CN103725670A - 从生物样本提取核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了从生物样本提取核酸的方法。从生物样本提取核酸的方法包括：裂解所述生物样本，以便得到含有核酸的裂解产物；以及从所述裂解产物中分离所述核酸，其中，裂解所述生物样本进一步包括：利用含有溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的混合物，对所述生物样本进行消化；将消化产物离心，收集沉淀；以及利用裂解液，对所述沉淀进行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解产物。利用该方法可以有效地从生物样本中提取核酸。

Description

从生物样本提取核酸的方法

技术领域

本发明涉及环境微生物学，具体地，本发明涉及收集流体中微生物和提取核酸的方法。 

背景技术

空气是人类赖以生存的环境，也是微生物扩散与传播疾病的介质，空气中微生物主要包括细菌、真菌、病毒和放线菌等多种微生物，这是空气污染的主要组成部分，这些微生物的产生与人类活动有密切的关系。空气中微生物主要来源于自然界的水体、土壤、动植物和人类，农业活动、动物饲养、工业生产、污水处理、发酵过程和食品生产厂等，空气中微生物的多少是空气质量的重要标准之一。要了解空气中的微生物就必须将微生物富集，以便观察和分析，这就需要特殊设计的空气微生物采样器。 

空气微生物采样方法主要分为自然沉降法和机器采样法。自然沉降法是利用空气微生物粒子的重力作用，在一定的时间内，让所处区域的空气中微生物颗粒逐步沉降到带有培养介质的平皿内的一种采样方法。由于此方法是被动取样，采样条件难以控制，微生物粒子的漂移、扩散和沉降会受到风力、电力、磁力、热力、浮力和扩散力等各种力的干扰，因此这种采样方法会造成很大的误差。机器采样法是用采样器来采样，根据采样原理，采样器可分为沉降式、撞击式、离心撞击式、过滤式、静电式、气旋式等。此外，还有温差迫降类和生物类。各种采样器的研制和使用大大推动了空气微生物学的发展，但仍无一种采样器是十全十美的。 

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提供一种从生物样本中提取核酸的方法。 

本发明提供了一种从生物样本中提取核酸的方法。该提取方法包括：裂解所述生物样本，以便得到含有核酸的裂解产物；以及从所述裂解产物中分离所述核酸，其中，裂解所述生物样本进一步包括：利用含有溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的混合物，对所述生物样本进行消化；将消化产物离心，收集沉淀；以及利用裂解液，对所述沉淀进行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解产物。根据本发明实施例的从生物样本提取核酸的方法，可以有效地从生物样本中提取核酸，对微生物破壁的效果明显，可以同时提取DNA和RNA，特别是RNA的完整性和纯度都非常高，同时这种方法也适用于各种环境样品例如空气中微生物的核酸的提取。 

根据本发明实施例的从生物样本提取核酸的方法可用于收集各种不同开放环境的空气样本，不仅覆盖面广而且操作简便。另外，本发明中提供的提取空气样本核酸的方法非常有效。 

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 

图1显示了根据本发明实施例的收集流体中微生物的设备结构示意图，其中A、B和C分别显示了根据本发明实施例的收集流体中微生物的设备结构示意图； 

图2显示了根据本发明实施例的收集流体中微生物的设备的过滤收集组件的立体分解示意图； 

图3显示了根据本发明实施例的从空气样本中提取RNA后用2100芯片检测的结果图； 

图4显示了根据本发明实施例的空气样本核酸（DNA和RNA）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图； 

图5显示了根据本发明实施例的只采用溶菌酶提取空气样本1RNA提取后用2100芯片检测的结果图； 

图6显示了根据本发明实施例的只采用溶菌酶空气样本1核酸（DNA和RNA）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图； 

图7显示了根据本发明另一实施例的采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测从胃瘤样本中提取的核酸片段大小，Nanodrop仪器检测DNA浓度及纯度；以及 

图8显示了根据本发明又一实施例的采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测从牙菌斑样本中提取的核酸片段大小，Nanodrop仪器检测DNA浓度及纯度。 

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 

本发明提供了一种从生物样本中提取核酸的方法。根据本发明的实施例，该提取核酸的方法包括以下步骤：裂解所述生物样本，以便得到含有核酸的裂解产物；以及从所述裂解产物中分离所述核酸。根据本发明的实施例，裂解所述生物样本进一步包括：利用含有溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的混合物，对所述生物样本进行消化；将消化产物离心，收集沉淀；以及利用裂解液，对所述沉淀进行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解产物。根据本发明的一个示例，优选地，所述溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的比例为1：1：1。发明人惊奇地发现，通过采用溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的组合，能够有效地对生物样本进行消化，从而能够以显著高于现有技术的效率，从生物样本尤其是从空气中所收集的微生物中提取核酸。为此，根据本发明实施例的从生物样本提取核酸的方法，可以有效地从生物样本中提取核酸，尤其是对微生物破壁的效果明显，可以同时提取DNA和RNA，特别是RNA的完整性和纯度都非常高，同时这种方法也适用于各种环境样品例如空气中微生物的核酸的提取。 

根据本发明的实施例，可以用于本发明的裂解液的类型并不受特别限制根据本发明的一些实施例，所述裂解液可以含有200mmol/L NaCl,100mmol/LTris-HCl,pH 8.0,2.0%SDS,50mmol/L EDTA,0.5%Triton X-100。根据本发明的一个实例，所述裂解液中可以进一步含有蛋白酶K。根据本发明的一些实施例，所述裂解是在50-55摄氏度下进行的。由此，可以进一步提高裂解生物样品尤其是从微生物样品的效率，从而进一步提高从生物样品提取核酸的效率。 

根据本发明的实施例，从该裂解产物中分离核酸进一步包括：对所述裂解产物进行离心，收集第一上清液；将含有酚、氯仿和异戊醇的混合物与所述第一上清液按照等体积混合，进行离心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、 氯仿和异戊醇的混合物中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；将含有氯仿和异戊醇的混合物与所述第二上清液按照等体积混合，进行离心后，收集第三上清液；以及将含有异丙醇和醋酸钠的混合物与所述第三上清液按照0.7：1的体积比混合，进行离心后，收集核酸沉淀。由此，可以进一步显著地提高所得到核酸样品的纯度。 

根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法提取核酸的样品来源并不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所采用的生物样本是从流体收集的微生物样本。根据本发明的实施例，可以通过下列方法从流体收集微生物样本： 

在压力差的作用下，使含有微生物的流体通过滤膜，其中，所述滤膜进样侧的压力高于所述滤膜出样侧的压力，所述滤膜的孔径使得所述微生物被截留在所述滤膜上。由此，可以有效地从流体中收集微生物样本，从而进一步提高从生物样品提取核酸的效率。根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法进行处理的微生物样本类型并不受特别限制，根据本发明的一些实例，所述微生物可以为选自细菌、真菌、病毒和放线菌的至少之一。 

根据本发明的实施例，可以采用的流体类型并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，可以采用的流体为气体，例如可以为空气。由此，利用根据本发明的实施例，可以有效地从气体例如空气中收集微生物样品。 

根据本发明的实施例，压力差是通过所述出样侧形成空气的定向流动形成的，其最佳压力范围是高于1000Pa，并且不超过3000Pa。发明人发现，当压力差不超过1000Pa时，流体尤其是空气将难以有效地通过滤膜，从流体尤其是空气中收集生物样本尤其是微生物的效率将显著降低，而当压力超过3000Pa时，生物样本尤其是微生物样本将难以停留在滤膜上，从而收集生物样本尤其是微生物的效率也将显著降低。 

根据本发明的一个示例，所述滤膜的孔径大小并不受特别限制，可以为0.1～10微米。根据本发明的实例，所述滤膜的种类也不受特别限制，可以为选自尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纤维膜的至少之一。根据本发明的实施例，优选醋酸纤维膜，因为醋酸纤维膜具有很高的流速和热稳定性以及非常低的吸附，非常适合除菌过滤。根据本发明的实施例，所述醋酸纤维膜的孔径可以为0.22微米。 

为了方便理解，下面对可以用于实施从流体尤其是空气收集生物样本尤其是微生物的设备进行描述。 

在本发明的第二方面，本发明还提出了一种用于从流体尤其是空气中收集微生物的设备。根据本发明的实施例，参考图1A～C，该设备1000发明的实施例，收集流体中微生物的设备1000包括：本体100、过滤收集组件200以及负压发生组件300。 

根据本发明的实施例，本体100内限定有负压腔110，负压发生装置300设置在负压腔110内，用于在负压腔110内形成负压，过滤收集组件200设置在负压腔110的至少一侧，以便使得流体可以通过过滤收集组件200进入负压腔110。 

根据本发明实施例的用于收集流体中微生物的设备采用了非自然沉降的富集方式，可以克服被动取样，防止微生物的漂移、扩散和受到风力、电力、磁力、热力、浮力和扩散力等各种里的干扰。尤其是，通过采用主动式的直接吸入过滤收集方法，可实现对全部微生物，包括细菌、真菌、病毒等在内的一次性同步收集，这克服了现有技术的培养基采样方法的缺陷，从而有效地收集流体中微生物样本。在现有的培养基采样方法，由于营养条件及培养方式差异，会造成空气微生物收集的局限性。 

需要说明的是，虽然在附图中所给出的设备是立式的，但本领域技术人员可以理解的是，也可以采用其他形式，例如卧式。 

根据本发明的实施例，负压发生组件300的类型并不受特别限制，例如可以为抽真空装置。另外，参考图1B和C，负压发生组件300进一步包括叶片320；驱动装置310，所述驱动装置320与所述叶片310通过连接杆330相连，用于驱动所述叶片转动。从而通过叶片310的转动，驱动负压腔110内空气的流动，可以在负压腔内形成局部负压，从而驱动流体通过过滤收集组件200进入负压腔110。根据本发明的示例，在与所述过滤收集组件相对的侧壁上形成有通孔120。由此，可以在叶片310的转动过程中，将负压腔110中的气体排出负压腔110，从而可以在负压腔110中形成持续稳定的负压，从而有效地提高了收集生物样本尤其是微生物样本的效率。 

根据本发明的一些实例，所述叶片310与过滤收集组件200相对设置，并且过滤收集组件可拆卸地与所述壳体相连。由此，可以进一步有效地通过叶片旋转带动空气流动，并从通孔120将空气排出，从而在负压腔110种形成负压，简单方便地形成负压。 

根据本发明的实施例，收集流体中微生物的设备1000进一步包括：限位部件400，所述限位部件400设置在所述本体110上，用于对所述过滤收集组件200进行限位。根据本发明的一些实例，限位部件400可移动地设置在所述本体110上。由此，可以对过滤收集组件200的位置进行限定。 

参考图2根据本发明的示例，过滤收集组件200包括：滤膜22；膜前收集网格槽21；和膜后网式衬垫23，其中，所述滤膜22设置在所述膜前收集网格槽21和所述膜后网式衬垫23之间。根据本发明的实施例，滤膜22的孔径大小并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以为0.1～10微米。所述滤膜的 种类也不受特别限制，根据本发明的实施例，可以为选自尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纤维膜的至少之一。根据本发明的一个实例，所述滤膜优选为醋酸纤维膜。 

根据本发明的实施例，过滤收集组件200进一步包括：密封框架24，所述密封框架24设置于膜前收集网格槽21和膜后网式衬垫23之间，用于对收集网格槽24与膜后网式衬垫22进行密封。根据本发明的实施例，该密封框架24的材质并不受特别限制，根据本发明的示例，所述框架可以为橡胶框架。由此，可保证膜前收集网格槽24与膜后网式衬垫22的密封连接。 

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。 

实施例1 

1、样本收集前准备 

根据图1C和图2所示结构，取一块新的醋酸纤维素膜，将过滤收集组件与壳体连接，准备好收集装备。 

2、样本收集 

将空气富集装置开关打开，在1000Pa<H≤3000Pa压力下，分别在两个酿酒厂的车间内连续开机抽气3天，抽气结束后，取出网格槽内滤膜，在超净 台内，撕下滤膜收集菌体，收集得空气样本1和空气样本2。 

3、空气样本核酸提取 

将收集到的菌体与撕下来的表层滤膜一起置于50mL离心管中，向其中加入20mL TE、200μL 10mg/mL溶菌酶、200μL 10mg/mL蜗牛酶和200μL 10mg/mL溶壁酶，吹吸混匀，37℃温育过夜，消化同时用混匀仪混匀(过夜消化)；将所得消化液在4℃9000r/min下离心10min，弃去上清液；向沉淀中加入6mL TENS裂解液(200mmol/L NaCl,100mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,2.0%SDS,50mmol/L EDTA,0.5%Triton X-100)和20mg/mL蛋白酶K 300μL，颠倒混匀，55℃温浴1h，每隔15min颠倒混匀一次；将裂解后样品在4℃10000r/min条件下离心10min，留取上清液，弃去沉淀；向所得上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀，然后在4℃12000r/min下离心10min；转移所得上清液至新管，向其中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，在4℃12000r/min下离心10min；将所得上清液转入1.5mL离心管中，向其中加入0.7倍体积异丙醇和100μL 5M醋酸钠，沉淀2h后，在4℃13000rpm条件下离心30min；弃去所得上清液，用冰预冷的75%乙醇漂洗沉淀二次，在4℃13000rpm条件下离心5min；弃去上清液，风干，沉淀用30μL无菌水溶解，若只提取RNA，可加入1μL无RNA酶的DNA酶I来溶解沉淀；然后采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，Nanodrop仪器和2100芯片分别检测所提取核酸的DNA和RNA浓度及纯度。 

4、空气样本提取结果 

图3显示了从空气样本中提取RNA后用2100芯片检测的结果图；图4显示了空气样本核酸（DNA和RNA）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图。 

图3示出了： 

另外，重复上述从空气中提取微生物核酸的方法，只是在提取核酸样本时，仅采用溶菌酶。图5显示了只采用溶菌酶提取空气样本1RNA提取后用2100芯片检测的结果图；图6为只采用溶菌酶空气样本1核酸(DNA和RNA）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图。 

图5示出了： 

由图3～图6的结果可知，利用本发明的装置和方法，能够有效地从空气中富集微生物，同时还可以有效地从所富集的微生物提取核酸样本。另外，仅采用溶菌酶破碎微生物样本的效果不如三种酶（溶菌酶+蜗牛酶+破壁酶）一起作用破碎的效果好，蜗牛酶和溶壁酶对真菌和革兰氏阳性菌破壁的效果要好，而且三种酶一起作用，能相互加强酶的作用，体现出协同作用效果，使酶发挥最佳效果。 

实施例2 

将收集到的牛瘤胃样本0.5g置于2mL离心管中加入500mL TE和20μL 10mg/mL溶菌酶和20μL10mg/mL蜗牛酶、20μL 10mg/mL溶壁酶，吹吸混匀，37℃温育过夜，消化同时用混匀仪混匀(过夜消化)；将所得的消化液在4℃9000r/min条件下离心10min，去除上清液，留取沉淀；向沉淀中加入400μLTENS裂解液(200mmol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，2.0%SDS，50mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100)和20mg/mL蛋白酶K 300μL，颠倒混匀，55℃温浴1h，每隔15min颠倒混匀一次；将裂解后的样品在4℃10000r/min条件下离心10min，留取上清，弃去沉淀；向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀，并在4℃12000r/min条件下离心10min；转移所得上清液至新管，向其中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，在4℃12000r/min下离心10min；将所得上清液转入1.5mL离心管中，向其中加入0.7倍体积异丙醇和10μL5M醋酸钠，沉淀2h后，在4℃13000rpm条件下离心30min；弃去所得上清液，用冰预冷的75%乙醇漂洗沉淀二次，在4℃13000rpm条件下离心5min；弃去上清液，风干，沉淀用30μL无菌水溶解，溶解过程中加入1μL RNaseA；然后采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，Nanodrop仪器检测DNA浓度及纯度，结果见图7。 

实施例3 

采用牙菌斑样本，重复实施例2提取DNA，所得实验结果见图8。 

如图7和图8所示，利用本发明的方法，能够有效地从微生物提取核酸样本。 

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。 

Claims (9)

1.一种从生物样本提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

裂解所述生物样本，以便得到含有核酸的裂解产物；以及

从所述裂解产物中分离所述核酸，

其中，裂解所述生物样本进一步包括：

利用含有溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的混合物，对所述生物样本进行消化；

将消化产物离心，收集沉淀；以及

利用裂解液，对所述沉淀进行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶、蜗牛酶和溶壁酶的质量比为1：1：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有200mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2.0%SDS，50mmol/L EDTA，0.5%TritonX-100，

任选地，所述裂解液中进一步含有蛋白酶K，

任选地，所述裂解是在50～55摄氏度下进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述裂解产物中分离核酸进一步包括：

对所述裂解产物进行离心，收集第一上清液；

将含有酚、氯仿和异戊醇的混合物与所述第一上清液按照等体积混合，进行离心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、氯仿和异戊醇的混合物中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；

将含有氯仿和异戊醇的混合物与所述第二上清液按照等体积混合，进行离心后，收集第三上清液；以及

将含有异丙醇和醋酸钠的混合物与所述第三上清液按照0.7：1的体积比混合，进行离心后，收集核酸沉淀。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本是通过下列步骤从流体中收集的微生物样本：

在压力差的作用下，使含有微生物的流体通过滤膜，

其中，

所述滤膜进样侧的压力高于所述滤膜出样侧的压力，

所述滤膜的孔径使得所述微生物被截留在所述滤膜上，

任选地，所述流体为气体，

任选地，所述气体为空气，

任选地，所述压力差是通过所述出样侧空气的定向流动形成的，优选，所述压力差为1000Pa<H≤3000Pa，

任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、病毒和放线菌的至少之一。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.1～10微米。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述滤膜为选自尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纤维膜的至少之一。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述滤膜为醋酸纤维膜。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述醋酸纤维膜的孔径为0.22微米。

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