CN113881663A - 一种基于超声波的核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于超声波的核酸提取方法，所述核酸提取方法包括：将待测样本、化学裂解液、蛋白酶K和磁珠悬液放入反应容器内，在超声波的作用下进行样本裂解，随后进行核酸纯化，最后通过超声波处理和/或高温处理进行核酸洗脱。本发明提供的核酸提取方法采用超声法配合化学裂解液及蛋白酶K同时作用于样本，有效提高裂解效率，可以在常温下30～60s内完成样本裂解。本发明提供的核酸提取方法采用超声法配合化学裂解液及蛋白酶K同时作用于样本，有效提高裂解效率，可以在常温下30～60s内完成细胞、微生物等样本裂解。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，涉及一种基于超声波的核酸提取方法。
背景技术
核酸包括DNA、RNA两种分子，以核酸为研究对象的生物技术，包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术，近年来飞速发展，这些技术目前不仅在研究单位使用，而且在社会生活中多个职能部门已经广泛应用。而核酸研究的第一步，就是从各种生物样本中提取核酸，核酸提取的效率成为下游核酸研究能否成功的制约因素。核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，并纯化核酸，去除盐类和有机化学试剂等杂质。
目前主要采用的核酸提取方法包括离心柱法和磁珠法。其中，磁珠法是以微米磁珠为载体的一种核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，从而进行核酸分离纯化。目前，对于核酸的提取，磁珠法一般包括裂解、结合、洗涤和洗脱四个主要步骤，每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
CN108410859A公开了一种核酸提取方法，包括裂解步骤和转移步骤，裂解步骤包括样本的热裂解和磁珠吸附热裂解释放的核酸，裂解步骤在裂解区域完成；将吸附有核酸的磁珠转移到前处理液中、完成转移步骤；前处理液位于前处理区域，裂解区域与前处理区域相互独立。
CN101085799公开了一种核酸提取方法，该方法包括以下步骤：(a)将生物材料与裂解液接触从而释放出核酸；(b)将水溶性有机溶剂加入到含有核酸的溶液中从而得到裂解物溶液；(c)将裂解物溶液与固体材料接触从而使得核酸被吸附到固体材料上；(d)用洗涤液洗掉固体材料上的杂质，其中，实施两次或多次洗涤程序，并且在两次或多次洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所用的洗涤液所形成的液面高于第一洗涤程序中所用的洗涤液所形成的液面；以及(e)用回收液使吸附到固体材料上的核酸解吸附。
CN113201529A公开了一种核酸提取方法，包括：S101、将样本与裂解液混合，使样本充分裂解；S103、在S101得到的溶液中加入磁珠，使得磁珠与样本裂解出来的核酸结合；S105、磁棒移动至磁棒套内后，整体向下移动，进入溶液中吸附磁珠；吸附完成后，磁棒和磁棒套保持相对位置不动，上下振荡若干次；S107、将磁珠转移至清洗液中，磁棒套上下振荡使得磁珠均匀分散于清洗液，洗去附着在磁珠表面的、除核酸以外的物质；S109、利用磁棒将清洗完成的磁珠吸附于磁棒套外表面，并对磁珠和磁棒套进行干燥处理；S111、将干燥后的磁珠转移至洗脱液中进行洗脱，附着在磁珠上的核酸脱离磁珠进入洗脱液中，利用磁棒和磁棒套将溶液中的磁珠吸附回收，即得核酸溶液。
由于核酸提取的重要地位，很多研究学者开发了一系列的核酸提取方法，包括用酚/氯仿等有机溶剂抽提的传统方法、操作简便但核酸纯度低的螯合树脂法、玻璃粉吸附法、硅胶膜吸附柱法、抗核酸单克隆抗体的免疫亲和法、自动化平台广泛应用的磁珠法等等。目前的核酸提取方法还存在着核酸提取过程复杂、核酸纯度低等缺陷。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于超声波的核酸提取方法，本发明提供的核酸提取方法采用超声法配合化学裂解液及蛋白酶K同时作用于样本，有效提高裂解效率，可以在常温下30～60s内完成样本裂解。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基于超声波的核酸提取方法，所述核酸提取方法包括：将待测样本、化学裂解液、蛋白酶K和磁珠悬液放入反应容器内，在超声波的作用下进行样本裂解，随后进行核酸纯化，最后通过超声波处理和/或高温处理进行核酸洗脱。
本发明提供的核酸提取方法采用超声法配合化学裂解液及蛋白酶K同时作用于样本，有效提高裂解效率，可以在常温下30～60s内完成样本裂解。同时本发明采用超声均质结合磁珠吸附的方式进行纯化清洗，磁珠可以在5s内更好的分散，大大缩短均质时间，从而在较短的时间内得到很好的纯化效果。缩短核酸提取时间，提高裂解效率，裂解时间由常规的加热10～20分钟减少至常温下的1～4分钟。其次，本发明提供的核酸提取装置还可以兼容多种不同类型的样本，在处理一些复杂样本如全血、粪便时有较好的核酸提取效果，针对复杂样本(如全血、粪便或组织)单个样本的核酸提取时间与市面上同类型的核酸提取装置相比，提取时间由50分钟缩减至10～15分钟。此外，为适用更多下游应用，本发明有两种可选的洗脱方式，一种是低功率的超声洗脱，洗脱时间短，约1～3分钟，并且伴有核酸片段化的效果；二是瞬时的超声加高温洗脱，洗脱时间约10～15分钟，洗脱的核酸片段比较完整。
作为本发明一种优选的技术方案，所述化学裂解液包括钠盐、蛋白变性剂、金属离子络合剂、表面活性剂和醇。
优选地，所述钠盐包括醋酸钠。
优选地，所述钠盐的摩尔浓度为0.5～2mol/L，例如可以是0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L、1.6mol/L、1.7mol/L、1.8mol/L、1.9mol/L或2.0mol/L，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述蛋白变性剂包括胍盐和/或尿素。
优选地，所述胍盐包括盐酸胍。
优选地，所述蛋白变性剂的摩尔浓度为2～5mol/L，例如可以是2.0mol/L、2.5mol/L、3.0mol/L、3.5mol/L、4.0mol/L、4.5mol/L或5.0mol/L，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述金属离子络合剂包括EDTA。
优选地，所述金属离子络合剂的摩尔浓度为1～5mol/L，例如可以是1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L、3.0mol/L、3.5mol/L、4.0mol/L、4.5mol/L、或5.0mol/L，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述表面活性剂包括十二烷基肌氨酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X-100或吐温20中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述表面活性剂的体积浓度为0.25～1vol％，例如可以是0.25vol％、0.3vol％、0.35vol％、0.4vol％、0.45vol％、0.5vol％、0.55vol％、0.6vol％、0.65vol％、0.7vol％、0.75vol％、0.8vol％、0.85vol％、0.9vol％、0.95vol％或1.0vol％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述醇包括乙醇、聚乙二醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述醇的体积分数为40～60vol％，例如可以是40vol％、42vol％、44vol％、46vol％、48vol％、50vol％、52vol％、54vol％、56vol％、58vol％或60vol％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述化学裂解液的pH值控制在7～7.5，例如可以是7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为7.4。
作为本发明一种优选的技术方案，所述样本裂解过程中采用的超声波的超声功率为0～15W且不为0，例如可以是1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W、9W、10W、11W、12W、13W、14W或15W，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为10W。
优选地，所述样本裂解过程中采用的超声波的超声频率为10～30kHz，例如可以是10kHz、12kHz、14kHz、16kHz、18kHz、20kHz、22kHz、24kHz、26kHz、28kHz或30kHz，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为18～25kHz。
优选地，所述样本裂解过程中的超声波处理时间为1～4min，例如可以是1.0min、1.5min、2.0min、2.5min、3.0min或3.5min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，所述核酸纯化过程包括：
样本裂解完成后，对反应容器中的反应体系聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，弃去上清液后，向反应容器内依次加入蛋白漂洗液和清洗液，对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗和清洗。
作为本发明一种优选的技术方案，所述蛋白漂洗液包括吗啉丙磺酸、氯化钠和聚乙二醇。
优选地，所述吗啉丙磺酸的摩尔浓度为5～25mmol/L，例如可以是5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L或25mmol/L，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为10mmol/L。
优选地，所述氯化钠的摩尔浓度为150～200mmol/L，例如可以是150mmol/L、155mmol/L、160mmol/L、165mmol/L、170mmol/L、175mmol/L、180mmol/L、185mmol/L、190mmol/L、195mmol/L或200mmol/L，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为180mmol/L。
优选地，所述聚乙二醇溶液中醇的体积分数为1～10vol％，例如可以是1vol％、2vol％、3vol％、4vol％、5vol％、6vol％、7vol％、8vol％、9vol％或10vol％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明一种优选的技术方案，所述清洗液为50～80vol％的乙醇溶液，例如可以是50vol％、55vol％、60vol％、65vol％、70vol％、75vol％或80vol％，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为75vol％的乙醇溶液。
作为本发明一种优选的技术方案，加入蛋白漂洗液对核酸进行漂洗后，对反应溶液依次进行超声和聚磁，随后弃去上清液，再向反应容器内加入所述清洗液进行清洗。
优选地，所述清洗过程进行至少一次。
优选地，每次清洗结束后，对反应溶液依次进行超声和聚磁，随后弃去上清液，再向反应容器内加入清洗液，进行下一次清洗操作。
优选地，最后一次清洗结束后，对反应溶液进行除醇，随后进行核酸洗脱。
作为本发明一种优选的技术方案，所述核酸洗脱过程包括：
核酸纯化后，向反应容器内加入洗脱液，在超声波和/或高温的作用下，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来。
作为本发明一种优选的技术方案，所述洗脱液包括缓冲液和络合剂。
优选地，所述洗脱液的pH值控制在7～9，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为8。
作为本发明一种优选的技术方案，所述核酸洗脱过程中采用的超声波的超声功率小于样本裂解过程中采用的超声波的超声功率。
优选地，所述核酸洗脱过程中采用的超声波的超声功率为1～10W，例如可以是1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W、9W或10W，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为5W。
优选地，所述核酸洗脱过程中的超声时间为1～5min，例如可以是1.0min、1.5min、2.0min、2.5min、3.0min、3.5min、4.0min、4.5min或5.0min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述高温处理的加热温度为50～70℃，例如可以是50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃或70℃，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为60℃。
优选地，所述高温处理的加热时间为5～20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，进一步优选为10～15min。
优选地，在核酸洗脱过程中，所述超声波处理方式为间歇式超声。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的核酸提取方法采用超声法配合化学裂解液及蛋白酶K同时作用于样本，有效提高裂解效率，可以在常温下30～60s内完成样本裂解。同时本发明采用超声均质结合磁珠吸附的方式进行纯化清洗，磁珠可以在5s内更好的分散，大大缩短均质时间，从而在较短的时间内得到很好的纯化效果。缩短核酸提取时间，提高裂解效率，裂解时间由常规的加热10～20分钟减少至常温下的1～4分钟。其次，本发明提供的核酸提取装置还可以兼容多种不同类型的样本，在处理一些复杂样本如全血、粪便时有较好的核酸提取效果，针对复杂样本(如全血、粪便或组织)单个样本的核酸提取时间与市面上同类型的核酸提取装置相比，提取时间由50分钟缩减至10～15分钟。此外，为适用更多下游应用，本发明有两种可选的洗脱方式，一种是低功率的超声洗脱，洗脱时间短，约1～3分钟，并且伴有核酸片段化的效果；二是瞬时的超声均质加高温洗脱，洗脱时间约10～15分钟，洗脱的核酸比较完整。
附图说明
图1为本发明实施例1、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例11、对比例1和对比例2的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例11提取的核酸的荧光定量PCR结果图；
图4为本发明对比例1提取的核酸的荧光定量PCR结果图；
图5为本发明对比例2提取的核酸的荧光定量PCR结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7.2)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液超声处理1min，超声功率为10W，超声频率为20kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括1mol/L的醋酸钠、3mol/L的盐酸胍、3mol/L的EDTA、0.5vol％的十二烷基苯磺酸钠以及50vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，弃去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括15mmol/L的吗啉丙磺酸、180mmol/L的氯化钠和5vol％的聚乙二醇；清洗液为70vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为8)，对反应液进行间歇式超声处理(超声功率为5W，开启5s后关闭10s，重复进行4次)，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例2
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液连续超声处理2min，超声功率为3W，超声频率为10kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括0.5mol/L的醋酸钠、2mol/L的盐酸胍、1mol/L的EDTA、0.25vol％的曲拉通X-100以及40vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，弃去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括5mmol/L的吗啉丙磺酸、150mmol/L的氯化钠和1vol％的聚乙二醇；清洗液为50vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为7)，对反应液进行间歇式超声处理(超声功率为1W，开启5s后关闭10s，重复进行4次)，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例3
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7.1)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液连续超声处理3min，超声功率为5W，超声频率为18kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括0.7mol/L的醋酸钠、2.5mol/L的盐酸胍、2mol/L的EDTA、0.3vol％的吐温20以及45vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，吸去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括10mmol/L的吗啉丙磺酸、160mmol/L的氯化钠和3vol％的聚乙二醇；清洗液为60vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为7.5)，对反应液进行间歇式超声处理(超声功率为3W，开启5s后关闭10s，重复进行4次)，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例4
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7.3)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液进行超声处理4min，超声功率为12W，超声频率为25kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括1.5mol/L的醋酸钠、4mol/L的盐酸胍、4mol/L的EDTA、0.7vol％的十二烷基肌氨酸钠以及55vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，弃去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括20mmol/L的吗啉丙磺酸、190mmol/L的氯化钠和7vol％的聚乙二醇；清洗液为65vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为8.5)，对反应液进行间歇式超声处理(超声功率为7W，开启5s后关闭10s，重复进行4次)，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例5
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7.5)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液进行超声处理4min，超声功率为15W，超声频率为30kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括2mol/L的醋酸钠、5mol/L的盐酸胍、5mol/L的EDTA、1vol％的十六烷基三甲基溴化铵以及60vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，吸去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括25mmol/L的吗啉丙磺酸、200mmol/L的氯化钠和10vol％的聚乙二醇；清洗液为80vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为9)，对反应液进行间歇式超声处理(超声功率为10W，开启5s后关闭10s，重复进行4次)，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例7
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中的超声处理时间为2min，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
实施例8
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中的超声处理时间为3min，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
实施例9
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中的超声处理时间为4min，其他工艺参数和操作步骤与实施例1完全相同。
实施例10
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将全血样本等分为两份，每份200μL，对两份相同的全血样本分别进行如下核酸提取：
(1)样本裂解：使用移液枪依次吸取200μL全血样本、500μL化学裂解液(pH＝7.2)、10μL蛋白酶K和20μL磁珠悬液加入反应杯中，在常温下对反应液进行超声处理1min，超声功率为10W，超声频率为20kHz，全血样本在超声、裂解液和蛋白酶K的作用下发生裂解；
其中，所采用的化学裂解液包括1mol/L的醋酸钠、3mol/L的盐酸胍、3mol/L的EDTA、0.5vol％的表面活性剂以及50vol％的聚乙二醇；
(2)核酸纯化：样本裂解完成后，对反应容器中的反应液进行聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，弃去上清液后，向反应容器内加入500μL的蛋白漂洗液对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，向反应容器内加入700μL清洗液进行第一次清洗，随后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，再次加入700μL清洗液进行第二次核酸清洗，最后对反应液依次进行超声5s和聚磁20s后弃去上清液，除醇2min，完成核酸纯化；
其中，所采用的蛋白漂洗液包括15mmol/L的吗啉丙磺酸、180mmol/L的氯化钠和5vol％的聚乙二醇；清洗液为70vol％的乙醇溶液；
(3)核酸洗脱：核酸纯化后，向反应容器内加入100μL洗脱液(pH值为8)，对反应液进行5W的低功率超声5s，随后在60℃下水浴5min，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来，随后经聚磁后吸取上清液，即为提取到的核酸。
实施例11
本实施例提供了一种基于超声波的核酸提取方法，将粪便样本等分为三份(分别记为样本A、样本B和样本C)，每份200mg，对三份相同的粪便样本分别进行核酸提取，核酸提取过程的具体操作及工艺参数与实施例1相同，不再赘述。
对比例1
采用TIANGEN粪便提取试剂盒对样本A、样本B和样本C分别进行核酸提取。
对比例2
采用奥盛的全自动核酸提取仪对样本A、样本B和样本C分别进行核酸提取。
对实施例1、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10提取到的核酸进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，实施例10采用瞬时超声+高温的方式进行核酸洗脱，可得到较完整的基因组DNA；实施例1、实施例7、实施例8和实施例9中均采用间歇式超声处理进行核酸洗脱，可得到打断的基因组DNA，打断后片段集中在2000bp以内，250bp以上，可满足大部分的下游PCR检测需求。
对实施例11、对比例1和对比例2提取到的核酸进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，实施例1采用本发明提供的超声法提取，对比例1采用柱提法提取，对比例2采用磁珠法提取，由图2可以看出，超声提取的核酸产物有打断效果，磁珠法提取和超声提取的产物中有明显的细菌RNA条带，柱提法提取中基本没有细菌RNA条带。
对实施例11、对比例1和对比例2提取到的核酸进行荧光定量PCR检测，检测三种核酸提取产物中人EGFR基因的扩增效果，检测结果如图3、图4和图5所示，三种方法提取的样本检测结果中，平均Ct值相差不大，超声法的为30.0，磁珠法的为30.0，柱提法的为30.6。采用相同提取方法处理的3份粪便样本(样本A、样本B和样本C)在检测结果的扩增曲线重复性上，超声提取(实施例11)的重复性最好，其次是柱提法提取(对比例1)，磁珠法提取(对比例2)的重复性略差。
对实施例1、实施例7、实施例8、实施例9和实施例10提取到的核酸用超微量分光光度仪表征，得到核酸的浓度和纯度结果如表1所示。
表1
对实施例11、对比例1和对比例2提取到的核酸用超微量分光光度仪表征，得到核酸的浓度和纯度结果如表2所示。
表2
由表2可以看出，采用本发明提供的核酸提取方法提取到的核酸纯度和浓度均优于柱提法和磁珠法。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于超声波的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取方法包括：将待测样本、化学裂解液、蛋白酶K和磁珠悬液放入反应容器内，在超声波的作用下进行样本裂解，随后进行核酸纯化，最后通过超声波处理和/或高温处理进行核酸洗脱。
2.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其特征在于，所述化学裂解液包括钠盐、蛋白变性剂、金属离子络合剂、表面活性剂和醇；
优选地，所述钠盐包括醋酸钠；
优选地，所述钠盐的摩尔浓度为0.5～2mol/L；
优选地，所述蛋白变性剂包括胍盐和/或尿素；
优选地，所述胍盐包括盐酸胍；
优选地，所述蛋白变性剂的摩尔浓度为2～5mol/L；
优选地，所述金属离子络合剂包括EDTA；
优选地，所述金属离子络合剂的摩尔浓度为1～5mol/L；
优选地，所述表面活性剂包括十二烷基肌氨酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X-100或吐温20中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述表面活性剂的体积浓度为0.25～1vol％；
优选地，所述醇包括乙醇、聚乙二醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述醇的体积分数为40～60vol％；
优选地，所述化学裂解液的pH值控制在7～7.5，进一步优选为7.4。
3.根据权利要求1或2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述样本裂解过程中采用的超声波的超声功率为0～15W且不为0，优选为10W；
优选地，所述样本裂解过程中采用的超声波的超声频率为10～30kHz，进一步优选为18～25kHz；
优选地，所述样本裂解过程中的超声波处理时间为1～4min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸纯化过程包括：
样本裂解完成后，对反应容器中的反应体系聚磁，使得裂解后的核酸吸附于磁珠表面，吸去上清液后，向反应容器内依次加入蛋白漂洗液和清洗液，对磁珠表面吸附的核酸进行漂洗和清洗。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述蛋白漂洗液包括吗啉丙磺酸、氯化钠和聚乙二醇；
优选地，所述吗啉丙磺酸的摩尔浓度为5～25mmol/L，进一步优选为10mmol/L；
优选地，所述氯化钠的摩尔浓度为150～200mmol/L，进一步优选为180mmol/L；
优选地，所述聚乙二醇的体积分数为1～10vol％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述清洗液为50～80vol％的乙醇溶液，进一步优选为75vol％的乙醇溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，加入蛋白漂洗液对核酸进行漂洗后，对反应溶液依次进行超声和聚磁，随后弃去上清液，再向反应容器内加入所述清洗液进行清洗；
优选地，所述清洗过程进行至少一次；
优选地，每次清洗结束后，对反应溶液依次进行超声和聚磁，随后弃去上清液，再向反应容器内加入清洗液，进行下一次清洗操作；
优选地，最后一次清洗结束后，对反应溶液进行除醇，随后进行核酸洗脱。
8.根据权利要求1-7任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸洗脱过程包括：
核酸纯化后，向反应容器内加入洗脱液，在超声波和/或高温的作用下，将磁珠表面吸附的核酸洗脱下来。
9.根据权利要求1-8任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述洗脱液包括缓冲液和络合剂；
优选地，所述洗脱液的pH值控制在7～9，进一步优选为8。
10.根据权利要求1-9任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸洗脱过程中采用的超声波的超声功率小于样本裂解过程中采用的超声波的超声功率；
优选地，所述核酸洗脱过程中采用的超声波的超声功率为1～10W，优选为5W；
优选地，所述核酸洗脱过程中的超声时间为1～5min；
优选地，所述高温处理的加热温度为50～70℃，进一步优选为60℃；
优选地，所述高温处理的加热时间为5～20min，进一步优选为10～15min；
优选地，在核酸洗脱过程中，所述超声波处理方式为间歇式超声。
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- 2021-10-25 CN CN202111251984.7A patent/CN113881663A/zh active Pending
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