CN106434639B - 一种无需转管的dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸提取纯化技术领域,具体涉及一种无需转管的DNA提取方法;包括如下步骤:1)试剂准备:配制裂解液、漂洗液、洗脱液,准备好组合管;2)DNA提取:样品放入组合管内层裂解管中,加入裂解液和蛋白酶K后裂解,离心,内层裂解管中的液体在穿过中层DNA吸附管内的核酸吸附膜时,被核酸吸附膜结合,分离并获得纯化的DNA;3)PCR扩增及电泳;本发明提取DNA无需转管,简化了DNA提取操作步骤,缩短了检测时间;避免了转管操作过程中可能带来的DNA损失和交叉污染的风险。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取纯化技术领域,具体涉及一种无需转管的DNA提取方法。
背景技术
DNA是遗传信息的载体,对于真核生物而言,核基因组DNA位于细胞核内,要获得纯化的DNA,首先需要裂解细胞膜、核膜等结构,使DNA被释放出来,然后去除细胞碎片、蛋白质、脂类、糖类等杂质,使DNA纯化;如果需要从拭子、粪便、泥土等样品中提取DNA,还要考虑去除拭子、粪便、泥土等杂质;目前,可供选择的DNA提取方法包括苯酚-氯仿抽提法、磁珠法、硅胶膜法、硅珠法等。
苯酚-氯仿抽提法的原理是,通过裂解液裂解细胞,利用有机溶剂使蛋白质变性与DNA分离,高速离心后,密度较大的有机相与变性的蛋白质、细胞碎片等位于下层,DNA溶于水相位于上层;将上层水相转移到新的容器中后,用异丙醇或乙醇将DNA沉淀浓缩,最后用水将DNA溶解,获得纯化的DNA。
磁珠法、硅珠法、硅胶膜法原理是,通过裂解液裂解细胞,利用裂解液裂解细胞,离心分离拭子、粪便、泥土等杂质和细胞碎片,上清液中只有DNA、蛋白质、脂类、糖类等可溶性成分;将上清液转移后,向其中加入高浓度离液盐和异丙醇或乙醇,利用磁珠、硅珠、硅膜表面的硅烷醇在高盐条件下结合DNA的特性,使DNA与其它可溶性杂质分离;然后用乙醇漂洗磁珠、硅珠、硅胶膜表面残留的离液盐,待乙醇挥发之后,利用硅烷醇在低盐条件下不结合DNA的特性,用水或TE缓冲液将纯化的DNA洗脱出来。
上述DNA提取方法都需要将含有DNA的溶液在不同容器转移,由于移液器吸头、离心管管壁等粘附的溶液中含有DNA,这必然会造成部分DNA的损失,另外,转移操作还有一定风险造成不同样品间的交叉污染;本发明涉及的一种无需转管的DNA提取方法和试剂,可以避免DNA提取操作过程中的转管操作。
发明内容
本发明为解决上述存在的问题,提供了一种无需转管的DNA提取方法,其解决技术问题的技术方案是:
一种无需转管的DNA提取方法,包含如下步骤:
1)试剂准备
配制裂解液、漂洗液、洗脱液,准备好组合管;
所述裂解液,其组成成分包括表面活性剂、离液盐、pH缓冲剂;
所述表面活性剂为:十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80、NP 40、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种及以上的混合,所述表面活性剂的浓度为0.1% m/v -10%m/v;
所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、高氯酸钠、碘化钾、碘化钠中的一种或两种及以上的混合,所述离液盐的浓度为3mol/l -5mol/l;
所述pH缓冲剂为Tris-HCl、Tris-醋酸、NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-K2HPO4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠,所述pH缓冲剂的pH值为4.5-9.0;
所述漂洗液为80%乙醇;
所述洗脱液,其组分为:10 mmol/l Tris-HCl,0.1 mmol/l EDTA-2Na,pH 8.0;
所述组合管,包含三层套管的结构,所述三层套管的结构,包含内层裂解管、中层DNA吸附管、外层收集管和盖子;所述裂解管为中空结构,顶部为裂解管管口,底部有收口,收口台阶上有疏水性过滤材料;所述吸附管为中空结构,顶部为吸附管管口,底部有收口,收口台阶上设有两层材料,上层为核酸吸附膜,下层为疏水性过滤材料;所述收集管顶部有收集管管口;所述盖子可分别盖在裂解管管口、吸附管管口、收集管管口上;盖子边缘有柔性长柄和收集管管口边缘连接,防止盖子掉落;
2)DNA提取
样品放入组合管内层裂解管中,加入裂解液和蛋白酶K后50-100℃裂解,离心,内层裂解管中的液体在穿过中层DNA吸附管内的核酸吸附膜时,被核酸吸附膜结合,分离并获得纯化的DNA;具体包括以下步骤:
a.将样品放入组合管裂解管中,加入400-500 μl裂解液和15-25 μl蛋白酶K,涡旋振荡混匀,50℃-100℃加热10-20分钟;
b.12000 rpm离心1-2分钟,丢弃裂解管,倒弃收集管中的液体,吸附管放回收集管,向吸附管内加入400-500 μl漂洗液,12000 rpm离心0.5-1.0分钟;
c.倒弃收集管的液体,吸附管放回收集管内,向吸附管内加入400 -500μl漂洗液,12000 rpm离心0.5-1.0分钟;
d.丢弃收集管,吸附管放入一根新的收集管,打开盖子,70℃加热3-4分钟;
e.向吸附管内加入30 μl洗脱液,盖上盖子,70℃加热3-4分钟,12000 rpm离心1-1.5分钟,丢弃吸附管,收集管内的液体即DNA溶液;
3)PCR扩增及电泳
将上步纯化的DNA进行PCR扩增,在电泳仪中检测DNA。
本发明具有以下有益效果:
本发明的一种无需转管的DNA提取方法,配制好裂解液、漂洗液、洗脱液,利用包含内层裂解管、中层DNA吸附管、外层收集管的组合管结构,DNA在裂解管内裂解,裂解完成后,通过离心,裂解管底部的筛板或滤膜使固体杂质与可溶性成分分离,吸附管底部的核酸吸附膜使DNA与可溶性杂质分离,实现在同一装置内,一次性分离纯化DNA;与现有技术相比,本发明技术无需转管,简化了DNA提取操作步骤,避免了转管操作过程可能带来的DNA损失和交叉污染的风险。
附图说明
图1是本发明中组合管的结构示意图。
图中:1.裂解管,2.吸附管,3.收集管,4.核酸吸附膜,5.过滤器,6.收集管管口,7.吸附管管口,8.裂解管管口,9.盖子。
图2是本发明实施例1中提取的DNA的复合STR扩增图谱。
图3是本发明实施例2中提取的DNA的复合STR扩增图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 针对总量500 pg DNA微量样品的提取
1)试剂准备
a.裂解液:其组分为5 mol/l 盐酸胍,2%月桂酰基肌氨酸钠(m/v),5% Tween 20,100 mmol/l Tris-HCl,100 mmol/l 柠檬酸钠,pH 7;
b.漂洗液:其组分为80%乙醇;
c.洗脱液:其组分为10 mmol/l Tris-HCl,0.1 mmol/l EDTA-2Na,pH 8.0;
d.组合管一套。
2)DNA提取
a.取一根无菌、无DNA污染的棉拭子,向棉拭子上滴加0.5μl Identifiler PlusPCR试剂盒9947A阳性对照DNA(1ng/μl),试剂盒由Appplied Biosystems公司提供;折断拭子头,放入组合管裂解管(1)中,加入400 μl裂解液,15 μl蛋白酶K,涡旋振荡混匀,50℃加热10分钟;
b.12000 rpm离心1分钟,丢弃裂解管(1),倒弃收集管(3)中的液体,吸附管(2)放回收集管(3),向吸附管(2)内加入400 μl漂洗液,12000 rpm离心0.5分钟;
c.倒弃收集管(3)的液体,吸附管(2)放回收集管(3)内,向吸附管(2)内加入400 μl漂洗液,12000 rpm离心0.5分钟;
d.丢弃收集管(3),吸附管(2)放入一根新的收集管(3),打开盖子,70℃加热3分钟;
e.向吸附管(2)内加入30 μl洗脱液,盖上盖子,70℃加热3分钟,12000 rpm离心1分钟,丢弃吸附管(2),收集管(3)内的液体即DNA溶液。
3)PCR扩增及电泳
PCR扩增使用Identifiler Plus试剂盒,由Applied Biosystems公司提供,10 μl扩增体系中含4 μl master mix、2 μl primer set、4 μl模板,扩增程序如下:
a.将扩增体系在95℃下恒温11分钟;
b.开始30个循环反应,每个循环反应条件为:在94℃下20秒,59℃下3分钟,60℃下10分钟,反复30次;
c.30个循环反应后,放置4℃环境下,保存待用。
电泳在ABI 3500XL仪器中进行;电泳上样体系为,1 μl PCR产物,9 μl甲酰胺,其中已加Liz。
图2是本实施例1中提取的DNA的复合STR扩增图谱,为粘有500 pg DNA拭子检测结果,16个基因座等位基因完整,峰高均在300以上,符合法医案件检测数据要求;证明本发明方法和试剂,能有效针对微量检材中的DNA进行提取。
实施例2 针对指纹脱落细胞的DNA提取
1)指纹样品的制作及采集:食指在干净玻璃窗户上按压5秒,湿的棉签搽拭指纹,用于DNA提取。
2)DNA提取
a.将上述1)中样品放入组合管裂解管(1)中,加入500 μl裂解液, 25 μl蛋白酶K,涡旋振荡混匀,100℃加热20分钟;
b.12000 rpm离心2分钟,丢弃裂解管(1),倒弃收集管(3)中的液体,吸附管(2)放回收集管(3),向吸附管(2)内加入500 μl漂洗液,12000 rpm离心1.0分钟;
c.倒弃收集管(3)的液体,吸附管(2)放回收集管(3)内,向吸附管(2)内加入500μl漂洗液,12000 rpm离心1.0分钟;
d.丢弃收集管(3),吸附管(2)放入一根新的收集管(3),打开盖子,70℃加热4分钟;
e.向吸附管(2)内加入30 μl洗脱液,盖上盖子,70℃加热4分钟,12000 rpm离心1.5分钟,丢弃吸附管(2),收集管(3)内的液体即DNA溶液;
3)PCR扩增及电泳
PCR扩增采用PowerPlex 21试剂盒,由Promega公司提供,10 μl PCR体系中包含,2μl master mix、2 μl primer set、6 μl模板,扩增程序如下:
a.将扩增体系在96℃下恒温1分钟;
b.开始30个循环反应,每个循环反应条件依次为:在94℃下10秒,59℃下1分钟,72℃下30秒;60℃下10分钟,反复30次;
c.30个循环反应后,放置4℃环境下,保存待用。
电泳参照实施例1中进行,图3是本实施例2中提取的DNA的复合STR扩增图谱,为指纹脱落细胞 DNA检测结果,21个基因座等位基因完整,峰高均在1000以上,符合法医案件检测数据要求;证明本发明方法和试剂,能有效针对微量检材中的DNA进行提取。
以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化;凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种无需转管的DNA提取方法,其特征在于,包含如下步骤:
1)试剂准备
配制裂解液、漂洗液、洗脱液,准备好组合管;
所述裂解液,其组成成分包括表面活性剂、离液盐、pH缓冲剂;
所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80、NP 40、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种及以上的混合,所述表面活性剂的浓度为0.1% m/v -10%m/v;
所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、高氯酸钠、碘化钾、碘化钠中的一种或两种及以上的混合,所述离液盐的浓度为3-5 mol/l;
所述pH缓冲剂为Tris-HCl、Tris-醋酸、NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-K2HPO4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠,所述pH缓冲剂的pH值为4.5-9.0;
所述漂洗液为80%乙醇;
所述洗脱液其组分为:10 mmol/l Tris-HCl,0.1 mmol/l EDTA-2Na,pH 8.0;
所述组合管,包含三层套管的结构,所述三层套管的结构,包含内层裂解管(1)、中层DNA吸附管(2)、外层收集管(3)和盖子(9);所述裂解管(1)为中空结构,顶部为裂解管管口(8),底部有收口,收口台阶上有疏水性过滤材料(5);所述吸附管(2)为中空结构,顶部为吸附管管口(7),底部有收口,收口台阶上设有两层材料,上层为核酸吸附膜(4),下层为疏水性过滤材料(5);所述收集管(3)顶部有收集管管口(6);所述盖子(9)可分别盖在裂解管管口(8)、吸附管管口(7)、收集管管口(6)上;盖子(9)边缘有柔性长柄和收集管管口(6)边缘连接;
2)DNA提取
DNA提取样品放入组合管内层裂解管中,加入裂解液和蛋白酶K后50℃-100℃裂解,离心,内层裂解管(1)中的液体在穿过中层DNA吸附管(2)内的核酸吸附膜(4)时,被核酸吸附膜(4)结合,分离并获得纯化的DNA;具体包括以下步骤:
a.将样品放入组合管裂解管(1)中,加入400-500 μl裂解液,15-25 μl蛋白酶K,涡旋振荡混匀,50℃-100℃加热10-20分钟;
b.12000 rpm离心1-2分钟,丢弃裂解管(1),倒弃收集管(3)中的液体,吸附管(2)放回收集管(3),向吸附管(2)内加入400-500 μl漂洗液,12000 rpm离心0.5-1.0分钟;
c.倒弃收集管(3)的液体,吸附管(2)放回收集管(3)内,向吸附管(2)内加入400 -500μl漂洗液,12000 rpm离心0.5-1.0分钟;
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3)PCR扩增及电泳
将上步纯化的DNA进行PCR扩增,在电泳仪中检测DNA。
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Granted publication date: 20180720 Termination date: 20211201 |
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