CN105002161A

CN105002161A - 基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法

Info

Publication number: CN105002161A
Application number: CN201510449284.7A
Authority: CN
Inventors: 王清水; 余彦
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明提供一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，该方法通过溶菌酶破碎微生物细胞，利用酚氯仿异戊醇溶液抽除杂质，采用硅基磁珠特异性吸附动物粪便微生物基因组DNA，与常规的动物粪便微生物基因组提取方法相比，该方法不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到动物粪便微生物基因组。

Description

基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法

技术领域

本发明涉及一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，属于生物技术领域。

技术背景

微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。因此，微生物通常包括病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病毒)、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、原生动物和单细胞藻类。

环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化。

动物肠道定植着一群十分复杂而又相对稳定的微生物，这些微生物形成一个极其复杂的微生态系统，对动物健康有着非常重要的影响。肠道微生态的变化对机体具有重要的意义与影响，肠道微生态尤其是优势菌群的研究正越来越受到人们的重视，成为当前研究的热点，目前，通过宏基因学进行粪便中微生物基因组的研究是研究肠道微生物多样性的一种重要方法。然而利用基因组学研究粪便中微生物多样性首先要能提取到粪便中的微生物基因组DNA，因此，研究一种快速提取动物粪便微生物基因组DNA的方法显得特别重要。

发明内容：

本发明提供一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，该方法通过溶菌酶破碎微生物细胞，利用酚氯仿异戊醇溶液抽除杂质，采用硅基磁珠特异性吸附动物粪便微生物基因组DNA，利用该方法可以方便、快捷地提取到动物粪便微生物基因组。

一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，包括粪便的前处理、粪便中微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法回收微生物基因组，具体步骤如下：粪便的前处理：称取0.3-0.5g新鲜粪便于2ml离心管中，加入1-2ml Buffer A振荡1-2min，3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至新的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min。弃上清，保留沉淀。

粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450-600μl Buffer B和50-60μl Buffer C，混匀后37-40℃水浴1-2h，加入65-70μl Buffer D和65-70μl Buffer E，混匀后37-60℃水浴1-2h。

DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600-800μl Buffer F，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer G，12000-13000rpm/min离心10-20min，将上清移至新的离心管中。

磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的Buffer H。震荡10-20s。室温放置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入1-2ml Buffer I,打匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50-100μl Buffer J，经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体。此溶液即为粪便微生物基因组DNA。于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。

下表为本实施例基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组DNA的结果。

	泳道1	泳道2
			OD(260:280)	1.79	1.78

试剂的配方如下：

磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000Buffer A：0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾，0.175-0.2mol/L氢氧化钠，PH＝7-8。

Buffer B：10-20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1-10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PH＝5.0-8.0。

Buffer C：溶菌酶(10-50mg/ml)。

Buffer D:蛋白酶K(20-50mg/ml)。

Buffer E:10-20％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS)。

Buffer F:酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1。

Buffer G:氯仿:异戊醇的体积比为24:1。

Buffer H：异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

Buffer I：4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),42.9-85.7mmol/L Nacl，60-80％无水乙醇。

Buffer J：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝8.0-9.0。

本发明的显著优点：

附图说明：

图1为利用本方法提取的动物粪便微生物基因组的电泳检测图。

具体实施例

图1中，泳道1，2是利用本发明方法提取到的动物粪便微生物基因组，泳道3为TAKARA公司的DL4500Marker。

一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组，具体步骤如下：

(1)粪便的前处理：分别称取两管0.3g新鲜粪便于2ml离心管中，加入1ml Buffer A振荡1min，3000rpm/min离心10min，转移上清至新的离心管中，10000rpm/min离心10min。弃上清，保留沉淀。

(2)粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450μl Buffer B和50μl Buffer C，混匀后37℃水浴1h，加入65μl Buffer D和65μl Buffer E，混匀后37℃水浴2h。

(3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600μl Buffer F，振荡器震荡60s后，13000rpm/min离心10min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer G，13000rpm/min离心10min，将上清移至新的离心管中。

(4)磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的Buffer H。震荡10s。室温放置5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入1mlBuffer I,打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50μl Buffer J，经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为动物粪便微生物基因组。于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。

试剂的配方如下：

磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000。

Buffer A：0.25mol/L磷酸二氢钾，0.175mol/L氢氧化钠，PH＝7.2。

Buffer B：10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PH＝8.0。

Buffer C：20mg/ml溶菌酶溶液。

Buffer D:20mg/ml蛋白酶K溶液。

Buffer E:10％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS)。

Buffer F:酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1。

Buffer G:氯仿:异戊醇的体积比为24:1。

Buffer H:异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

Buffer I:28.6mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),3.4mmol/L乙二胺四乙酸。(EDTA),60mmol/L Nacl,70％无水乙醇。

Buffer J:8mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝8.0。

利用本方法提取的动物粪便微生物基因组的电泳检测图见图1，其中泳道1，2是利用本方法提取到的动物粪便微生物基因组，泳道3为TAKARA公司的DL4500Marker。从图1中可看出，本方法可以快速地提取到动物粪便微生物基因组。表1为动物粪便微生物基因组的纯度结果，从表1可看出本试剂盒提取到的动物粪便微生物基因组的OD(260：280)值在1.78-1.79之间，因此可见本试剂盒可以提取到纯度高的动物粪便微生物基因组。

Claims

1.一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，包括粪便的前处理、粪便中微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法回收微生物基因组，其特征是：

粪便的前处理：称取0.3-0.5g新鲜粪便于2ml离心管中，加入1-2ml Buffer A振荡1-2min， 3000-5000rpm/min离心10-20min，转移上清至新的离心管中，10000-12000rpm/min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；

粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450-600μl Buffer B和50-60μl Buffer C，混匀后37-40℃水浴1-2h，加入65-70μl Buffer D和65-70μl Buffer E，混匀后37-60°C水浴1-2h；

DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600-800μl Buffer F，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min 离心10-20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的Buffer G，12000-13000rpm/min 离心10-20min，将上清移至新的离心管中；

磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的 Buffer H，震荡10-20s，室温放置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入1-2ml Buffer I,打匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入50-100μl Buffer J，经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便微生物基因组DNA，最终于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，其特征

所述的磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。

3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，其特征是所述的Buffer A：0.25-0.37 mol/L磷酸二氢钾，0.175-0.2 mol/L氢氧化钠，PH=7-8；所述的Buffer B：10-20mM三羟甲基氨基甲烷，1-10mM乙二胺四乙酸，PH=5.0-8.0；所述的Buffer C为10-50mg/ml的溶菌酶；所述的Buffer D:为20-50mg/ml的蛋白酶K；所述的Buffer E:质量体积比为10-20%的十二烷基硫酸钠；所述的Buffer F为酚:氯仿:异戊醇的体积比25:24:1；所述的Buffer G: 氯仿:异戊醇的体积比为24:1；所述的Buffer H：异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置；所述的Buffer I：4.3-21.4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷, 2.1-4.2 mmol/L乙二胺四乙酸,42.9-85.7 mmol/L Nacl，60-80%无水乙醇；所述的Buffer J：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH=8.0-9.0。