Fc3

<400>10

ctgctttgtg acattctctc tatatatgct gg 32

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Fc4

<400>11

ctactttact aagaaggatt ggtatgattt tgttg 35

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Rc1

<400>12

caatctttta cacgctcata gcattccatc 30

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> Rc2

<400>13

gcctactaag cctacctcca ccaatttgtc tgc 33

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> Fr1

<400>14

gtgttgacta cagctacaat aactctttta ccag 34

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Fr2

<400>15

ccaaacattt tcccttactc agcgtcattc ac 32

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Rr1

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ccgctaccgc tggtgtcata tttggtggtc tcatc 35

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<211> 30

<212> DNA

<213> Rr2

<400>17

cttgcttggt aagtatttat tatctgcccg 30

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> Rr3

<400>18

ccagcgacct gaatttctga tcccgcattg agcc 34

Claims

1.一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测引物组，其特征在于：该RPA检测引物组包括牛病毒性腹泻病毒反转录本扩增引物对P1、牛冠状病毒反转录本扩增引物对P2以及牛轮状病毒反转录本扩增引物对P3；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物Fv1：5'-GGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACA-3'

下游引物Rv2：5'-GATTTTTAGTAGCAATACAGTGGGCCTCTGCAGCA-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物Fc1：5'-CAGCGTGTTGATGAGAACGGTGATAAATTAG-3'

下游引物Rc2：5'-GCCTACTAAGCCTACCTCCACCAATTTGTCTGC-3'；

所述引物对P3的核苷酸序列为：

上游引物Fr2：5'-CCAAACATTTTCCCTTACTCAGCGTCATTCAC-3'

下游引物Rr3：5'-CCAGCGACCTGAATTTCTGATCCCGCATTGAGCC-3'。

2.一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括RPA检测引物组，所述RPA检测引物组包括牛病毒性腹泻病毒反转录本扩增引物对P1、牛冠状病毒反转录本扩增引物对P2以及牛轮状病毒反转录本扩增引物对P3；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物Fv1：5'-GGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACA-3'

下游引物Rv2：5'-GATTTTTAGTAGCAATACAGTGGGCCTCTGCAGCA-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物Fc1：5'-CAGCGTGTTGATGAGAACGGTGATAAATTAG-3'

下游引物Rc2：5'-GCCTACTAAGCCTACCTCCACCAATTTGTCTGC-3'；

所述引物对P3的核苷酸序列为：

上游引物Fr2：5'-CCAAACATTTTCCCTTACTCAGCGTCATTCAC-3'

下游引物Rr3：5'-CCAGCGACCTGAATTTCTGATCCCGCATTGAGCC-3'。

3.根据权利要求2所述一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，各引物的工作浓度均为5～20μM。

4.根据权利要求3所述一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，根据引物对扩增片段的大小差异，扩增片段最小的引物对P3在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大的引物对P1和P2在该反应体系中的含量；扩增片段较小的引物对P1在所建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段最大的引物对P2并且小于扩增片段最小的引物对P3在该反应体系中的含量。

5.根据权利要求3所述一种牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，Fv1:Rv2:Fc1:Rc2:Fr2:Rr3的用量体积比为(1.1～1.2):(1.1～1.2):(1.0～1.1):(1.0～1.1):(1.2～1.3):(1.2～1.3)。