CN109694863B - 用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法 - Google Patents

用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法。该核酸提取试剂盒包括裂解液，裂解液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX‑100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍。上述核酸提取试剂盒能够提取得到较高浓度的核酸。

Description

用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提 取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸提取是指利用物理、化学等方法将核酸从样品中分离出来的过程。分离得到高质量的核酸是分子生物学研究的关键步骤。目前，主要采用核酸提取试剂盒进行核酸提取。然而，传统的核酸提取试剂盒提取的核酸质量较差，不能满足实际需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种核酸提取试剂盒，该提取试剂盒能够提取得到较高浓度的核酸。
此外，还提供一种用于核酸提取的清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法。
一种核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒包括裂解液，所述裂解液包括：
Figure BDA0001981500520000011
Figure BDA0001981500520000021
上述核酸提取试剂盒包括裂解液，裂解液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍，上述裂解液能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以使细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量，保证后续操作的准确性。经试验验证，采用上述的核酸提取试剂盒提取的核酸的浓度为25ng/μL～77ng/μL，核酸的纯度为1.60～1.88，得到的核酸具有较高的质量。
在其中一个实施例中，所述裂解液包括：50mmol/L～150mmol/L的NaCl、20mmol/L～40mmol/L的Tris、20mmol/L～40mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.2％～0.4％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2.5％～3.5％的TritonX-100、0.6mol/L～0.8mol/L的NaBrO3及0.6mol/L～0.8mol/L的异硫氰酸胍。
在其中一个实施例中，所述核酸提取试剂盒还包括清洗液，所述清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为50％～80％的乙醇。
在其中一个实施例中，所述核酸提取试剂盒还包括漂洗液，所述漂洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇。
一种用于核酸提取的裂解液，所述裂解液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍。
一种用于核酸提取的清洗液，所述清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及组分A，所述组分A选自质量百分含量为50％～80％的乙醇及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇中的至少一种。
上述核酸提取试剂盒、上述用于核酸提取的裂解液或者上述用于核酸提取的清洗液在提取待提取样品中核酸的应用。
一种核酸的提取方法，包括如下步骤：
将裂解液、吸附物和待提取样品混合并反应，得到吸附有核酸的所述吸附物，所述裂解液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍；及
采用洗脱液处理吸附有所述核酸的所述吸附物，固液分离并收集清液，得到所述核酸。
在其中一个实施例中，所述吸附物为磁珠或吸附膜。
在其中一个实施例中，所述将裂解液、吸附物和待提取样品混合，得到吸附有核酸的所述吸附物的步骤之后，所述采用洗脱液处理吸附有所述核酸的所述吸附物的步骤之前，还包括采用清洗液清洗吸附有所述核酸的所述吸附物的步骤，所述清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及组分A，所述组分A选自质量百分含量为50％～80％的乙醇及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇中的至少一种。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。下面给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的核酸提取试剂盒包括裂解液，裂解液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍。
上述裂解液能够充分有效地裂解待提取样品，裂解效率高，以使待提取样品中的核酸能够充分释放，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量和提取效率，保证后续操作的准确性。
在其中一个实施例中，待提取样品为组织细胞、拭子、脱落体细胞、血液、体液、细菌、病毒、支原体或衣原体。需要说明的是，待提取样品不限于上述指出的样品，还可以为其他含有核酸的待提取样品。
NaCl能够改变待提取样品的渗透压，以使待提取样品更容易裂解。在其中一个实施例中，裂解液包括50mmol/L～150mmol/L的NaCl。进一步地，裂解液包括80mmol/L～120mmol/L的NaCl。在其中一些实施例中，裂解液包括20mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、180mmol/L或200mmol/L的NaCl。
Tris即三羟甲基氨基甲烷，能够维持待提取样品裂解后释放的核酸的稳定性，以避免核酸的降解，提高核酸的浓度和纯度，以保证后续操作的准确性。
在其中一个实施例中，裂解液包括10mmol/L～50mmol/L且pH7.8～8.3的Tris。进一步的，Tris的pH为8.0。在其中一个实施例中，裂解液包括20mmol/L～40mmol/L的Tris。进一步地，裂解液包括25mmol/L～35mmol/L的Tris。在其中一些实施例中，裂解液包括10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L的Tris。
EDTA即乙二胺四乙酸，是一种能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合的螯合剂。在其中一个实施例中，裂解液包括20mmol/L～40mmol/L的EDTA。在其中一些实施例中，裂解液包括10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L的EDTA。
十二烷基硫酸钠(即SDS)，是一种阴离子表面活性剂，能够破坏细胞膜的磷脂层双分子结构，以利于细胞中核酸的释放。在其中一个实施例中，裂解液包括质量百分含量为0.2％～0.4％的十二烷基硫酸钠。在其中一些实施例中，裂解液包括质量百分含量为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的十二烷基硫酸钠。
TritonX-100即聚乙二醇辛基苯基醚-100，是一种非离子型表面活性剂，能够溶解脂质，以增加细胞膜的通透性。在其中一个实施例中，裂解液包括质量百分含量为2.5％～3.5％的TritonX-100。在其中一些实施例中，裂解液包括质量百分含量2％、2.5％、3％、3.5％或4％的TritonX-100。
NaBrO3即溴酸钠，能够将把DNA从DNA-蛋白复合物中分离，有利于DNA的提取。在其中一个实施例中，裂解液包括0.6mol/L～0.8mol/L的NaBrO3。在其中一些实施例中，裂解液包括0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L的NaBrO3。
异硫氰酸胍即GTC，无RNA酶和DNA酶活性，能够裂解细胞，以用于提取RNA和DNA。在其中一个实施例中，裂解液包括0.6mol/L～0.8mol/L的异硫氰酸胍。在其中一些实施例中，裂解液包括0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L的异硫氰酸胍。
在其中一个实施例中，裂解液包括50mmol/L～150mmol/L的NaCl、20mmol/L～40mmol/L的Tris、20mmol/L～40mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.2％～0.4％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2.5％～3.5％的TritonX-100、0.6mol/L～0.8mol/L的NaBrO3及0.6mol/L～0.8mol/L的异硫氰酸胍。该裂解液配比合理，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以使细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度更高且纯度更高的核酸，有利于提高核酸的质量和提取效率，保证后续操作的准确性。
在其中一个实施例中，核酸提取试剂盒还包括清洗液。清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为50％～80％的乙醇。上述清洗液能够清洗裂解后待提取样品，以得到纯度较高的核酸。
NaCl即氯化钠，能够使核酸保持稳定。在其中一个实施例中，清洗液包括50mmol/L～150mmol/L的氯化钠。进一步地，清洗液包括90mmol/L～110mmol/L的氯化钠。在其中一些实施例中，清洗液包括20mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、130mmol/L、150mmol/L或200mmol/L的氯化钠。
3-吗啉丙磺酸即MOPS，一种生物缓冲液，能够保持核酸的稳定性。在其中一个实施例中，清洗液包括5mmol/L～25mmol/L且pH7.0的3-吗啉丙磺酸。进一步地，清洗液包括10mmol/L～20mmol/L且pH7.0的3-吗啉丙磺酸。在其中一些实施例中，清洗液包括5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L或25mmol/L的3-吗啉丙磺酸。
乙醇能够使DNA在溶液中呈不融解状态。在其中一个实施例中，清洗液包括质量百分含量为50％～80％的乙醇。进一步地，清洗液包括质量百分含量为56％的乙醇。
在其中一个实施例中，核酸提取试剂盒还包括漂洗液。漂洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇。上述漂洗液能够进一步清洗裂解后待提取样品，以得到纯度较高的核酸。
NaCl即氯化钠，能够使核酸保持稳定。在其中一个实施例中，漂洗液包括50mmol/L～150mmol/L的氯化钠。进一步地，漂洗液包括90mmol/L～110mmol/L的氯化钠。在其中一些实施例中，漂洗液包括20mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、130mmol/L、150mmol/L或200mmol/L的氯化钠。
3-吗啉丙磺酸即MOPS，一种生物缓冲液，能够保持核酸的稳定性。在其中一个实施例中，漂洗液包括5mmol/L～25mmol/L且pH7.0的3-吗啉丙磺酸。进一步地，漂洗液包括10mmol/L～20mmol/L且pH7.0的3-吗啉丙磺酸。在其中一些实施例中，漂洗液包括5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L或25mmol/L的3-吗啉丙磺酸。
聚乙二醇能够使裂解后待提取样本中的DNA析出，以使DNA处于析出状态，并且聚乙二醇能够吸收水，以形成占位效应。在其中一个实施例中，漂洗液包括质量百分含量为3％～7％的聚乙二醇。进一步地，漂洗液包括质量百分含量为4％～6％的聚乙二醇。在其中一些实施例中，漂洗液包括质量百分含量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的聚乙二醇。
在其中一个实施例中，聚乙二醇选自PEG2000、PEG4000、PEG6000及PEG8000中的至少一种。
进一步地，聚乙二醇为PEG6000。此种设置能够使DNA更容易析出，以提高核酸的浓度和提取效率。在其中一个实施例中，漂洗液包括质量百分含量为3％～7％的PEG6000。进一步地，漂洗液包括质量百分含量为4％～6％的PEG6000。在其中一些实施例中，漂洗液包括质量百分含量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的PEG6000。
在其中一个实施例中，核酸提取试剂盒还包括吸附物。吸附物能够吸附核酸。待提取样品经裂解液裂解后释放的核酸能够被吸附物吸附，以能够分离核酸，得到纯度较高的核酸。
在其中一个实施例，吸附物为磁珠或吸附膜。进一步地，吸附物为羟基磁珠或硅胶吸附膜。
需要说明的是，吸附物为磁珠时，可以将裂解后的待提取样品与吸附物混合而使核酸吸附到吸附物上，再通过磁力将携带核酸的磁珠从裂解后的待提取样品中分离出；吸附物为吸附膜时，可以采用吸附物过滤裂解后的待提取样品而使核酸吸附到吸附物上，以使核酸从裂解后的待提取样品中分离出。
需要说明的是，吸附物不限于上述指出的吸附物，还可以为其他能够吸附核酸的吸附物，例如可以是电化学芯片。当吸附物为电化学芯片时，可以通过吸附物吸附核酸而使核酸从裂解后的待提取样品中分离出。
在其中一个实施例中，核酸提取试剂盒还包括洗脱液。洗脱液用于将吸附物上携带的核酸洗脱下，以得到提纯后的核酸。进一步地，洗脱液为无核酸水。需要说明的是，洗脱液不限于无核酸水，还可以为其他洗脱液，能够将核酸从吸附物上洗脱下即可。
上述核酸提取试剂盒包括裂解液。裂解液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍。上述裂解液能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以使细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量，保证后续操作的准确性。经试验验证，采用上述的核酸提取试剂盒提取的核酸的浓度为25ng/μL～77ng/μL，核酸的纯度为1.60～1.88，得到的核酸具有较高的质量。
上述核酸提取试剂盒还包括能够吸附核酸的吸附物，吸附物为吸附膜、磁珠或电化学芯片，通过设置吸附物能够将核酸从裂解后的待提取样品中分离出来，无需进行离心等操作，操作简单，能够较大限度的降低核酸的丢失。
上述核酸提取试剂盒还包括清洗液和漂洗液，配方合理，能够去除提取的核酸的杂质，获得高纯度的核酸，以能够直接用于聚合酶链式反应、酶切反应、基因文库构建等操作中。
此外，一实施方式还提供一种核酸的提取方法，包括如下步骤S110～S120：
S110、将裂解液、吸附物和待提取样品混合并反应，得到吸附有核酸的吸附物。裂解液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、10mmol/L～50mmol/L的Tris、10mmol/L～50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的TritonX-100、0.5mol/L～1mol/L的NaBrO3及0.5mol/L～1mol/L的异硫氰酸胍。
通过将裂解液、吸附物和待提取样品混合，使得裂解液将待提取样品裂解而释放核酸，释放的核酸经吸附物吸附而分离出核酸。
在其中一个实施例中，S110的步骤为：将裂解液与待提取样品混合后，再加入吸附物进行混合，固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。进一步地，将裂解液与待提取样品混合的温度为15℃～35℃，混合的时间为1min～5min。加入吸附物进行混合的温度为15℃～35℃，混合的时间为1min～5min。
需要说明的是，上述操作不限于将裂解液与待提取样品混合后，再加入吸附物进行混合；也可以将裂解液与吸附物混合后，再加入待提取样品进行混合并反应；还可以将裂解液、吸附物与待提取样品同时进行混合。
在其中一个实施例中，吸附物为磁珠或吸附膜。进一步地，吸附物为羟基磁珠或硅胶吸附膜。需要说明的是，当吸附物为吸附膜时，采用吸附物过滤裂解液与待提取样品混合得到的混合物，以使核酸吸附于吸附物上，得到吸附有核酸的吸附物。过滤的压力为0.06Mpa～0.098Mpa。
进一步地，当吸附物为磁珠时，能够通过磁力吸附磁珠而进行固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。当吸附物为吸附膜时，能够通过给吸附物施加一定的压力，以得到吸附有核酸的吸附物。
S120、采用洗脱液处理吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。
在其中一个实施例中，洗脱液为无核酸水。
在其中一个实施例中，处理的方式为浸泡。处理的温度为15℃～35℃。处理的时间为1min～5min。
在其中一个实施例中，固液分离的方式为离心。需要说明的是，固液分离的方式不限于离心，也可以为其他固液分离方式，例如吸附物为磁珠时，可以通过给洗脱液处理后得到的混合物施加磁力，以使磁珠分离出；吸附物为吸附膜时，可以通过给吸附物施加压力，以使含有核酸的洗脱液从吸附膜中流出。需要说明的是，当吸附物为电化学芯片时，可以将吸附有核酸的电化学芯片直接用于核酸的定量定性的检测。
在其中一个实施例中，在S110之后，在S120之前，还包括清洗吸附有核酸的吸附物的步骤。通过清洗以提高核酸的纯度。
进一步地，采用清洗液清洗吸附有核酸的吸附物的步骤，清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及组分A，组分A选自质量百分含量为50％～80％的乙醇及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇中的至少一种。通过上述清洗液清洗以能够保证核酸的纯度，又能够避免核酸从吸附物上脱落而浓度降低。更进一步地，清洗的方式为浸泡或喷淋。
在其中一个实施例中，聚乙二醇选自PEG2000、PEG4000、PEG6000及PEG8000中的至少一种。进一步地，聚乙二醇为PEG6000。
具体地，采用清洗液清洗吸附有核酸的吸附物的步骤为：采用第一清洗液清洗吸附有核酸的吸附物，第一清洗液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为50％～80％的乙醇；清洗的温度为15℃～35℃；清洗时间为1min～5min。再采用第二清洗液清洗吸附有核酸的吸附物，第二清洗液包括20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％～10％的PEG6000；清洗的温度为15℃～35℃；清洗时间为1min～5min。
上述实施方式的核酸的提取方法操作简单，能够充分有效地裂解待提取样品，裂解效率高，以使待提取样品中的核酸能够充分释放同时，通过吸附物能够将核酸从裂解后的待提取样品中分离出来，操作简单，能够较大限度的降低核酸的丢失，得到浓度及纯度均较高的核酸，有利于提高核酸的质量和提取效率，保证后续操作的准确性。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，吸附物为磁珠时，吸附物为羟基磁珠，购于洛阳惠尔纳米科技有限公司。
实施例1
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于15℃下混合5min后，再加入吸附物于35℃下混合5min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集正常人来源的唾液样品。裂解液包括20mmol/L的NaCl、50mmol/L且pH8的Tris、10mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为4％的TritonX-100、1mol/L的NaBrO3及1mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于35℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括20mmol/L的NaCl、25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为50％的乙醇。清洗的时间为1min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于15℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括200mmol/L的NaCl、25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为10％的PEG4000。清洗的时间为1min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于15℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为5min。
实施例2
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于35℃下混合1min后，再加入吸附物于15℃下混合1min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集正常人来源的唾液样品。裂解液包括200mmol/L的NaCl、10mmol/L且pH8的Tris、50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％的TritonX-100、0.5mol/L的NaBrO3及0.5mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于15℃下清洗吸附有核酸的吸附物5min，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括200mmol/L的NaCl、5mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为80％的乙醇。清洗的时间为5min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于35℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括20mmol/L的NaCl、5mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％的PEG8000。清洗的时间为5min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于35℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为1min。
实施例3
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集正常人来源的唾液样品。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为56％的乙醇。清洗的时间为2min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于25℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为5％的PEG6000。清洗的时间为3min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例4
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于15℃下混合5min后，再加入吸附物于35℃下混合5min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括50mmol/L的NaCl、40mmol/L且pH8的Tris、20mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.4％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3.5％的TritonX-100、0.8mol/L的NaBrO3及0.8mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)按照实施例1的步骤(2)～(3)进行操作，得到核酸。
实施例5
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于35℃下混合1min后，再加入吸附物于15℃下混合1min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括150mmol/L的NaCl、20mmol/L且pH8的Tris、40mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.2％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2.5％的TritonX-100、0.6mol/L的NaBrO3及0.6mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)按照实施例2的步骤(2)～(3)进行操作，得到核酸。
实施例6
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min得到混合液；采用硅胶吸附膜(购于深圳逗点生物技术有公司)于25℃下过滤混合液，得到吸附有核酸的吸附膜。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。过滤压力为0.08Mpa。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。
(2)采用吸附有核酸的吸附膜于25℃下过滤清洗液，得到清洗后的吸附膜。过滤压力为0.08Mpa。清洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为56％的乙醇。
(3)采用步骤(2)得到的清洗后的吸附膜于25℃下过滤漂洗液，得到清洗后的吸附有核酸的吸附膜。过滤压力为0.08Mpa。漂洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为5％的PEG6000。
(4)采用清洗后的吸附有核酸的吸附膜于25℃下过滤洗脱液，收集清液，得到核酸。洗脱液为水。过滤压力为0.08Mpa。
实施例7
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于15℃下混合5min后，再加入吸附物于35℃下混合5min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括20mmol/L的NaCl、50mmol/L且pH8的Tris、10mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为4％的TritonX-100、1mol/L的NaBrO3及1mol/L的NaHClO3。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)按照实施例1的步骤(2)～(4)进行操作，得到核酸。
实施例8
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的NaI。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)按照实施例3的步骤(2)～(4)进行操作，得到核酸。
实施例9
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于35℃下混合1min后，再加入吸附物于15℃下混合1min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括200mmol/L的NaCl、10mmol/L且pH8的Tris、50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％的TritonX-100、0.5mol/L的NaBrO3及0.5mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于15℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括质量百分含量为80％的乙醇的水溶液。清洗的时间为5min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于35℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括20mmol/L的NaCl、5mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％的PEG4000。清洗的时间为5min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于35℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为1min。
实施例10
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括100mmol/L的NaCl、质量百分含量为56％的乙醇。清洗的时间为2min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于25℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为5％的EG6000。清洗的时间为3min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例11
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为56％的乙醇。清洗的时间为2min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于25℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括质量百分含量为80％的乙醇的水溶液。清洗的时间为3min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例12
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为56％的乙醇。清洗的时间为2min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用漂洗液于25℃下清洗步骤(2)得到的清洗后的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括100mmol/L的NaCl、质量百分含量为5％的PEG6000。清洗的时间为3min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(4)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例13
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用清洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附物。清洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为56％的乙醇。清洗的时间为2min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例14
本实施例的核酸的提取过程如下：
(1)将裂解液与待提取样品于25℃下混合3min后，再加入吸附物于25℃下混合3min，得到混合物。将混合物固液分离，得到吸附有核酸的吸附物。待待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。裂解液包括100mmol/L的NaCl、30mmol/L且pH8的Tris、30mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.3％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为3％的TritonX-100、0.7mol/L的NaBrO3及0.7mol/L的异硫氰酸胍。吸附物为磁珠。固液分离的方式为给混合物施加磁力以进行磁分离。
(2)采用漂洗液于25℃下清洗吸附有核酸的吸附物，固液分离，得到清洗后的吸附有核酸的吸附物。漂洗液包括100mmol/L的NaCl、15mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为5％的PEG6000。清洗的时间为3min，清洗的方式为浸泡。固液分离的方式为磁分离。
(3)采用洗脱液于25℃下浸泡清洗后的吸附有核酸的吸附物，固液分离并收集清液，得到核酸。洗脱液为水。固液分离的方式为磁分离。浸泡时间为3min。
实施例15
采用深圳逗点生物技术有公司MNP013-1型号的核酸提取试剂盒并按照其操作说明对待提取样品进行核酸提取，得到核酸。待提取样品为深圳市刚竹医疗科技有限公司收集的正常人来源唾液样品。
测试：
采用nanodrop分光光度仪测定实施例1～15的核酸的浓度和纯度，其中，纯度为OD260与OD280的比值，OD260表示核酸在波长为260nm下的吸光值，OD280表示核酸在波长为280nm下的吸光值，测定结果详见表1。
表1实施例1～15的核酸的浓度和纯度
Figure BDA0001981500520000221
Figure BDA0001981500520000231
从表1可以看出，实施例1～6得到的核酸的浓度为25ng/μL～77ng/μL，明显高于实施例15得到的核酸的浓度，且实施例1～6得到的核酸的纯度为1.60～1.88，明显高于实施例15得到的核酸纯度，说明上述实施方式的核酸提取试剂盒能够提取得到质量较高的核酸。
其中，实施例1得到的核酸的浓度和纯度均高于实施例7，说明上述实施方式的用于核酸提取的裂解液更有利于提高核酸的质量；并且实施例3得到的核酸的浓度和纯度均高于实施例8，说明上述实施方式的用于核酸提取的裂解液各组分协同配合，有利于提高核酸的质量。
实施例3得到的核酸的浓度和纯度均高于实施例14，说明对裂解后待提取样品进行清洗液清洗有利于提高核酸的质量。实施例2得到的核酸的浓度高于实施例9，说明上述实施方式的用于核酸提取的清洗液更有利于提高核酸的浓度；并且实施例3得到的核酸的浓度和纯度均高于实施例10，说明上述实施方式的用于核酸提取的清洗液各组分协同配合，有利于提高核酸的质量。
实施例3得到的核酸的浓度和纯度均高于实施例13，说明对清洗后的吸附物进行漂洗液清洗有利于提高核酸的质量。实施例3得到的核酸的浓度高于实施例11～12，说明上述实施方式的用于核酸提取的漂洗液组分协同作用，采用上述实施方式的用于核酸提取的漂洗液进行漂洗后更有利于提高核酸的质量。
综上，上述实施方式的核酸提取试剂盒能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以使细胞中的核酸能够充分释放，无需进行离心等操作，操作简单，能够较大限度的降低核酸的丢失，得到浓度更高、纯度更高的核酸，保证后续操作的准确性，以能够直接用于聚合酶链式反应、酶切反应、基因文库构建等操作中。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒包括裂解液，所述裂解液包括：
50mmol/L～150mmol/L的NaCl、20mmol/L～40mmol/L的Tris、20mmol/L～40mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.2％～0.4％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2.5％～3.5％的TritonX-100、0.6mol/L～0.8mol/L的NaBrO3及0.6mol/L～0.8mol/L的异硫氰酸胍；
所述核酸提取试剂盒还包括清洗液，所述清洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为50％～80％的乙醇；
所述核酸提取试剂盒还包括漂洗液，所述漂洗液包括：20mmol/L～200mmol/L的NaCl、5mmol/L～25mmol/L的3-吗啉丙磺酸及质量百分含量为1％～10％的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述聚乙二醇选自PEG2000、PEG4000、PEG6000及PEG8000中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述聚乙二醇为质量百分含量3％～7％的PEG6000。
4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括吸附物。
5.根据权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述吸附物为磁珠或吸附膜。
6.根据权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述吸附物为羟基磁珠或吸附膜。
7.根据权利要求1～3任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括洗脱液。
8.根据权利要求7所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸水。
9.权利要求1～8任一项所述的核酸提取试剂盒在提取待提取样品中核酸的应用。
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