CN104498477A - Ctab法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CTAB法提取动物微生物粪便基因组的试剂盒及其提取方法，所述试剂盒主要是通过溶菌酶破碎粪便中的微生物细胞，利用CTAB溶液去除含有的蛋白杂质，同时利用硅基生物磁珠可以特异性吸附核酸的原理，将动物粪便中微生物的基因组吸附出来，本试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动物粪便微生物基因组。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及其提取方法。
背景技术
动物肠道是一类典型而又独特的环境，过去将粪便微生物作为资源研究的极少。动物体在“出生前”是无菌的，在动物出生的过程中及与外界环境的接触中(包括呼吸、食物摄取等所有的生命活动)，有大量微生物进入体内，并由自身的遗传基因和饮食等特性决定而形成自身特有的稳定的肠道微生物系统。
一方面,宿主肠道为肠道微生物提供优越的栖息和繁殖环境。宿主满足了肠道微生物生长和繁殖所需要的各种生理条件，包括氧气天然的隔绝、充足的营养物质以及适宜的温度和pH值等。绝大多数生活在肠道内的微生物是专性或兼性厌氧微生物,他们的生长和繁殖需要自然界中很少见的厌氧环境，肠道生理特性可以为专性和兼性厌氧微生物创造出所需的厌氧环境。另一方面，肠道微生物及其基因组赋予人类没有必要在自身上进化的代谢特性，弥补了宿主动物的某些生物学不足。尽管我们对宿主-肠道微生物之间关系已经有了一定认识，但他们之间具体的相互关系及作用机理，还需要我们倾注更多的努力和研究来更加深刻的认识和理解他们，并对他们加以开发利用。
当前对肠道微生物菌群的认识，主要是通过选择性培养基获得粪便菌群纯培养物而取得的，然而近年来随着宏基因组学的发展，利用于16S rRNA基因的免培养分析技术越来越受重视，利用16S rRNA基因的免培养分析技术进行肠道微生物多样性的分析的前提要求是要提取到动物粪便的微生物基因组DNA。因此，为了更好地研究肠道微生物与动物之间的关系，提供一种提取动物粪便微生物基因组的试剂盒十分有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及其提取方法，所述试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动物粪便微生物基因组。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝7-8；
工作液B：由终浓度10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)和终浓度1-10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)组成，pH＝5.0-8.0；
工作液C：10-50mg/ml溶菌酶；
工作液D：20-50mg/ml蛋白酶K；
工作液E：质量浓度10-20％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液F：3-8mol/L氯化钠(NaCl)；
工作液G：由终浓度0.14-0.28mol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和终浓度0.5-1mol/L氯化钠(NaCl)组成；
工作液H：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液I：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
工作液J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液＝24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
工作液K：由终浓度4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),终浓度2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),终浓度42.9-85.7mmol/L Nacl和体积终浓度60-80％无水乙醇组成；
工作液L：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0-9.0。
所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000。
本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如工作液A：由终浓度0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝7-8；是指磷酸二氢钾在工作液A中的浓度为0.25-0.37mol/L，氢氧化钠在工作液A中的浓度为0.175-0.2mol/L，工作液A的pH＝7-8。
所述试剂盒的提取方法，包括粪便的前处理、粪便中微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，RNA的吸附以及磁珠法回收微生物基因组，具体步骤如下：
1)粪便的前处理：称取0.3-0.5g粪便于2ml离心管中，加入1-2ml工作液A振荡1-2min，3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；
2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600μl工作液B和50-60μl工作液C，混匀后，37-40℃水浴1-2h，加入65-70μl工作液D和65-70μl工作液E，混匀后，37-60℃水浴1-2h；加入100-200μl Buffer F和50-100μlBuffer G溶液，混匀后，65-80℃水浴10-20min；
3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800μl工作液H，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10-20s后，室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入1-2ml Buffer K,打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100μl Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
本发明采用以上技术方案，所述试剂盒主要是通过溶菌酶破碎粪便中的微生物细胞，利用CTAB溶液去除含有的蛋白杂质，同时利用硅基生物磁珠可以特异性吸附核酸的原理，将动物粪便中微生物的基因组吸附出来，所述试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动物粪便微生物基因组。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒提取的动物粪便微生物基因组于1％琼脂糖凝胶中的电泳检测图：
泳道1，2是利用本发明试剂盒提取到的动物粪便微生物基因组；
泳道3为TAKARA公司的DL4500marker。
具体实施方式
一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝7-8；
工作液B：由终浓度10-20mmol/L Tris和终浓度1-10mmol/L EDTA组成，pH＝5.0-8.0；
工作液C：10-50mg/ml溶菌酶；
工作液D：20-50mg/ml蛋白酶K；
工作液E：质量浓度10-20％的SDS；
工作液F：3-8mol/L NaCl；
工作液G：由终浓度0.14-0.28mol/L CTAB和终浓度0.5-1mol/L NaCl组成；
工作液H：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液I：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
工作液J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液＝24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
工作液K：由终浓度4.3-21.4mmol/L Tris,终浓度2.1-4.2mmol/L EDTA,终浓度42.9-85.7mmol/L Nacl和体积终浓度60-80％无水乙醇组成；
工作液L：8-10mmol/L Tris，pH＝8.0-9.0。
本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如工作液A：由终浓度0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝7-8；是指磷酸二氢钾在工作液A中的浓度为0.25-0.37mol/L，氢氧化钠在工作液A中的浓度为0.175-0.2mol/L。
所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)粪便的前处理：称取0.3-0.5g粪便于2ml离心管中，加入1-2ml工作液A振荡1-2min，3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；
2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600μl工作液B和50-60μl工作液C，混匀后，37-40℃水浴1-2h，加入65-70μl工作液D和65-70μl工作液E，混匀后，37-60℃水浴1-2h；加入100-200μl Buffer F和50-100μlBuffer G溶液，混匀后，65-80℃水浴10-20min；
3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800μl工作液H，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10-20s后，室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入1-2ml Buffer K,打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100μl Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
实施例1
一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.25mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175mol/L氢氧化钠组成，pH＝7.2；
工作液B：由终浓度10mmol/L Tris和终浓度1mmol/L EDTA组成，pH＝8.0；
工作液C：20mg/ml溶菌酶；
工作液D：20mg/ml蛋白酶K；
工作液E：质量浓度10％的SDS；
工作液F：5mol/L NaCl；
工作液G：由终浓度0.14mol/L CTAB和终浓度0.5mol/L NaCl组成；
工作液H：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液I：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
工作液J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液＝24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
工作液K：由终浓度8.6mmol/L Tris,终浓度3.4mmol/L EDTA,终浓度60mmol/L Nacl和体积终浓度70％无水乙醇组成；
工作液L：8mmol/L Tris，pH＝8.0。
实施例2
一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝8；
工作液B：由终浓度20mmol/L Tris和终浓度10mmol/L EDTA组成，pH＝5.0；
工作液C：50mg/ml溶菌酶；
工作液D：50mg/ml蛋白酶K；
工作液E：质量浓度20％的SDS；
工作液F：3mol/L NaCl；
工作液G：由终浓度0.28mol/L CTAB和终浓度1mol/L NaCl组成；
工作液H：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液I：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
工作液J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液＝24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
工作液K：由终浓度21.4mmol/L Tris,终浓度4.2mmol/L EDTA,终浓度85.7mmol/L Nacl和体积终浓度80％无水乙醇组成；
工作液L：10mmol/L Tris，pH＝9.0。
实施例3
一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.25mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175mol/L氢氧化钠组成，pH＝7；
工作液B：由终浓度15mmol/L Tris和终浓度5mmol/L EDTA组成，pH＝6.5；
工作液C：10mg/ml溶菌酶；
工作液D：35mg/ml蛋白酶K；
工作液E：质量浓度15％的SDS；
工作液F：8mol/L NaCl；
工作液G：由终浓度0.21mol/L CTAB和终浓度0.75mol/L NaCl组成；
工作液H：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液I：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
工作液J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液＝24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
工作液K：由终浓度4.3mmol/L Tris,终浓度2.1mmol/L EDTA,终浓度42.9mmol/L Nacl和体积终浓度60％无水乙醇组成；
工作液L：9mmol/L Tris，pH＝8.5。
实施例4
利用实施例1的试剂盒，提取动物粪便微生物基因组，具体包括以下步骤：
所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)粪便的前处理：分别称取两管0.3g新鲜的狗粪便于2ml离心管中，加入1ml工作液A振荡1min，3000rpm/min离心10min，转移上清至灭菌的离心管中，10000rpm/min离心10min，弃上清，保留沉淀；
2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450μl工作液B和50μl工作液C，混匀后，37℃水浴1h，加入65μl工作液D和65μl工作液E，混匀后，37℃水浴2h；加入100μl Buffer F和50μl Buffer G溶液，混匀后，65℃水浴20min；
3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600μl工作液H，振荡器震荡60s后，13000rpm/min离心10min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液I，13000rpm/min离心10min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡20s后，室温下放置5min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入1ml Buffer K,打匀后室温静置5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50μl Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
实施例5
本发明的提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，其提取方法包括以下步骤：
1)粪便的前处理：称取0.5g新鲜粪便于2ml离心管中，加入2ml工作液A振荡1-2min，5000rpm/min离心20min，转移上清至灭菌的离心管中，12000rpm/min离心20min，弃上清，保留沉淀；
2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入600μl工作液B和60μl工作液C，混匀后，40℃水浴2h，加入70μl工作液D和70μl工作液E，混匀后，60℃水浴1h；加入200μl Buffer F和100μl Buffer G溶液，混匀后，80℃水浴10min；
3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入800μl工作液H，振荡器震荡30s后，12000rpm/min离心20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液I，12000rpm/min离心20min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10s后，室温下放置10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入2ml Buffer K,打匀后室温静置10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入100μl Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
利用实施例1的试剂盒，按照实施例4的提取方法提取的动物粪便微生物基因组DNA于1％琼脂糖凝胶中的电泳检测结果见图1，其中泳道1，2均是利用本发明试剂盒提取到的动物粪便微生物基因组,泳道3为TAKARA公司的DL4500marker。从图中可以看出本方法可以较为快速地提取到动物粪便微生物基因组DNA。
提取到的动物粪便微生物DNA，其纯度用OD260nm/OD280nm比值来衡量，纯度见表1。
表1 动物粪便微生物DNA的纯度
从表1可以看出，DNA的OD(260:280)范围在1.79-1.80。从中可看出，利用本发明试剂盒可以快速地提取到纯度高的动物粪便微生物基因组DNA。
Claims (2)
1.CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由以下工作液组成：
工作液 A：由终浓度0.25-0.37 mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2 mol/L氢氧化钠组成，pH=7-8；
工作液 B：由终浓度10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷和终浓度1-10mmol/L乙二胺四乙酸组成，pH=5.0-8.0；
工作液 C：10-50mg/ml溶菌酶；
工作液 D：20-50mg/ml蛋白酶K；
工作液 E：质量浓度10-20%的十二烷基硫酸钠；
工作液 F：3-8mol/L氯化钠；
工作液 G：由终浓度0.14-0.28mol/L十六烷基三甲基溴化铵和终浓度0.5-1mol/ L氯化钠组成；
工作液 H：体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的混合液；
工作液 I：体积比为氯仿:异戊醇=24:1的混合液；
工作液 J：体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
工作液 K：由终浓度4.3-21.4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷, 终浓度2.1-4.2 mmol/L乙二胺四乙酸,终浓度42.9-85.7 mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成；
工作液 L：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=8.0-9.0。
2.如权利要求1所述试剂盒的提取方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）粪便的前处理：称取粪便于离心管中，每0.3-0.5g粪便中加入1-2ml 工作液 A振荡1-2min，3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；
2）粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600μl 工作液 B和50-60μl 工作液 C，混匀后，37-40°C水浴1-2h，加入65-70μl 工作液 D和65-70μl 工作液 E，混匀后，37-60°C水浴1-2h；加入100-200μl Buffer F和50-100μl Buffer G溶液，混匀后，65-80°C水浴10-20min；
3）DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800μl 工作液 H，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min 离心10-20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min 离心10-20min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
4）磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的 Buffer J，震荡10-20s后，室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入1-2ml Buffer K,打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100μl Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA。
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