CN105385682B

CN105385682B - 快速提取人粪便细菌dna的简易方法

Info

Publication number: CN105385682B
Application number: CN201511009389.7A
Authority: CN
Inventors: 金谷雷; 牛耀芳
Original assignee: Hangzhou Gukun Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Gu He Information Technology Co., Ltd
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN105385682A

Abstract

本发明公开了一种快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，依次包括以下步骤：1)、人粪便样品的热‑冷破裂细胞；2)、AMPure XP磁珠液抓取DNA；3)、利用磁珠和磁力分离架的磁力吸附去除杂质以及纯化DNA。本发明的提取方法将物理方法(液氮冻融)和磁珠纯化有机结合，一个操作人员可以在1个小时同时提取约100个样品，这对于全面快速研究人群肠道菌群与相关疾病发生机制有重要意义。

Description

快速提取人粪便细菌DNA的简易方法

技术领域

本发明属于生物学，医学领域；具体涉及一种快速提取人粪便细菌DNA的简易方法。

背景技术

肠道微生物菌群是一个庞大复杂的生态系统，它占全身微生态菌总数80％左右。包含有100万亿种微生物，涉及1000类菌种，其数量是人体细胞数量的10倍免疫系统。这些细菌有助于人体消化食物，产生维生素以预防食物中细菌所诱发的疾病，同时刺激。随着研究深入，科学家发现肠道微生物在许多慢性疾病和症状中，如炎症、肥胖等也起了关键作用。肠道微生物菌群与宿主遗传因素之间也应该存在密切关系，人的基因会对肠道微生物菌群产生重要影响，从某种意义上说，肠道微生物菌群也是人的基因的一种表型。因此从DNA分子水平诊断患者细菌感染和带菌情况是目前临床诊断的发展趋势。因此，临床标本中细菌DNA的提取方法的优化显得尤为重要。人体肠道中存在大量的正常菌群和待检测的致病菌，而粪便作为一种非损伤性的临床标本取材方便，同时也包含了大量肠道菌群信息。肠道菌群与肥胖、心血管系统等多种疾病相关。鉴于肠道菌群的重要性，研究人群肠道菌群的群落结构(如种类、数量、比例、定位和生物学特性等)具有重要的意义。肠道菌群的研究方法主要有传统法和分子生物学的方法。传统法的培养法和镜鉴法主要用于早期肠道菌群方面的研究。目前，分子生物学技术检测粪便中细菌基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)是探讨人肠道菌群的群落结构的重要方法。从人粪便中提取高质量的肠道菌群总基因组DNA是研究分析肠道菌群与相关疾病发生机制的基础和前提。粪便样品中含有大量肠道菌，同时也含有各种肠道脱落细胞、腐殖质以及多种无机物和有机物等。因此，能否提取粪便中细菌基因组DNA成为影响探寻肠道菌群多样性和差异性的关键因素。目前，从粪便标本中提取细菌DNA的方法众多，如试剂盒法、化学—冻融研磨法和化学裂解法。试剂盒法即采用生物公司生产的商业化试剂盒直接提取DNA；化学裂解法主要是利用溶菌酶、SDS与蛋白酶K等试剂使微生物细胞破裂进而提取DNA；化学—冻融研磨法主要是将物理方法与化学方法相结合提取DNA。传统法所使用的酚/氯仿/异戊醇抽提每次抽提都会损失一部分核酸，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低。CTAB法(加硫氰酸胍法)使用含CTAB的裂解液，对于去除样品中的多糖成分具有显著效果，但是洗涤除去CTAB要比去除其他盐离子更困难，同时CTAB的少量残留也会对酶活性有很大的影响。试剂盒法避免了苯酚和氯仿对人体的危害，且离心柱子式的洗涤效率比传统洗涤效率高，柱式纯化的核酸纯度也较高，但是在操作过程中有时会出现蛋白酶消化不完全所导致柱子阻塞现象。而且以上这些方法由于提取机理和步骤的差别，获得DNA的量及纯度各不相同，导致在后续实验，如PCR扩增、DNA测序和限制性核酸内切酶的分析等的应用效果不同。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速提取人粪便细菌DNA的简易方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，依次包括以下步骤：

1)、人粪便样品的热-冷破裂细胞；

2)、AMPure XP磁珠液抓取DNA；

3)、利用磁珠和磁力分离架(例如为标准96孔磁力分离架，可用于标准96孔PCR板)的磁力吸附去除杂质以及纯化DNA。

作为本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法的改进：

所述步骤1)为：

通过无菌棉签沾取人粪便至棉签变色(约0.2g)，将棉签在250～350ul(例如为300ul)的2％SDS裂解液里反复震荡混匀(约1min)，从而使无菌棉签沾取的人粪便落入2％SDS裂解液中，以此作为人粪便样品液；

该人粪便样品液装入容器中，先于60～70℃(较佳为65℃)水浴8～12min(例如为10min左右)，水浴期间摇匀(例如每5min摇匀一次)，得前处理人粪便样品，然后将前处理人粪便样品进行下述的热-冷破裂处理：

先放入液氮中冻融至完全冰冻成固态，然后放入60～70℃(较佳为65℃)的水浴锅加热2～3min；再重复上述冰冻-加热1～3次；最后于60～70℃(较佳为65℃)保温8～12min(即，最后一次水浴延长时间至10～15min)。

2％SDS裂解溶液为2g SDS(十二烷基硫酸钠)加入100ml ddH₂O水中配制而得。

作为本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法的进一步改进：

所述步骤2)为：步骤1)的所得物经离心或静止处理后(例如8000g离心1分钟或静止10min)，取上清液(80～100ul上清液)至新的PCR管(例如为200ul PCR管)中，加入1/2上清液体积的AMPure XP磁珠液，用移液器反复吸打混匀，室温静置5～10min。

注：AMPure XP磁珠液生产厂家Beckman Coulter，型号A63881。

所述步骤3)为依次进行步骤：

①、将带有步骤2)所得物的PCR管于3000～5000rpm的转速快速离心(时间为3～5s)(目的使壁和管盖上的液体流入管底)，然后垂直置于磁力分离架(96孔磁力分离架)上，待PCR管中的液体澄清(大约需要5min)后，小心吸除上清液(勿碰触到磁珠)，然后加入70～90ul PEG8000，用移液枪吸打混匀(此步骤操作中PCR管仍然置于96孔磁力分离架上)，然后室温静置5～10min；

②、在步骤①的产物中(即，向上述得到的PCR管中)加入180～220ul体积浓度80％的酒精清洗磁珠表面20～40s(不需要吸打)，然后吸除上清废液(步骤中PCR管一直在96孔磁力分离架上)；

重复上述酒精清洗和吸除上清废液的步骤，然后瞬时离心(转速为3000～5000rpm，时间为3～5s)，并将残余的废液吸除干净，室温晾干使其出现龟裂(大约需要10min)；

③、在步骤②的所得物中加入25～35ul的ddH₂O，然后吸打混匀磁珠(此步骤操作时PCR与96孔磁力分离架分离)；

④、将上述PCR管再次置于到磁珠板上，待磁珠和液体分离，直到液体澄清，吸取液体到新的PCR管中，检测DNA其浓度和纯度。

本发明的目的是克服以往从人粪便中提取高质量的肠道菌群总基因组DNA过程的繁琐性、破坏性、价格高以及不同样品提取量波动较大的缺陷，本发明提供一种采集和提取简便、操作简单、对人和环境危害小，质量稳定、成本低、易标准化、且可以一次同时提取上百个样品的提取方法。该提取方法将物理方法(液氮冻融)和磁珠纯化有机结合，一个操作人员可以在1个小时同时提取约100个样品，这对于全面快速研究人群肠道菌群与相关疾病发生机制有重要意义。

本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，利用热-冷交替物理快速破裂细菌细胞，离心后，经过PEG8000-磁珠结合DNA分子-吹打混匀-静置后，酒精洗涤磁珠表面从而去除其他盐离子，然后加ddH₂O(无菌去离子水)分离磁珠与DNA并将DNA溶解在水里的抽提方法，所获得的DNA质量较高(片段大、纯度高)，可用于PCR、多重荧光PCR-毛细管电泳(FM-CE)、变性液相色谱(DHPLC)分析、直接DNA测序等分子生物学方法分析。

作为本发明的前置条件和步骤为：1)本发明的人粪便取样装置包括：一个长方形包装盒，一个内置塑料支撑板，两个2ml冻存管和一个8-13cm长的医用无菌取样棉签，其中一个冻存管里装有300ul ddH₂O，另一个冻存管里装有300ul 2％SDS裂解液。且每个冻存管贴好相应的标签。将两个冻存管分别放置于相应的内置塑料支撑板上，和棉签以及取粪便样的简单说明书一起置于长方形包装盒封好。

作为本发明的前置条件和步骤为：2)利用上述取样装置取完样品后，粪便样品是溶解在装有300ul SDS裂解液的冻存管中。本方法适合常温保存以及长时间放置，有利于大范围收集，运输和存储粪便样品，为后续的提取提供了更好的基础和保证(建议取样完毕尽快寄回)。

作为本发明的前置条件和步骤为：

PEG8000混合液的配置，10g PEG8000和7.3g NaCl加入ddH₂O水50ml，然后慢慢混匀。

2％SDS裂解溶液的配制：2g SDS加入100ml ddH₂O水，搅拌溶解，配置2％SDS裂解溶液。

作为本发明一种较佳的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，依次包括以下步骤：

1、AMPure XP磁珠液用之前放置常温30min，然后震荡混匀；

2、人粪便样品的裂解液管65℃水浴10min左右，期间5Min摇匀一次；

3、将上述步骤2的冻存管放入液氮中冻融至完全冰冻，拿出放入水浴锅2-3min，该步骤重复三次(最后一次水浴延长时间至10-15min)；

4、8000g离心1分钟，取80ul上清液至新的200ulPCR管中(如大规模提取加入到96孔PCR板中)，加入40ul磁珠液，用枪反复吸打混匀至少10次，室温静置5min；

5、快速离心PCR管(使壁和管盖液体流入管底)，然后垂直置于96孔磁力分离架上，待PCR管中的液体澄清(大约需要5min)后，小心吸除上清液(勿碰触到磁珠)，然后加入80ulPEG8000，用移液枪吸打混匀至少10次(此步骤操作中PCR管仍然置于96孔磁力分离架上)，然后室温静置5min；

6、快速离心PCR管(使壁和管盖液体流入管底)，然后垂直置于96孔磁力分离架上，待PCR管中的液体澄清(大约需要5min)后，小心吸除上清液(勿碰触到磁珠)；

7、在上述步骤6的PCR管中加入200ul 80％的酒精清洗磁珠表面30s(不需要吸打)，然后小心的吸除上清废液(这个过程PCR管一直在磁珠板上)；

8、重复步骤9，然后瞬时离心，并将残余的废液除干净，晾干使其出现龟裂(大约需要10min)；

9、加入30ul的ddH₂O到上述步骤8完毕后的PCR管中，然后吸打混匀磁珠(此步骤操作时PCR板与96孔磁力分离架分离)；

10、将上述PCR管再次置于到磁力板上，待磁珠和液体分离，直到液体澄清，吸取液体到新的PCR管中，检测DNA其浓度和纯度。

本发明的主要发明点在于：克服以往从人粪便中提取高质量的肠道菌群总基因组DNA过程的繁琐性、破坏性、价格高以及难以重复性，提供一种采集和提取简便、操作简单、对人和环境危害小，质量稳定、成本低、易标准化、且可以一次同时提取上百个样品的提取方法。

此方法提出的粪便DNA浓度在50-100ng/ul(加入粪便量约为50mg，提取DNA总量随与粪便量增加而增加，相应的裂解液量需要等比增加)，电泳条带清晰无拖尾，无弥散(如图3，左侧为marker，最上方条带长度为15kb，左侧第二和第三泳道为提取的2个样本DNA结果)。长期放置(6个月以上)提取结果无明显影响(如图3，最右侧泳道为左侧第二泳道同一样品于裂解液中-20℃放置1个月后提取结果)。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，利用整个过程只用到液氮、SDS、PEG8000、酒精、NaCl五种简单普通的试剂，且对环境和人体危害极小，所用的仪器耗材水浴锅、离心机、移液枪、枪头、和96孔磁力分离架等，均为基础仪器耗材，一般实验室基础配置，因此本发明具有提取成本低、环保性高、可反复使用等特点。

2)裂解成本低，不易被污染。溶解在冻存管中粪便样品只需经过水浴65℃-液氮反复冻融2-3次后，细胞便破裂，且不会破坏DNA分子(见电泳图，图3)。在不使用溶菌酶的情况下仍可以提取如金黄色葡萄球菌等厚细胞壁的菌DNA(注：数据结果显示，MOBIO试剂盒能提取到的样本，本方法同样可以提取到金黄色葡萄球菌DNA)。以下列表1列出了与试剂盒MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit(12888-100)对相同样本的比较，提取后DNA使用相同方法进行PCR并进行16s测序后统计。

表1

备注：HAA、ZNN、TFF、LMF代表粪便来源主体姓名首字母简写。

3)本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法原理简单，易掌握，为该技术的全面和广泛应用奠定了基础。

4)以往传统提取方法对粪便样本要求量大，污染多，试剂盒提取价格较高，而提取过程中步骤多，时间长，浪费较大，对环境和人危害较高，本发明快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，仅需微量粪便样品即可快速提取出符合PCR和后续测序的高质量DNA，且杂质少，腐殖酸残留低对后续PCR等实验无抑制。由于采用冻融和磁珠方法，无需离心等步骤，方法便于大规模和自动化操作。每人每小时便可提取上百个样品，效率高，可实现大批量操作，结果重复性好。

5)本发明粪便样品可长期储存于SDS样品管中并保持样品DNA的稳定，且对样品量和储存条件要求不高(-30-45度)，这十分便于样品的长途采集和运输。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法原理示意图；

图2是本发明的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法流程示意图；

图3是电泳图。

具体实施方式

实施例1、现以正常人粪便为例，非限定实施例叙述如下：

现取96个不同人粪便样品开始提取；具体如下：

1)AMPure XP磁珠液用之前常温放置30min，然后震荡混匀；

2)通过8-13cm长的医用无菌取样棉签沾取人粪便至棉签变色(约0.2g)，将棉签在300ul的2％的SDS裂解液里反复震荡混匀1min，以此作为人粪便样品液；

人粪便样品的裂解液管65℃水浴10min左右，水浴期间5min摇匀一次；得前处理人粪便样品；

3)、将前处理人粪便样品进行下述的热-冷破裂处理：

将上述步骤2)的冻存管(前处理人粪便样品)放入液氮中冻融至完全冰冻，拿出放入65℃水浴锅3min，该步骤共重复三次(最后一次水浴延长时间至15min)；

4)8000g离心1分钟，取80*96ul上清液至新的96个200ulPCR板中，加入40*96ul磁珠液，用排枪反复吸打混匀10次，室温静置5min；

5)快速离心整板PCR管(使壁和管盖液体流入管底)，然后垂直置于96孔磁力分离架上，待PCR中的液体澄清(5min)后，用排枪小心吸除上清液(勿碰触到磁珠)，然后加入80*96ul PEG8000，用排枪吸打混匀10次(此步骤操作中PCR管仍然置于96孔磁力分离架上)，然后室温静置5min；

6)快速离心整板PCR管(使壁和管盖液体流入管底)，然后垂直置于96孔磁力分离架上，待PCR中的液体澄清(5min)后，用排枪小心吸除上清液(勿碰触到磁珠)；

7)在上述步骤6的PCR管中加入200*96ul 80％的酒精清洗磁珠表面30s(不需要吸打)，然后小心的吸除上清废液(这个过程PCR板一直在磁珠板上)；

8)重复步骤9，然后瞬时离心，并将残余的废液除干净，晾干使其完全龟裂(10min)；

9)加入30*96ul的ddH₂O到上述步骤8完毕后的PCR中，然后吸打混匀磁珠(此步骤操作时PCR板与96孔磁力分离架分离)；

10)将上述PCR板再次置于到磁珠板上，待磁珠和液体分离，直到液体澄清，吸取液体到新的PCR管中，检测DNA其浓度和纯度，-20℃保存。

随机取18个样品跑电泳，胶图如下：

1-9,10-18泳道为DNA，中间道为15K Mark。

根据该图3，我们能得知：提取获得DNA得率高，片段较长，完整无降解，样品间提取质量稳定。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的较相关变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、人粪便样品的热-冷破裂细胞；

通过无菌棉签沾取人粪便至棉签变色，将棉签在250～350ul的2％SDS裂解液里反复震荡混匀，从而使无菌棉签沾取的人粪便落入2％SDS裂解液中，以此作为人粪便样品液；

该人粪便样品液装入容器中，先于60～70℃水浴8～12min，水浴期间摇匀，得前处理人粪便样品，然后将前处理人粪便样品进行下述的热-冷破裂处理：

先放入液氮中冻融至完全冰冻成固态，然后放入60～70℃的水浴锅加热2～3min；再重复上述冰冻-加热1～3次；最后于60～70℃保温8～12min；

2)、AMPure XP磁珠液抓取DNA；

3)、利用磁珠和磁力分离架的磁力吸附去除杂质以及纯化DNA；

依次进行以下步骤：

①、将带有步骤2)所得物的PCR管于3000～5000rpm的转速快速离心，然后垂直置于磁力分离架上，待PCR管中的液体澄清后，吸除上清液，然后加入70～90ul PEG8000，用移液枪吸打混匀，然后室温静置5～10min；

②、在步骤①的产物中加入180～220ul体积浓度80％的酒精清洗磁珠表面20～40s，然后吸除上清废液；

重复上述酒精清洗和吸除上清废液的步骤，然后瞬时离心，并将残余的废液吸除干净，室温晾干使其出现龟裂；

③、在步骤②的所得物中加入25～35ul的ddH₂O，然后吸打混匀磁珠；

2.根据权利要求1所述的快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，其特征是：

所述步骤2)为：步骤1)的所得物经离心或静止处理后，取上清液至新的PCR管中，加入1/2上清液体积的AMPure XP磁珠液，用移液器反复吸打混匀，室温静置5～10min。