CN104232761A - 基因全片段快速测序方法 - Google Patents

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赵倩
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Abstract

本发明提供了基因全片段(>50kb)快速测序方法，该方法包括以下步骤：(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR条件优选96℃～100℃变性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35个循环；(2)标准化PCR产物；(3)制备测序文库；(4)基因测序。使用本方法可在相同PCR条件下扩增不同长度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火温度及延伸时间即可成功扩增出目的片段，结合MiSeq平台进行测序，为长链PCR与新一代基因测序技术的结合应用提供了一种24小时内生成结果的快速有效的方法。

Description

基因全片段快速测序方法
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及基因全片段快速测序方法。 
背景技术
为了获得目的物的类型和是否具有相关突变等一系列信息，近年来各国相继建立起病毒变异和耐药基因序列测定的方法。基因序列测定分析法同其他方法相比，在技术上和经济上都具有明显优势。基因序列测定分析法检测的是易突变区域的完整序列。新一代的个人基因组测序仪，如IIIumina的MiSeq和Ion Torrent公司的PGM，已普遍应用与科研和临床检测。这些测序平台的多用性和灵活性更适用于科研周期较快速的小型实验室的科研。将测序与长链PCR结合可以为遗传变异检测提供更快捷更经济的方法。 
自聚合酶链反应(PCR)出现以来，已成为分子生物学中克隆DNA小片段不可或缺的方法之一。1992年，Barnes研发了新的PCR条件可以使扩增片段达5KB，通过改变酶的条件，长链PCR的扩增片段可以从3-5KB至超过30KB。长链PCR技术的进步使得PCR更快速、更简洁的用于基因组图谱和测序，并促进分子遗传学的研究。然而，传统的PCR有扩增片段长度的限制，且在实验中成功地扩增所有扩增子，需要改变退火温度和延伸时间，这是因为扩增子不同的长度及引物具有不同Tm值。 
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基因全片段快速测序方法，该方法结合了长链PCR与新一代基因测序技术且PCR扩增在相同PCR条件下即可扩增目的片段。 
基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤： 
(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR条件优选96℃～100℃变性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35个循环； 
(2)标准化PCR产物； 
(3)制备测序文库； 
(4)基因测序。 
本发明提供的基因全片段快速测序方法的有益效果是：本发明在相同PCR条件下扩增不同长度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火温度及延伸时间即可成功扩增出目的片段，并结合MiSeq平台进行测序，为长链PCR与新一代基因测序技术的结合应用提供了一种快速有效的方法。 
附图说明
图1是扩增所得目的片段 
图2是与遗传性乳腺癌相关的致病突变，该突变为BRCA2中c.5946delT 
图3是所有样品中存在的突变，该突变为BRCA2中c.4563A>G 
图4是所有样品中存在的突变，该突变为c.2972A>G 
图5是样品2,7,8存在的突变，该突变为BRCA1中c.1941C>T和c.1936G>A 
具体实施方式
本发明提供的基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤： 
(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR条件优选96℃～100℃变性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35个循环； 
(2)标准化PCR产物； 
(3)制备测序文库； 
(4)基因测序。 
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。 
收集八位对照组患者和实验组1例遗传性乳腺癌患者的外周血，提取DNA用于长链PCR扩增和下一代测序，以评估实验能否在一组患者中稳定使用并成功地识别阳性突变位点。 
乳腺癌易感基因的快速测序方法步骤如下： 
(1)选用TaKaRa公司的PrimeSTAR GXL DNA酶，采用在同一温度下退火延伸的二步法，在相同PCR反应条件下扩增BRCA1和BRCA2的全基因区域，BRCA1基因定位为CHR17:41196312-41279500，GRCh37/hg19，BRCA1基因定位为CHR13:32889617-32973809，GRCh37/hg19。 
PCR扩增体系：35ng DNA模板，2.5μmol/L的引物3.2μL，5×PrimeSTAR缓冲液4μL，1.6μL dNTP，0.4LPrimeSTAR GXL DNA酶，加蒸馏水至反应体系总体积20μL。所述引物序列见表1。 
表1 BRCA1和BRCA2基因引物序列 
*Brca1.9的扩增反应体系需0.4μL二甲基亚砜 
PCR反应条件：98℃变性10sec，68℃退火延伸10min，30个循环。 
(2)采用Agencourt AMPure XP PCR试剂盒纯化目的片段，使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒标准定量DNA。 
(3)采用Nextera XT试剂盒进行文库制备。 
(4)使用IIIumina的MiSeq平台进行测序，测序参数为2×250读长。用FastQC评估测序数据，使用BWA-MEM默认参数将测序数据比对至UCSC hg19数据库。使用GATK分析突变，并将产生的SNP位点进行一系列过滤，其中包括QD＜2.0，FS＞60.0，MQ＜40.0，MappingQualityRankSum＜-12.5，ReadPosRankSum＜-8.0。缺失位点通过QD＜2.0，ReadPosRankSum＜-20和FS＞200过滤。使用wANNOVAR网络服务器注释外显子和内含子的变异，确定该变异是否在公共数据库中存在，并预测检测到的非同义突变是否已被多个评分系统预测。 
对于所有样本，采用TaKaRa公司的PrimeSTAR GXL DNA酶在相同PCR反应条件下均能成功扩增出目的片段，并且没有非特异性扩增，扩增片段见图1。实验中无需改变退火温度及延伸时间即可成 功扩增所有扩增子。 
为了比较长链PCR和捕获阵列的目的基因覆盖率，评估了Agilent的SureDesign、HaloPlex和Nimblegen SeqCap的捕获方法，见表2，其外显子的理论覆盖率为98％以上，但对于包含外显子和内含子的全基因片段，只有HaloPlex可以达到95％以上的覆盖率，这可能是因为测序偏差和高GC模板难以捕获。 
表2外显子和内含子的理论覆盖率对比表 
实验中的长链PCR全目的基因的理论覆盖率高达100％，尽管样品存在不均一的测序深度，长链PCR仍可获取高达100.00％的覆盖率的BRCA1和BRCA2的全基因。并且长链PCR制作文库的成本约是SureDesign和HaloPlex的四分之一。 
9例DNA样本的MiSeq测序结果见表3，平均每个样本有460万通过质量控制的读序，有99.41％可以正确的成对比对。每个样品平均有70.99％的读序可以比对到目的区域。在目的区域中的平均覆盖率为2261X和有93.75％目标区域覆盖了超过10个读序，而且目标区域的覆盖率至少有一个读序的区域达98％。与其他样本相比较，一例遗传性乳腺癌样本和一例对照组中样本具有较低的覆盖率，可能是因为这两个样品储存时间过长，有更多的DNA降解导致的。 
表39例DNA样本BRCA1和BRCA2的MiSeq测序结果 
*Con：对照组样本，#BC：遗传性乳腺癌样本 
我们检测并分析了九例样品所产生的变异，平均每例样本有234SNVs，绝大多数为非编码区的变异。根据wANNOVAR网络服务器的注释，九个样品分别有4,8,3,7,4,2,7,7和6个非同义SNVs。此外，还明确了在对照组中的一个非移码突变的缺失和在遗传性乳腺癌患者中一个移码突变的缺失。这是一个已知的与遗传性乳腺癌相关的致病突变,该突变BRCA2中c.5946delT，见图2，可以在Integrative Genomics Viewer证实。在其他样品中还检测到一些其他无意义的突变，见图3、图4、图5。 
虽然，在BRCA1和BRCA2基因编码区的突变已被大量研究，但潜在的有害突变也可以位于研究较少的非编码的内含子序列。例如，在一个有5位乳腺癌患者的家族中，发现了BRCA1基因中内含子24的3＇非编码区的插入/缺失突变。另外，在泰国一个被确诊的乳腺癌家族中，在BRCA1新发现了一个内含子突变IVS7+34_47delTTCTTTTCTTTTTT和两个未明确的内含子变异，反义链的IVS7+34_47delAAGAAAAGAAAAAA和正义链的IVS750_63del TTCTTTTTTTTTTT，据报道，内含子突变c.6937+594 T＞G可以激活BRCA2中一外显子而扰乱乳腺癌家族编码序列。对于这些区域，为了获取对BRCA1和BRCA2的基因型-表型关系的更全面的了解，检查内含子和外显子区域都是至关重要的。 
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤：(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR条件下扩增不同基因片段,所述PCR条件优选96℃～100℃变性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35个循环；(2)标准化PCR产物；(3)制备测序文库；(4)基因测序。
2.根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤(1)所述基因片段为BRCA1和BRCA2基因。
3.根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤(2)所述标准化PCR产物采用Agencourt AMPure XP PCR试剂盒纯化目的片段，使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒标准定量DNA。
4.根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤(3)所述文库制备采用Nextera XT试剂盒进行制备。
5.根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤(4)所述基因测序采用IIIumina的MiSeq平台进行测序，使用BWA进行比对，GATK软件分析突变，wANNOVAR网络服务器注释分析结果。
6.根据权利要求5所述的基因测序，其特征在于：IIIumina的MiSeq平台进行测序的测序参数为2×250读长。
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