CN112266986B - 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112266986B
CN112266986B CN202011532195.6A CN202011532195A CN112266986B CN 112266986 B CN112266986 B CN 112266986B CN 202011532195 A CN202011532195 A CN 202011532195A CN 112266986 B CN112266986 B CN 112266986B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
virus
gapdh
orf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011532195.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112266986A (zh
Inventor
郭弘妍
王辉
毛沁心
陈翔
徐友春
王会丽
邓浩浩
李雅婷
程京
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CapitalBio Corp
Guangzhou National Laboratory
Original Assignee
Boao Biological Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boao Biological Group Co ltd filed Critical Boao Biological Group Co ltd
Priority to CN202011532195.6A priority Critical patent/CN112266986B/zh
Publication of CN112266986A publication Critical patent/CN112266986A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112266986B publication Critical patent/CN112266986B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒检测领域，特别涉及病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用。本发明病毒检测装置提供了一种简单易行的病毒核酸提取方法，整个过程大约5‑15分钟，回收纯化的核酸，可用于病毒核酸的检测。包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等。相比较于传统的病毒提取方法，本方法病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广。本发明涉及单管同时检测新型冠状病毒COVID‑19 N和ORF基因以及人源内参基因的等温扩增引物、探针组合序列和反应缓冲液，该体系特异性好，灵敏度高（50cp/mL），特异性高，只需20min的检测时间，最快可在10min左右报阳性。

Description

病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，特别涉及病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒是继2002年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和2012年暴发的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）之后，过去20年间在人类中出现的第3种高致病冠状病毒。核酸的检测是病原诊断的一个依据，也是目前确诊新冠感染的一个重要的依据。因此，开展核酸病毒检测，也是病毒感染筛查、病毒疾病防控的重要手段。临床和实际应用过程中，不但对病毒检测方法的特异性、灵敏度和准确度具有较高的要求，同时对病毒检测技术的易用性和时效性也提出了较高的要求。此外，对病毒样本的处理、病毒核酸的提取方法也大大影响病毒的检测时间和准确度。
目前的高通量新型冠状病毒核酸检测试剂盒基本采用反转录加实时聚合酶链式反应法（RT-PCR），扩增病原体的核酸(RNA)，同时通过荧光探针实时检测扩增产物。每个RT-PCR反应需要1.5-2小时的检测时间，特别是对检测灵敏度要求较高的(100 cp/mL)，一般需要核酸提取，通常最快3-4小时才可以报告结果。
核酸恒温扩增技术（Nucleic Acid Isothermal Amplification，NAIA）则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行，对扩增所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，与PCR相比,该技术具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。在病毒核酸检测，筛查发具有很高的应用价值。然而，目前的恒温扩增技术均存在以下几个问题：
（1）目前常用核酸提取技术提取流程复杂、时间长且核酸提取效率较低，无法满足临床检测需求；常用的病毒核酸提取纯化技术有Trizol法、离心柱法、磁珠法等方法。Trizol法利用DNA、RNA、蛋白质在有机层和水相层分布位置的不同而分离蛋白质与核酸，在获得核酸的过程中会用到苯酚、氯仿异戊醇、异丙醇、乙醇等对人体有害的挥发性有机溶剂，对操作人员存在较大的健康危害，且Trizol法提取核酸步骤繁琐，对不同的样本提取效果重复性不佳，从样本裂解到获得核酸至少需要1.5h，其操作繁琐、耗时长，不宜在临床检测使用。常规的离心吸附柱及磁珠法提取核酸时需要用乙醇或异丙醇进行结合，需要加入乙醇清洗，这种加入醇类清洗的方式使得核酸提取试剂在使用时操作相对复杂，耗时较长，乙醇去除不干净还会抑制后续反应。
（2）等温扩增体系扩增效率极高，在对靶标的扩增过程中，不可避免的引入了不必要的非特异扩增，使得结果难以判断，对于非特异扩增，非特异性荧光染料掺入法对于产物的特异性也无能为力，需要对产物进一步的分析，如cas酶切鉴定等。但涉及开盖，极易造成气溶胶污染等环境污染，不利于临床检测使用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用。该试剂盒包含特异性好，灵敏度高的扩增引物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了病毒核酸提取或保存试剂，包括组分1和组分2；
所述组分1包括磁珠；所述磁珠含有oligodT14-20；
所述组分2为裂解保存液；所述裂解保存液包括如下组分：
十二烷基硫酸锂 0.01 %~0.05 %（w/w，质量百分比）
TritonX-100 0.5 %~3 %（v/v，体积百分比）
异硫氰酸胍 0.5 M~1.5 M
Tris 0.01 M~0.1 M
NaCl 0.1 M~0.2 M
在本发明的一些具体实施方案中，所述的病毒核酸提取或保存试剂还包括组分3，所述组分3包括清洗液，所述清洗液包括如下组分：
TritonX-100 0.05 %~0.2 %（v/v，体积百分比）
KCl 0.05 M~0.2 M
在本发明的一些具体实施方案中，所述的病毒核酸提取或保存试剂还包括组分4，所述组分4包括洗脱液，所述洗脱液包括如下组分：
Tris 10 mM~100 mM
EDTA 1 mM~10 mM
基于上述研究，本发明还提供了所述的病毒核酸提取或保存试剂在制备病毒核酸检测试剂盒中的应用；所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
更重要的是，本发明还提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：
引物组合一：根据COVID-19的N基因序列获得的RT-LAMP的引物组合
（1）、N1-F3：具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（2）、N1-B3：具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
（3）、N1-FIP：具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
（4）、N1-BIP：具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
（5）、N1-LF：具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
（6）、N1-LB：具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
（7）、如（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（8）、与（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
探针组合一：COVID-19 N基因荧光探针
（9）、N-BHQ1：具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
（10）、N-ROX：具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或
（11）、如（9）或（10）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（9）或（10）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（12）、与（9）或（10）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
引物组合二：根据COVID-19的ORF基因序列获得的RT-LAMP的引物组合
（13）、19cov-ORF-1-F3：具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；和
（14）、19cov-ORF-1-B3：具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
（15）、19cov-ORF-1-FIP：具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和
（16）、19cov-ORF-1-BIP：具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；和
（17）、19cov-ORF-1-LF：具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
（18）、19cov-ORF-1-LB：具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；或
（19）、如（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（20）、与（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
探针组合二：COVID-19 ORF基因荧光探针
（21）、ORF-BHQ1：具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；和
（22）、ORF-FAM：具有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；或
（23）、如（21）或（22）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）或（22）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（24）、与（21）或（22）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
引物组合三：内参基因GAPDH基因RT-LAMP引物组合
（25）、GAPDH-F3-5p：具有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；和
（26）、GAPDH-B3-5p：具有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；和
（27）、GAPDH-LF-5p：具有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；和
（28）、GAPDH-LB-5p：具有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；和
（29）、GAPDH-FIP-5p：具有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；和
（30）、GAPDH-BIP-5p：具有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；或
（31）、如（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（32）、与（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
探针组合三：GAPDH基因探针
（33）、GAPDH-BHQ1：具有如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；和
（34）、GAPDH-HEX：具有如SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；或
（35）、如（33）或（34）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（33）或（34）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（36）、与（33）或（34）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个或3个。
本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用；所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
此外，本发明还提供了病毒扩增的RT-LAMP试剂，包括如下组分：
Tris-HCl 10 mM~20 mM
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 5 mM~20 mM
KCl 25 mM~100 mM
Tween 20 0.05 %~0.5% （v/v，体积百分比）
Bst聚合酶 0.25 U/μL~0.5 U/μL
耐高温逆转录酶 1 U/μL~5 U/μL
Mg<sup>2+</sup> 6 mM~10 mM
牛磺酸 25 mM~100 mM
PEG35000 0.5%~2% （w/v，质量体积比）
本发明还提供了所述的病毒扩增的RT-LAMP试剂在制备病毒检测的试剂盒中的应用；所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
更重要的是，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的病毒核酸提取或保存试剂、所述的引物探针组合和/或所述的病毒扩增的RT-LAMP试剂以及可接受的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
基于上述研究，本发明还提供了一种病毒检测方法，取待测样本与所述试剂盒中所述的病毒核酸提取或保存试剂、所述的引物探针组合和/或所述的病毒扩增的RT-LAMP试剂混合后扩增，检测。
本发明的有益效果包括但不限于：
（1）本发明病毒检测装置提供了一种简单易行的病毒核酸提取方法，整个过程大约5-15分钟，回收纯化的核酸，可用于病毒核酸的检测。包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等。相比较于传统的病毒提取方法，本方法病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广。
（2）本专利涉及单管同时检测新型冠状病毒COVID-19 N和ORF基因以及人源内参基因的等温扩增引物、探针组合序列和反应缓冲液，该体系特异性好，灵敏度高（50 cp/mL），特异性高，只需20 min的检测时间，最快可在10 min左右报阳性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示扩增结果；其中，图1A示本发明试剂扩增产物的cas酶切结果；图1B示商业化对比试剂的cas酶切结果；
图2示本发明N引物和文献引物扩增效果对比；
图3示IC基因为GAPDH时的扩增结果；
图4示N、ORF、GAPDH三重扩增的检测结果；
图5示实施例15中不同提取试剂提取核酸的检测结果；其中，图5A示实施例3所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图；图5B示实施例4所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图；
图6示实施例16中50 copies/mL假病毒咽拭子的检测结果。
具体实施方式
本发明公开了病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的技术方案包括：
（1）本发明提供了一种便捷的病毒核酸保存和快速提取试剂，包括组分1为含有oligodT14-20的磁珠。组分2为裂解保存液，其组成为十二烷基锂、TritonX-100、异硫氰酸胍、Tris、NaCl。组分3为清洗液（可选），其组成为TritonX-100、KCl。组分4为洗脱液（可选），其组成为Tris和EDTA。其中组分2，具有保存病毒和促进病毒颗粒释放核酸与磁珠结合的双重作用，采用偶连有通用性或特异性寡核酸的磁珠对病毒核酸进行捕获，无需清洗（或经简单无醇溶液清洗），即可用于下游的病毒检测生物反应，包括PCR、恒温扩增等检测技术。整个病毒核酸提取纯化过程大约5-15分钟。相比较于传统的病毒提取方法，本方法病毒核酸提取不含有乙醇等清洗步骤、回收率高、用时少、操作方便、适用于自动化核酸提取装置，易于临床推广。
（2）病毒核酸保存和快速提取试剂中，组分2具体组成为十二烷基硫酸锂（0.01%-0.05%）、TritonX-100（0.5%-3%）、异硫氰酸胍（0.5-1.5M）、Tris (0.01-0.1M)、NaCl（0.1M-0.2M）。其中可优选十二烷基硫酸锂（终浓度0.016%）、TritonX-100（终浓度1.64%）、异硫氰酸胍（终浓度1.03M）、Tris pH=8.0（终浓度0.042M）、NaCl（终浓度0.21M）。组分3为清洗液（可选），其组成为TritonX-100（0.05%-0.2%）、KCl（0.05M-0.2M）。其中可优选TritonX-100（终浓度0.1%）、KCl（0.1M）。组分4为洗脱液（可选），其组成为Tris (10-100 mM)、EDTA (1-10 mM)。可优选Tris终浓度100 mM、EDTA终浓度10 mM。
（3）一组高效、特异性强、灵敏度高的COVID-19病毒N基因RT-LAMP引物组。具体序列如下：
N1-F3 CCGCAAATTGCACAATTT
N1-B3 CCTTTTTAGGCTCTGTTGGTG
N1-FIP GTGTAGGTCAACCACGTTCCCCTTCAGCGTTCTTCGGAAT
N1-BIP AGCTGCCATCAAATTGGATGACGTTTTGTATGCGTCAATATGCTT
N1-LF GTGTGACTTCCATGCCAATGC
N1-LB AAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGC
（4）一组高效、特异性强、灵敏度高的COVID-19病毒N基因探针。其特点为针由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。本发明COVID-19 N基因荧光探针的oligo可如下所示：
N-BHQ1：5’-BHQ1-GTGTAGGTCAACCACGTTCCCCTTCAGCGTTCTTCGGAAT-3’
N-ROX: 5’-GGAACGTGGTTGACCTACAC-ROX-3’
将N-BHQ1和N-ROX混合后退火，即为N基因探针，标记为BA_N_probe。
（5）一组高效、特异性强、灵敏度高的COVID-19病毒ORF基因RT-LAMP引物组。具体序列如下：
19cov-ORF-1-F3 ATCGTGTTGTCTGTACTG
19cov-ORF-1-B3 GTTCGCGGAGTTGATCACA
19cov-ORF-1-FIP CAAGTTGTAGGTATTTGTACATACGTTGCCACATAGATCATCCAAAT
19cov-ORF-1-BIP GACCCTGTGGGTTTTACACTTAATACAGCCATAACCTTTCCACATA
19cov-ORF-1-LF AGTCACAAAATCCTTTAG
19cov-ORF-1-LB ACAGTCTGTACCGTCTGC
（6）一组高效、特异性强、灵敏度高的COVID-19病毒ORF基因探针。其特点为针由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。本发明COVID-19 N基因荧光探针的oligo可如下所示：
ORF-BHQ1：5’-BHQ1- GACCCTGTGGGTTTTACACTTAATACAGCCATAACCTTTCCACATA-3’
ORF-FAM: 5’-TTAAGTGTAAAACCCACAGGGTC-FAM-3’
将ORF-BHQ1和ORF-FAM混合后退火，即为ORF基因探针，标记为BA_ORF_probe。
（7）一组内参基因GAPDH的RT-LAMP引物组。其特点是以人基因GAPDH序列为参考，设计内参基因GAPDH基因RT-LAMP引物组合，该引物组合包括6条oligo。具体如下所示：
GAPDH-F3-5p GGACTCATGACCACAGTCCA
GAPDH-B3-5p GCTTCCCGTTCAGCTCAG
GAPDH-LF-5p GGAGGGGCCATCCACAGTC
GAPDH-LB-5p GCCTCTACTGGCGCTGC
GAPDH-FIP-5p CGGCCATCACGCCACAGTTTCCATCACTGCCACCCAGA
GAPDH-BIP-5p GGGGCTCTCCAGAACATCATCCGATGACCTTGCCCACAGC
（8）一组内参基因GAPDH的RT-LAMP 探针。其特点是由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2等量混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。本发明中的一个实施例中，GAPDH基因探针序列如下：
GAPDH-BHQ1：5’-BHQ1-GGGGCTCTCCAGAACATCATCCGATGACCTTGCCCACAGC-3’
GAPDH-HEX:5’-GATGATGTTCTGGAGAGCCCC-HEX-3’
将GAPDH-BHQ1和GAPDH-HEX混合后退火，即为GAPDH基因探针。
（9）本发明涉及一种高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20mM）、(NH4)2SO4 （5-20 mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20（0.05-0.5%）、Bst聚合酶（0.25-0.5U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5 U/μL）、Mg2+（6-10 mM）、牛磺酸（25-100 mM）、PEG35000（0.5-2%）。
本发明的有益效果包括但不限于：
（1）本发明提供了了一款用于新型冠状病毒COVID-19核酸检测的试剂盒，试剂盒包括病毒核酸提取、新型冠状病毒COVID-19核酸N基因和ORF1ab基因的RT-LAMP引物及探针、内参基因扩增引物及探针。本试剂盒全过程均在同一温度下进行，对扩增所需仪器的要求大大简化，试剂成本经济，一次可检测96份样本，适用于高通量新冠病毒核酸检测，从核酸提取到检测结果仅需25~35 min，反应时间较PCR大大缩短，检测灵敏度可达50 拷贝/mL，具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。
（2）本发明提供了一种便捷的病毒核酸保存和快速提取试剂，包括组分1为含有oligodT14-20的磁珠。组分2为裂解保存液，其组成为十二烷基锂、TritonX-100、异硫氰酸胍、Tris、NaCl。组分3为清洗液（可选），其组成为TritonX-100、KCl。组分4为洗脱液（可选），其组成为EB（Tirs和EDTA）。其中组分2，具有保存病毒和促进病毒颗粒释放核酸与磁珠结合的双重作用，采用偶连有通用性或特异性寡核酸的磁珠对病毒核酸进行捕获，无需清洗（或经简单无醇溶液清洗），即可用于下游的病毒检测生物反应，包括PCR、恒温扩增等检测技术。整个病毒核酸提取纯化过程大约5-15分钟。相比较于传统的病毒提取方法，本方法病毒核酸提取不含有乙醇等清洗步骤、回收率高、用时少、操作方便、适用于自动化核酸提取装置，易于临床推广。
（3）本发明涉及一组用于检测新型冠状病毒COVID-19核酸和人源内参基因的RT-LAMP引物组合及RT-LAMP荧光探针。本引物组合比目前文献报道的新冠病毒RT-LAMP引物组合灵敏度更高。
（4）本发明涉及一种高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20mM）、(NH4)2SO4 （5-20 mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20（0.05-0.5%）、Bst聚合酶（0.25-0.5U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5 U/μL）、Mg2+（6-10 mM）、牛磺酸（25-100 mM）、PEG35000（0.5-2%）。
本发明提供的病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：病毒核酸的提取试剂
具体组分配置可按照以下组成：
组分1为含有oligodT14-20的磁珠。
组分2为裂解保存液，其组成为：十二烷基硫酸锂（终浓度0.016%）、TritonX-100（终浓度1.64%）、异硫氰酸胍（终浓度1.03M）、Tris pH=8.0（终浓度0.042M）、NaCl（终浓度0.21M）。
（3）组分3为清洗液，其组成为：TritonX-100（终浓度0.1%）、KCl（0.1M）。
（4）组分4为洗脱液，其组成为：Tris终浓度100 mM、EDTA终浓度10 mM。
实施例2：病毒核酸的提取试剂
具体组分配置可按照以下组成：
组分1为含有oligodT14-20的磁珠。
组分2为裂解保存液，其组成为：十二烷基硫酸锂（0.01%）、TritonX-100（3%）、异硫氰酸胍（0.5M）、Tris (0.1M)、NaCl（0.1M）。
（3）组分3为清洗液，其组成为TritonX-100（0.05%）、KCl（0.2M）。
（4）组分4为洗脱液，其组成为Tris (10 mM)、EDTA (10 mM)。
实施例3：病毒核酸的提取试剂
具体组分配置可按照以下组成：
组分1为含有oligodT14-20的磁珠。
组分2为裂解保存液，其组成为十二烷基硫酸锂（0.05%）、TritonX-100（0.5%）、异硫氰酸胍（1.5M）、Tris (0.01)、NaCl（0.2M）。
（3）组分3为清洗液，其组成为TritonX-100（0.2%）、KCl（0.05M）。
（4）组分4为洗脱液，其组成为Tris (100 mM)、EDTA (1 mM)。
实施例4：病毒核酸的提取试剂
具体组分配置可按照以下组成：
组分1为含有oligodT14-20的磁珠。
组分2为裂解保存液，十二烷基硫酸锂（终浓度0.016%）、TritonX-100（终浓度1.64%）、异硫氰酸胍（终浓度1.03M）、Tris pH=8.0（终浓度0.042M）、NaCl（终浓度0.21M）。
实施例5：病毒核酸的提取试剂的制备
分别按照实施例1~4的配方，制备病毒核酸的提取试剂，步骤如下：
（1）捕获磁珠从4℃冰箱取出后，室温放置30 min后使用。
（2）取478 μL裂解结合液，加入12 μL捕获磁珠和400 μL咽拭子保存液，室温孵育4-10 min。
（3）磁力磁吸1-2 min，弃上清。磁珠可直接用于下游反应。
（4）也可于磁力架上继续加入600 μL漂洗液后，弃掉上清。加入30 μL ElutionBuffer重悬磁珠，65℃孵育1-3 min洗脱病毒RNA。
实施例6:COVID-19 RT-LAMP引物及探针的设计
（1）COVID-19 N基因RT-LAMP引物
根据COVID-19的N基因序列设计RT-LAMP的引物组合，本引物组合包括6条引物。具体引物信息如下：
表1
N1-F3 SEQ ID No.1 CCGCAAATTGCACAATTT
N1-B3 SEQ ID No.2 CCTTTTTAGGCTCTGTTGGTG
N1-FIP SEQ ID No.3 GTGTAGGTCAACCACGTTCCCCTTCAGCGTTCTTCGGAAT
N1-BIP SEQ ID No.4 AGCTGCCATCAAATTGGATGACGTTTTGTATGCGTCAATATGCTT
N1-LF SEQ ID No.5 GTGTGACTTCCATGCCAATGC
N1-LB SEQ ID No.6 AAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGC
（2）COVID-19 N基因探针设计
COVID-19 N基因探针由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。
本发明COVID-19 N基因荧光探针的oligo可如下所示：
N-BHQ1：5’-BHQ1-GTGTAGGTCAACCACGTTCCCCTTCAGCGTTCTTCGGAAT-3’（如SEQ IDNo.7所示）
N-ROX: 5’-GGAACGTGGTTGACCTACAC-ROX-3’（如SEQ ID No.8所示）
将N-BHQ1和N-ROX混合后退火，即为N基因探针，标记为BA_N_probe。
（3）COVID-19 ORF基因RT-LAMP引物
根据COVID-19的ORF基因序列设计RT-LAMP的引物组合，本引物组合包括6条引物。具体引物信息如下：
表2
19cov-ORF-1-F3 SEQ ID No.9 ATCGTGTTGTCTGTACTG
19cov-ORF-1-B3 SEQ ID No.10 GTTCGCGGAGTTGATCACA
19cov-ORF-1-FIP SEQ ID No.11 CAAGTTGTAGGTATTTGTACATACGTTGCCACATAGATCATCCAAAT
19cov-ORF-1-BIP SEQ ID No.12 GACCCTGTGGGTTTTACACTTAATACAGCCATAACCTTTCCACATA
19cov-ORF-1-LF SEQ ID No.13 AGTCACAAAATCCTTTAG
19cov-ORF-1-LB SEQ ID No.14 ACAGTCTGTACCGTCTGC
（4）COVID-19 ORF基因RT-LAMP探针设计
COVID-19 ORF基因探针由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。
本发明COVID-19 ORF基因荧光探针的oligo可如下所示：
ORF-BHQ1：5’-BHQ1- GACCCTGTGGGTTTTACACTTAATACAGCCATAACCTTTCCACATA-3’（如SEQ ID No.15所示）
ORF-FAM: 5’-TTAAGTGTAAAACCCACAGGGTC-FAM-3’（如SEQ ID No.16）
将ORF-BHQ1和ORF-FAM混合后退火，即为N基因探针，标记为BA_ORF_probe。
实施例7：IC基因的选择、IC基因的RT-LAMP引物及探针设计
（1）内参基因GAPDH的RT-LAMP引物
以人基因GAPDH序列为参考，设计内参基因GAPDH基因RT-LAMP引物组合，该引物组合包括6条oligo。具体如下所示：
表3
GAPDH-F3-5p SEQ ID No.17 GGACTCATGACCACAGTCCA
GAPDH-B3-5p SEQ ID No.18 GCTTCCCGTTCAGCTCAG
GAPDH-LF-5p SEQ ID No.19 GGAGGGGCCATCCACAGTC
GAPDH-LB-5p SEQ ID No.20 GCCTCTACTGGCGCTGC
GAPDH-FIP-5p SEQ ID No.21 CGGCCATCACGCCACAGTTTCCATCACTGCCACCCAGA
GAPDH-BIP-5p SEQ ID No.22 GGGGCTCTCCAGAACATCATCCGATGACCTTGCCCACAGC
（2）内参基因GAPDH基因探针
GAPDH基因探针由2条oligo退火组成，其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如（TMARA、BHQ1、BHQ2等）。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补，且在oligo2的3’端标记荧光基团如（FAM、HEX、VIC、ROX等）。将oligo1和oligo2等量混合后，退火形成一个双链结构，从而使的荧光基团和淬灭基团靠近，形成淬灭荧光探针。本发明中的一个实施例中，GAPDH基因探针序列如下：
GAPDH-BHQ1：5’-BHQ1-GGGGCTCTCCAGAACATCATCCGATGACCTTGCCCACAGC-3’（如SEQID No.23所示）
GAPDH-HEX:5’-GATGATGTTCTGGAGAGCCCC-HEX-3’（如SEQ ID No.24所示）
将GAPDH-BHQ1和GAPDH-HEX混合后退火，即为GAPDH基因探针，标记为GAPDH_probe。
实施例8：RT-LAMP扩增试剂
本发明涉及一种高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20 mM）、(NH4)2SO4 （5-20 mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20 （0.05-0.5%）、Bst聚合酶 （0.25-0.5 U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5 U/μL）、Mg2+（8 mM）、牛磺酸（50 mM）、PEG35000（1%）。其中Bst聚合酶可为Bst4.0 DNA/RNA Polymerase、BST1.0或BST 2.0，逆转录酶可为ThermoStable Vreverse transcriptase、Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶、SuperScript IV 逆转录酶。
实施例9：RT-LAMP扩增试剂
本发明涉及一种高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20 mM）、(NH4)2SO4 （5-20 mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20（0.05-0.5%）、Bst聚合酶（0.25-0.5U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5 U/μL）、Mg2+（6 mM）、牛磺酸（25 mM）、PEG35000 （0.5%）。其中Bst聚合酶可为Bst4.0 DNA/RNA Polymerase、BST1.0或BST 2.0，逆转录酶可为ThermoStable Vreverse transcriptase、Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶、SuperScript IV 逆转录酶。
实施例10：RT-LAMP扩增试剂
本发明涉及一种高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20 mM）、(NH4)2SO4 （5-20 mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20（0.05-0.5%）、Bst聚合酶（0.25-0.5 U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5 U/μL）、Mg2+（10 mM）、牛磺酸（100 mM）、PEG35000（2%）。其中Bst聚合酶可为Bst4.0 DNA/RNA Polymerase、BST1.0或BST 2.0，逆转录酶可为ThermoStable Vreverse transcriptase、Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶、SuperScript IV 逆转录酶。
实施例11：本发明RT-LAMP扩增试剂与商业化扩增试剂扩增效果比较
按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100 copies/mL的假病毒咽拭子涮洗液的病毒核酸或者不含假病毒的咽拭子涮洗液阴性对照核酸样品，分别采用上述实施例8提供的本发明RT-LAMP扩增试剂和商业化扩增试剂，65℃，25 min扩增，分别测试7个阳性样品。
（1）本发明体系配置如下:
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
Sample 20 μL
H<sub>2</sub>O 补充到40 μL
100 μM的BA_N-primer为100 μM的N1-F3、N1-B3、N1-FIP、N1-BIP、N1-LF、N1-LB等引物按照比例4:4:16:16:8:8进行混合。
（2）对比商业化扩增试剂（Bst 2.0 DNA Polymerase，NEB货号:M0275）。按其说明书配置。具体如下：
成份 40 µL体积
10×Isothermal Buffer 1×
dNTP (25mM each) 1.4 mM
Bst 2.0 DNA Polymerase 12.8 U
Warmstar RTx 0.8
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
BA_N-primer 5 μM
Sample 20 μL
H<sub>2</sub>O 补充到40 μL
100 μM的BA_N-primer为100 μM的N1-F3、N1-B3、N1-FIP、N1-BIP、N1-LF、N1-LB等引物按照比例4:4:16:16:8:8进行混合。
（3）扩增完成后，采用Cas12a酶切体系，对扩增结果进行确认和检测。EnGen LbaCas12a (Cpf1)购自NEB(M0653S)。Cas酶切体系如下：
总体系 体系（10 μL）
H<sub>2</sub>O 6.93
NEB Buffer2.1 0.88
EnGen Lba Cas12a(1μM ) 0.44
gRNA（1 μM） 0.55
reporter（20 μM） 0.22
LAMP 产物 1
（4）试验结果
图1A、图1B显示：使用商业化扩增试剂7个样品中仅有3个有扩增产物检出，而本发明所述扩增试剂7个样品全有扩增产物检出。
实施例12：本发明专利COVID-19 N基因RT-LAMP引物与文献RT-LAMP引物对比
（1）参考文献所发表COVID-19 N基因RT-LAMP引物组，具体序列如下：
表4
WX_N-F3 5’-AACACAAGCTTTCGGCAG-3’
WX_N-B3 5’-GAAATTTGGATCTTTGTCATCC-3’
WX_N-FIP 5’-TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGCCAAGGAAATTTTGGGGAC-3’
WX_N-BIP 5’-CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG-3’
WX_N-LF 5’-TTCCTTGTCTGATTAGTTC-3’
WX_N-LB 5’-ACCTTCGGGAACGTGGTT-3’
将上述COVID-19 N基因RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100 μM的储存液，按照4:4:16:16:8:8进行混合，标记为WX_N-primer（100 μM）。
同时，根据文献发表的COVID-19 N基因RT-LAMP引物序列，设计合成探针。
表5
WX_N_BIP_BHQ2 5’-BHQ2-CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG
WX_N_Bd_ROX AAGTGACTTCCATGCCAATGCG-ROX3’
将WX_N_BIP_BHQ2和WX_N_Bd_ROX混合后退火，标记为WX_N_probe。
（2）本发明实施例6中所述COVID-19 N基因RT-LAMP引物组和文献报道的RT-LAMP引物组比较，按照实施例1所述提取方法提取的100 copies/mL的假病毒咽拭子，同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和EB buffer作为对照。
（3）本发明所述RT-LAMP引物及探针按照以下体系配置RT-LAMP反应。
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)2SO4 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1.0%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
BA_N_probe 0.15 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
（4）文献所述RT-LAMP引物及探针按照以下体系配置RT-LAMP反应。
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1.0%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
牛磺酸 50 mM
WX_N-primer 5 μM
WX_N_probe 0.15 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
实验结果：实验结果（图2）显示本发明所述N引物比文献所述的引物的出峰时间早，扩增效果好。本发明所述RT-ALMP引物优于文献所述RT-ALMP引物。
实施例13：以GAPDH为IC内参基因的COVID-19 N基因的RT-LAMP检测试剂实验
（1）按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100 copies/mL的假病毒咽拭子，同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。
按照实施例8所述的RT-LAMP试剂配置体系，GAPDH、COVID-19 N基因的RT-LAMP引物及探针序列见实施例6和实施例7。
将上述实施例6的COVID-19 N基因RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100 μM的储存液，N1-F3、N1-B3、N1-FIP、N1-BIP、N1-LF、N1-LB按照4:4:16:16:8:8进行混合，标记为BA_N-primer。
将上述实施例7的RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100 μM的储存液，将GAPDH-F3-5p、GAPDH-B3-5p、GAPDH-LF-5p、GAPDH-LB-5p、GAPDH-FIP-5p、GAPDH-BIP-5p按照2:2:16:16:8:8进行混合，标记为GAPDH-primer。
按照以下体系配置RT-LAMP反应体系如下：
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)2SO4 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1.0%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
BA_N_probe 0.15 μM
GAPDH-primer 1.25 μM
GAPDH_probe 0.075 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
（2）将假病毒样品，NC样品和DEPC水经过实施例1的核酸提取试剂进行提取后。置于荧光定量PCR仪，65℃，反应25 min。
实验结果（图3）显示：针对含有100 copies/mL 假病毒的咽拭子，本发明提供的试剂可以完全检出，阳性检出时间可缩短到30 min以内。
实施例14：基于本发明扩增试剂新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒
本试剂盒可针对COVID-19 N基因、COVID-19 ORF基因进行检测，同时以的GAPDH为内参基因。具体配制方法如下：
高效病毒扩增的RT-LAMP试剂，组分包括Tris-HCl （10-20 mM）、(NH4)2SO4 （5-20mM）、KCl（25-100 mM）、Tween 20（0.05-0.5%）、Bst聚合酶（0.25-0.5 U/μL）、耐高温逆转录酶（1-5U/μL）、Mg2+（6-10 mM）、牛磺酸（25-100 mM）、PEG35000（0.5-2%）。其中Bst聚合酶为Bst4.0 DNA/RNA Polymerase（哈尔滨新海基因检测有限公司，货号A3805B），逆转录酶为ThermoStable V reverse transcriptase(哈尔滨新海基因检测有限公司，货号D0302B)，Mg2+终浓度优选8 mM、牛磺酸终浓度优选50 mM，PEG35000终浓度优选1%。
按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100 copies/mL的假病毒咽拭子，同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。
按照实施例8所述的RT-LAMP试剂配置体系，GAPDH、COVID-19 N基因、COVID-19ORF基因的RT-LAMP引物及探针序列见实施例6和实施例7。
将上述实施例6的COVID-19 N基因RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100 μM的储存液，N1-F3、N1-B3、N1-FIP、N1-BIP、N1-LF、N1-LB按照4:4:16:16:8:8进行混合，标记为BA_N-primer。
将上述实施例6的COVID-19 ORF基因RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100μM的储存液，将19cov-ORF-1-F3、19cov-ORF-1-B3、19cov-ORF-1-FIP、19cov-ORF-1-BIP、19cov-ORF-1-LF、19cov-ORF-1-LB按照4:4:16:16:8:8进行混合，标记为BA_ORF-primer。
将上述实施例7的RT-LAMP引物组分别采用DEPC-H2O配置成100 μM的储存液，将GAPDH-F3-5p、GAPDH-B3-5p、GAPDH-LF-5p、GAPDH-LB-5p、GAPDH-FIP-5p、GAPDH-BIP-5p按照2:2:16:16:8:8进行混合，标记为GAPDH-primer。
按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100 copies/mL的假病毒咽拭子涮洗液的病毒核酸或者不含假病毒的咽拭子涮洗液阴性对照核酸样品，采用上述本发明RT-LAMP扩增试剂，65℃，25 min扩增，测试7个阳性样品，7个阴性样品和2个EBbuffer作为对照。具体体系配置如下：
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25 mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
BA_N_probe 0.15 μM
BA_ORF-primer 5 μM
BA_ORF_probe 0.15 μM
GAPDH-primer 1.25 μM
GAPDH_probe 0.075 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
实验结果：实验结果显示本发明扩增试剂及所述N引物、ORF引物、GAPDH引物，针对提取的7个100copies/mL假病毒咽拭子样品、7个NC样品及2个EB buffer均能正确检测，具体如图4所示。
实施例15：不同配比提取试剂提取假病毒后的检测结果
按照实施例3和实施例4提供的提取试剂，按照实施例5所述提取方法提取的100copies/mL的假病毒咽拭子，同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。
按照实施例9所述的RT-LAMP体系和实施例14所述的引物及探针体系配置RT-LAMP反应体系。65℃，25 min扩增。具体体系配置如下：
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 6 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
BA_N_probe 0.15 μM
BA_ORF-primer 5 μM
BA_ORF_probe 0.15 μM
GAPDH-primer 1.25 μM
GAPDH_probe 0.075 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
实验结果：实施例3所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图（图5A）和实施例4所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图（图5B），结果显示实施例3所述提取试剂和实施例4提取的100copies/mL假病毒咽拭子样品、NC样品及EB buffer样品均能正确检测。
实施例16：50 copies/mL假病毒咽拭子的检测结果
按照实施例2提供的提取试剂，按照实施例5所述提取方法提取的50 copies/mL的假病毒咽拭子，同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子作为对照。补充水。
按照实施例10所述的RT-LAMP体系和实施例14所述的引物及探针体系配置RT-LAMP反应体系。65℃，25 min扩增。具体体系配置如下：
成份 终浓度
Tris-HCl（pH8.8） 20 mM
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10 mM
KCl 50 mM
Tween 20 0.1%
dNTP (25mM each) 1.4 mM
BST4.0 14.4 U
ThermoStable V RTase 80 U
PEG35000 1%
Mg<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 6 mM
牛磺酸 50 mM
BA_N-primer 5 μM
BA_N_probe 0.15 μM
BA_ORF-primer 5 μM
BA_ORF_probe 0.15 μM
GAPDH-primer 1.25 μM
GAPDH_probe 0.075 μM
Sample 20 μL
H2O 补充到40 μL
实验结果：50 copies/mL假病毒提取核酸后的扩增结果图（图6），N基因、ORF基因和GAPDH基因，50copies/mL假病毒咽拭子样品及NC样品均能正确检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用
<130> MP2029671
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcaaattg cacaattt 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctttttagg ctctgttggt g 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtaggtca accacgttcc ccttcagcgt tcttcggaat 40
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agctgccatc aaattggatg acgttttgta tgcgtcaata tgctt 45
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgtgacttc catgccaatg c 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatttcaaa gatcaagtca ttttgc 26
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgtaggtca accacgttcc ccttcagcgt tcttcggaat 40
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaacgtggt tgacctacac 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcgtgttgt ctgtactg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttcgcggag ttgatcaca 19
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagttgtag gtatttgtac atacgttgcc acatagatca tccaaat 47
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaccctgtgg gttttacact taatacagcc ataacctttc cacata 46
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtcacaaaa tcctttag 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acagtctgta ccgtctgc 18
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaccctgtgg gttttacact taatacagcc ataacctttc cacata 46
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttaagtgtaa aacccacagg gtc 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggactcatga ccacagtcca 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcttcccgtt cagctcag 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggaggggcca tccacagtc 19
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctctactg gcgctgc 17
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggccatcac gccacagttt ccatcactgc cacccaga 38
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggggctctcc agaacatcat ccgatgacct tgcccacagc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggggctctcc agaacatcat ccgatgacct tgcccacagc 40
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gatgatgttc tggagagccc c 21

Claims (6)

1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合：
引物组合一：根据COVID-19的N基因序列获得的RT-LAMP的引物组合
（1）、N1-F3：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；和
（2）、N1-B3：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；和
（3）、N1-FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；和
（4）、N1-BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；和
（5）、N1-LF：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；和
（6）、N1-LB：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
和
探针组合一：COVID-19 N基因荧光探针
（9）、N-BHQ1：核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；和
（10）、N-ROX：核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
和
引物组合二：根据COVID-19的ORF基因序列获得的RT-LAMP的引物组合
（13）、19cov-ORF-1-F3：核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；和
（14）、19cov-ORF-1-B3：核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；和
（15）、19cov-ORF-1-FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；和
（16）、19cov-ORF-1-BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；和
（17）、19cov-ORF-1-LF：核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；和
（18）、19cov-ORF-1-LB：核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
和
探针组合二：COVID-19 ORF基因荧光探针
（21）、ORF-BHQ1：核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；和
（22）、ORF-FAM：核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；和
引物组合三：内参基因GAPDH基因RT-LAMP引物组合
（25）、GAPDH-F3-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；和
（26）、GAPDH-B3-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；和
（27）、GAPDH-LF-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；和
（28）、GAPDH-LB-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；和
（29）、GAPDH-FIP-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；和
（30）、GAPDH-BIP-5p：核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；和
探针组合三：GAPDH基因探针
（33）、GAPDH-BHQ1：核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；和
（34）、GAPDH-HEX：核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用；所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
3.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合以及可接受的助剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括病毒核酸提取或保存试剂；
所述病毒核酸提取或保存试剂由组分1、组分2、组分3和组分4组成；
所述组分1包括磁珠；所述磁珠含有oligodT14-20；
所述组分2为裂解保存液；所述裂解保存液由如下组分组成：
Figure 354931DEST_PATH_IMAGE001
。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，还包括病毒扩增的RT-LAMP试剂；
所述病毒扩增的RT-LAMP试剂由如下组分组成：
Figure 944175DEST_PATH_IMAGE002
。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。
CN202011532195.6A 2020-12-22 2020-12-22 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用 Active CN112266986B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011532195.6A CN112266986B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011532195.6A CN112266986B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112266986A CN112266986A (zh) 2021-01-26
CN112266986B true CN112266986B (zh) 2021-03-16

Family

ID=74350221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011532195.6A Active CN112266986B (zh) 2020-12-22 2020-12-22 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112266986B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022266946A1 (zh) * 2021-06-24 2022-12-29 黄婉秋 检测病原体rna、及动物或人类基因rna的试剂盒及其应用
CN113801963B (zh) * 2021-09-17 2024-03-26 佛山科学技术学院 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN113943781B (zh) * 2021-10-18 2023-06-30 浙江大学 一种大体积液体样品中病原微生物的快速绝对定量方法
CN113943834B (zh) * 2021-11-02 2023-11-28 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用
CN114427010A (zh) * 2021-12-28 2022-05-03 云舟生物科技(广州)股份有限公司 一种检测水疱性口炎病毒滴度的引物、试剂盒及方法
CN114457195A (zh) * 2022-02-21 2022-05-10 中国科学院地球化学研究所 基于lamp和crispr的病毒检测试剂盒和方法
CN114561448B (zh) * 2022-04-28 2022-07-29 博奥生物集团有限公司 病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用
CN116479170A (zh) * 2022-12-19 2023-07-25 深圳联合医学科技有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017100213A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Biomatrica, Inc. Stabilization of pcr reagents and assays
CN107287320A (zh) * 2017-07-12 2017-10-24 曹国君 Gapdh基因的lamp检测用引物组合及试剂盒
CN109694863B (zh) * 2019-02-28 2021-04-20 深圳市刚竹医疗科技有限公司 用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法
CN111621592A (zh) * 2020-03-24 2020-09-04 吴涛 检测新型冠状病毒的引物组合物和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112266986A (zh) 2021-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112266986B (zh) 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用
EP4023767A1 (en) Method, composition and kit for fluorescent quantitative pcr, and use thereof
CN107022651B (zh) 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法
JPWO2020006036A5 (zh)
JP3134940B2 (ja) 鳥型結核菌複合種の増幅および検出
CN111334614A (zh) 一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法
CN109234456B (zh) 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用
KR101097560B1 (ko) 핵산 검출 방법
CN110982940A (zh) 基于熔解曲线的麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的组合物及试剂盒
CN114410836A (zh) 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
CN112522370B (zh) 一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法
CN113388701A (zh) 引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用
WO2020118543A1 (zh) 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法
KR20130111788A (ko) 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법
CN116042878A (zh) 一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN114807435A (zh) 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用
CN115029345A (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
CN112593013B (zh) 牛副流感病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重rpa检测试剂盒
TWI723675B (zh) 用於檢測登革熱病毒的方法以及套組
WO2022177842A1 (en) Composition and method for nucleic acid detection
CN113502341A (zh) 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
US11788129B2 (en) Nucleic acid detection kit and nucleic acid detection method
CN113151599A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
CN112063759A (zh) 一种同时检测香蕉多种病毒的rt-lamp引物、试剂盒及检测方法
CN111893213A (zh) 用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220720

Address after: 102206 No. 18, life science Road, Beijing, Changping District

Patentee after: CAPITALBIO Corp.

Patentee after: Guangzhou National Laboratory

Address before: 102206 No. 18, life science Road, Beijing, Changping District

Patentee before: CAPITALBIO Corp.

TR01 Transfer of patent right