CN104630204A - 一种油藏微生物基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种油藏微生物基因组DNA提取方法，具体包括以下步骤：有机溶剂萃取去除样品中原油对提取的干扰，并释放油水界面的微生物，以中空纤维膜过滤过滤水相富集微生物，以物理破壁方法结合溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠等裂解细胞，在高盐条件下通过苯酚、氯仿去除蛋白质等有机大分子组份，随后通过核酸抽提及沉淀，获得油藏微生物基因组DNA。本发明所述方法快捷简单，整个提取过程可在10小时之内完成；提取效率高，所获基因组纯度高。
Description
一、技术领域
本发明涉及微生物采油技术领域，具体的说是一种油藏微生物基因组DNA的提取方法。
二、背景技术
微生物采油通过油藏中微生物的活动及其代谢产物的综合作用实现石油采收率的提高，与其它驱油方法相比，具有多方面的突出优势。第一，适用范围广，胜利油田有10亿吨的储量适合实施微生物采油。第二，成本低，施工简便。第三，不伤害储层，没有产出液后处理问题，符合可持续发展的要求。
油藏中生长代谢的微生物是微生物采油技术的物质基础和主要研究对象，因此深入、系统地调查和分析油藏中微生物群落，确定功能微生物并了解影响功能微生物的生态因素是微生物采油技术开发和应用的关键问题。由于目前技术手段的局限，只有大约1%的微生物可被人工培养及认识，为此科研工作者开发了不依赖于培养的各种分子生物学分析技术，其首要前提在于获得自然界真实无偏好的微生物基因组信息，但由于油藏环境的特殊性及复杂性，其操作存在一些问题，其中最主要的问题包括油藏样品样品中微生物浓度过低，要收集到足够量的菌体，就要处理大量的样品，收集菌体；油藏样品含有原油污染，吸附菌体，对后面的提取操作产生影响，降低DNA的产量和纯度。
油藏中现有的菌体收集方法，主要包括过滤收集菌体和离心收集菌体两种，过滤采用平板膜过滤，存在过滤通量小，需要大量膜片，后续处理膜工作量大的问题。
三、发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种油藏微生物基因组DNA提取方法。该方法快捷简单，整个提取过程可在10小时之内完成；提取效率高，所获基因组纯度高。
本发明解决的技术问题方案是提供一种油藏微生物基因组DNA提取方法，其具体步骤如下：
（1）有机溶剂萃取除去原油，释放油水界面微生物
在液相样品中加入石油醚，其与液相样品的体积比为1：4～6，充分震荡混合均匀后静置1h～2h，使有机相和水相分层，取下层水相。
（2）收集菌体
将步骤（1）中所得的水相，利用蠕动泵，控制压力为0.5MPa，在0.22μm的中空纤维素膜过滤器进行过滤，收集菌体。
（3）裂解微生物细胞
首先，将步骤（2）中的过滤器的中空纤维素膜，剪碎与石英砂相混合，放入含有800μl～1000μl提取缓冲液的离心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混匀，55℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，最后，4℃12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管。
（4）DNA提纯
首先，按照体积比为25:24:1的比例加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，其次，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，按照体积比为24:1的比例加入氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，接着，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入醋酸钠后的终体积2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心10min，弃上清，在次，加入600μl预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，最后，重复洗涤一次，吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30μl无菌水和0.5μl10mg/mL的RNase A，吹吸混匀，取3μl电泳检测，剩余置于-20℃保存。
所述的提取缓冲液为：Tris-Cl100mM（pH8.0），EDTA50mM，NaCl200mM，SDS2.0%（w/v），Triton X-1000.5%（v/v）。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、提取产物纯度高，本发明通过涡旋混合器振荡进行细胞破碎，得到高纯度基因组DNA可直接用于PCR的扩增。
2、提取成本低，本发明在提取油藏微生物基因组DNA的过程中，不需使用商品化的纯化试剂盒进行纯化，因而降低了成本。
3、提取的更加全面，本发明在提取油藏微生物基因组DNA的过程中，使用中空纤维素膜过滤技术，提高了样品处理量，增加了提取到含量低微生物DNA的可能，提取的DNA更全面。
四、说明书附图
附图1不同样品基因组提取情况汇总，1～3号为油井产出液，4号为注入水。
五、具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细描述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的要求保护的范围。
实施例1
（1）有机溶剂萃取除去原油，释放油水界面微生物
取三个油井产出液各3L，一个注入水样品3L，分别在样品液相中加入500ml石油醚，充分震荡混合均匀后静置1h，使有机相和水相分层，取下层水相。
（2）收集菌体
将所得水相，利用蠕动泵，控制压力为0.5MPa，在0.22μm的中空纤维素膜过滤器进行过滤，收集菌体。
（3）裂解微生物细胞
首先，将过滤器的中空纤维素膜，剪碎与石英砂相混合，放入含有800μl提取缓冲液的离心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混匀，55℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，最后，4℃12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管。
（4）DNA提纯
首先，按照体积比为25:24:1的比例加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，其次，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，按照体积比为24:1的比例加入氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，接着，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入醋酸钠后的终体积2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心10min，弃上清，在次，加入600μl预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，最后，重复洗涤一次，吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30μl无菌水和0.5μl10mg/mL的RNase A，吹吸混匀，取3μl电泳检测，剩余置于-20℃保存。
图1为不同样品基因组提取情况汇总，1～3号为油井产出液，4号为注入水。
实施例2
（1）有机溶剂萃取除去原油，释放油水界面微生物
取三个油井产出液各3L，一个注入水样品3L，分别在样品液相中加入600ml石油醚，充分震荡混合均匀后静置2h，使有机相和水相分层，取下层水相。
（2）收集菌体
将所得水相，利用蠕动泵，控制压力为0.5MPa，在0.22μm的中空纤维素膜过滤器进行过滤，收集菌体。
（3）裂解微生物细胞
首先，将过滤器的中空纤维素膜，剪碎与石英砂相混合，放入含有1000μl提取缓冲液的离心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混匀，55℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，最后，4℃12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管。
（4）DNA提纯
首先，按照体积比为25:24:1的比例加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，其次，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，按照体积比为24:1的比例加入氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，接着，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入醋酸钠后的终体积2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心10min，弃上清，在次，加入600μl预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，最后，重复洗涤一次，吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30μl无菌水和0.5μl10mg/mL的RNase A，吹吸混匀，取3μl电泳检测，剩余置于-20℃保存。
Claims (2)
1.一种油藏微生物基因组DNA提取方法，其特征在于以下包括步骤：
（1）有机溶剂萃取除去原油，释放油水界面微生物
在液相样品中加入石油醚，其与液相样品的体积比为1：4～6，充分震荡混合均匀后静置1h～2h，使有机相和水相分层，取下层水相。
（2）收集菌体
将上述所得的水相，利用蠕动泵，控制压力为0.5MPa，在0.22μm的中空纤维素膜过滤器进行过滤，收集菌体。
（3）裂解微生物细胞
首先，将上述过滤器的中空纤维素膜，剪碎与石英砂相混合，放入含有800μl～1000μl提取缓冲液的离心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混匀，55℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，最后，4℃12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管。
（4）DNA提纯
首先，按照体积比为25:24:1的比例加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，其次，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，按照体积比为24:1的比例加入氯仿和异戊醇，充分混匀，-20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，接着，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入醋酸钠后的终体积2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心10min，弃上清，在次，加入600μl预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，最后，重复洗涤一次，吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30μl无菌水和0.5μl10mg/mL的RNase A，吹吸混匀，取3μl电泳检测，剩余置于-20℃保存。
2.按权利要求l所述的油藏微生物基因组DNA提取方法，其特征在于所述的提取缓冲液为：Tris-Cl100mM（pH8.0），EDTA50mM，NaCl200mM，SDS2.0%（w/v），Triton X-1000.5%（v/v）。
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