CN110511262A - 一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法。提取液由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0～8.2磷酸盐缓冲液组成；两者体积比1:2～2:1，聚苯基甲基硅氧烷密度1010‑1120kg/m3。提取液震荡时宏观上形成乳浊液，微观上分散为聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液微粒。聚苯基甲基硅氧烷微粒结合油泥砂，使石油进入聚苯基甲基硅氧烷微粒中，疏水性降低。磷酸盐缓冲液微粒结合疏水性降低的油泥砂，使其中的宏蛋白质组进入水相提取液。经离心、过滤、沉淀、洗涤和干燥，获得提纯的宏蛋白质组。本发明有助于对油泥砂中微生物宏基因组翻译产生的宏蛋白质组进行分析，从而获得油藏微生物代谢信息，为微生物采油提供数据基础。

Description

一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法
技术领域
本发明属于采油技术领域，涉及一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法。
背景技术
利用地层深处油藏微生物的代谢活动来提高石油采收率的微生物采油技术可以大幅提高石油资源的利用率，因此充分认识油藏中的微生物对微生物采油技术的现场实施具有重要意义。由于对地层深处原位采样分析实施较为困难，因此对采油过程产生的来源于地层深处油藏的油泥砂进行取样，进一步对其中携带的微生物进行分析成为较好的选择。目前一般采用宏基因组DNA分析技术对微生物进行分析，然而宏基因组DNA分析技术仅是对微生物遗传信息层面的分析，无法获得其代谢层面的信息，难以反映地层深处油藏微生物的代谢活动情况。而宏蛋白质组分析技术是针对基因组翻译后产生的蛋白质进行分析，可以获得丰富的代谢层面信息，有助于充分认识油藏微生物的代谢活动。
宏蛋白质组提取是分析检测宏蛋白质组的基础，大幅影响宏蛋白质组分析的精确性。现有的提取方法由于使用水基提取液，对亲水性材料中的蛋白质提取效果较好。例如发明专利2015104424587、2016108014158、2015102104160、201910203088X、2017100688388、2009102430747和200910111462X分别提供了“一种自然发酵豆酱中菌体宏蛋白质组的提取方法”、“一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法”、“一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法”、“一种高效的土壤蛋白质提取方法”、“一种土壤蛋白质的提取方法”、“土壤元蛋白质组的制备方法”和“土壤蛋白质提取及胞内蛋白质的分离方法”。上述专利对豆酱、植物和土壤等亲水性材料中的蛋白质提取效果较好，但是由于油泥砂含有大量的石油，导致疏水性较高，因此现有方法无法对油泥砂等疏水性材料中的宏蛋白质组进行提取，阻碍了后续的宏蛋白质组分析检测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，针对源于地层深处油藏的油泥砂中的宏蛋白质组提取问题，提供一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法。
本发明的技术方案如下：
一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液，是由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0～8.2磷酸盐缓冲液组成；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010-1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积比1:2～2:1。
利用本发明的提取液进行油泥砂中宏蛋白质组的提取方法包括如下步骤。
1)：将油泥砂加入聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液组成的提取液中，经超声震荡后摇床震荡使油泥砂和提取液混合均匀，离心去除大颗粒杂质；
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤；
3)：向滤液中加入丙酮，经离心分离出沉淀；
4)：用丙酮洗涤沉淀；
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥，获得提纯的宏蛋白质组。
所述的步骤1)中加入聚苯基甲基硅氧烷优选温度为0～4℃。
所述的步骤1)中超声震荡时间优选为5～30min。
所述的步骤1)中摇床震荡时间优选为8～12h。
所述的步骤1)中离心去除大颗粒杂质的离心速率优选是6000～10000r/min。
所述的步骤3)中丙酮的量优选是1～4倍磷酸盐缓冲液的体积；优选温度为0～4℃。
所述的步骤3)中离心分离沉淀的分离速率优选是8000～16000r/min。
所述的步骤4)中丙酮的量优选是0.01～0.05倍磷酸盐缓冲液的体积；优选温度为0～4℃。
所述的步骤5)中真空干燥机干燥时间优选10～60min；干燥温度优选-80～-10℃。
所述的步骤1)、3)、4)操作的环境温度优选为0～4℃。
采用考马斯亮蓝法测定宏蛋白质组含量，采用SDS-PAGE和液质联用仪检测宏蛋白质组中蛋白质种类。
聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液在震荡时宏观上形成均一的乳浊液，在微观上分散为聚苯基甲基硅氧烷微粒和磷酸盐缓冲液微粒。聚苯基甲基硅氧烷微粒与疏水性较高的油泥砂结合，石油转移到聚苯基甲基硅氧烷微粒中，从而降低了油泥砂的疏水性。磷酸盐缓冲液微粒与降低疏水性后的油泥砂结合，从而提取到其中的宏蛋白质组。由于磷酸盐缓冲液的密度低于聚苯基甲基硅氧烷，乳浊液经高速离心后分层，含有宏蛋白质组的磷酸盐缓冲液浮于聚苯基甲基硅氧烷上层，吸出后经提纯用于宏蛋白质组分析检测。
本发明的优点：(1)提取液由聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液组成，震荡时分散为聚苯基甲基硅氧烷微粒和磷酸盐缓冲液微粒，在降低油泥砂的疏水性的基础上提取宏蛋白质组，因此本专利适用于油泥砂，针对性强。(2)磷酸盐缓冲液的密度低于聚苯基甲基硅氧烷的密度，高速离心后含有宏蛋白质组的磷酸盐缓冲液浮于聚苯基甲基硅氧烷上层，便于后续操作。(3)聚苯基甲基硅氧烷毒性低，对生态环境和人员健康影响较小。本专利有助于对油泥砂中微生物宏基因组翻译后产生的宏蛋白质组进行分析，从而获得丰富的代谢层面信息，便于充分认识油藏中的微生物代谢活动，为微生物采油技术的现场实施提供数据基础。
具体实施方式
以下结合具体实例，对本专利进行详细说明。
实施例1
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将1g油泥砂加入0℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为50ml和100ml(体积比1:2)；经超声震荡5min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入100ml(1倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经8000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
4)：用1ml(0.01倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为1.8ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有26种蛋白质。
实施例2
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为200ml和100ml(体积比2:1)；经超声震荡30min后摇床震荡12h使油泥砂和提取液混合均匀，10000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入400ml(4倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经16000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用5ml(0.05倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥60min，干燥温度-10℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.6ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有51种蛋白质。
实施例3
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将2g油泥砂加入0℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.1磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为160ml和80ml(体积比2:1)；经超声震荡15min后摇床震荡10h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为2℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入160ml(2倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经10000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为3℃。
4)：用1.6ml(0.02倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为3℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥60min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.1ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有44种蛋白质。
实施例4
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.1磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1050kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为150ml和75ml(体积比2:1)；经超声震荡30min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，8000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入75ml(1倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为2℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经16000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
4)：用3ml(0.04倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-40℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.3ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有31种蛋白质。
实施例5
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入1℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1050kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为200ml和100ml(体积比2:1)；经超声震荡5min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为1℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入400ml(4倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经10000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
4)：用5ml(0.05倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥30min，干燥温度-10℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.8ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有53种蛋白质。
实施例6
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将2g油泥砂加入2℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1050kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为120ml和120ml(体积比1:1)；经超声震荡15min后摇床震荡10h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为2℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入120ml(1倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为3℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经16000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
4)：用1.2ml(0.01倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.5ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有33种蛋白质。
实施例7
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将1g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为50ml和70ml(体积比1:1.5)；经超声震荡5min后摇床震荡12h使油泥砂和提取液混合均匀，10000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入210ml(3倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为1℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经10000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用1.4ml(0.02倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为2℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为1℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥60min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.6ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有44种蛋白质。
实施例8
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入3℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为120ml和100ml(体积比1.2:1)；经超声震荡10min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，10000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入250ml(2.5倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经12000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
4)：用5ml(0.05倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为2℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-50℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为3.2ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有54种蛋白质。
实施例9
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将1g油泥砂加入0℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为150ml和150ml(体积比1:1)；经超声震荡30min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，8000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入600ml(4倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为3℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经8000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为2℃。
4)：用1.5ml(0.01倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为2℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥30min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为3.6ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有46种蛋白质。
实施例10
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将1g油泥砂加入3℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.1磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为50ml和50ml(体积比1:1)；经超声震荡10min后摇床震荡12h使油泥砂和提取液混合均匀，8000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入60ml(1.2倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经8000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用1ml(0.02倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-10℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为3.1ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有38种蛋白质。
实施例11
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将2g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1030kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为100ml和150ml(体积比1:1.5)；经超声震荡5min后摇床震荡10h使油泥砂和提取液混合均匀，8000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入150ml(1倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经8000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为2℃。
4)：用7.5ml(0.05倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为2℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥60min，干燥温度-10℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.7ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有47种蛋白质。
实施例12
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为200ml和100ml(体积比2:1)；经超声震荡30min后摇床震荡12h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为1℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入200ml(2倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经10000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为3℃。
4)：用1ml(0.01倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为1℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-40℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.9ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有45种蛋白质。
实施例13
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将3g油泥砂加入2℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为125ml和250ml(体积比1:2)；经超声震荡30min后摇床震荡8h使油泥砂和提取液混合均匀，8000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为4℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入1000ml(4倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经10000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用10ml(0.04倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥60min，干燥温度-40℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.5ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有37种蛋白质。
实施例14
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将2g油泥砂加入0℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1060kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为50ml和100ml(体积比1:2)；经超声震荡5min后摇床震荡12h使油泥砂和提取液混合均匀，10000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入180ml(1.8倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经16000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用4ml(0.04倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为0℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为0℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.5ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有28种蛋白质。
实施例15
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将2g油泥砂加入0℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.1磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为30ml和60ml(体积比1:2)；经超声震荡5min后摇床震荡9h使油泥砂和提取液混合均匀，9000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入60ml(1倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为4℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经12000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为3℃。
4)：用3ml(0.05倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为3℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为3℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥10min，干燥温度-80℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.1ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有33种蛋白质。
实施例16
本发明的一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法，包括以下步骤：
1)：将1g油泥砂加入4℃由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.2磷酸盐缓冲液组成的提取液中；聚苯基甲基硅氧烷密度为1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积分别为40ml和80ml(体积比1:2)；经超声震荡10min后摇床震荡10h使油泥砂和提取液混合均匀，6000r/min高速离心去除大颗粒杂质。本步骤操作的环境温度为0℃。
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤。
3)：向滤液中加入320ml(4倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为1℃的丙酮，使宏蛋白质组沉淀下来，经8000r/min高速离心分离出沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
4)：用0.8ml(0.01倍磷酸盐缓冲液体积)的温度为3℃的丙酮洗涤沉淀。本步骤操作的环境温度为4℃。
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥20min，干燥温度-10℃，获得提纯的宏蛋白质组。
经考马斯亮蓝法测定，油泥砂中宏蛋白质组含量为2.2ug/kg。经SDS-PAGE和液质联用仪检测，油泥砂中宏蛋白质组含有38种蛋白质。
本发明提供一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液及提取方法。提取液由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0～8.2磷酸盐缓冲液组成；聚苯基甲基硅氧烷密度1010-1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积比1:2～2:1。将油泥砂加入提取液，震荡时宏观上形成均一的乳浊液，微观上分散为聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液微粒。聚苯基甲基硅氧烷微粒结合疏水的油泥砂，石油转移到聚苯基甲基硅氧烷微粒中，从而降低油泥砂的疏水性。磷酸盐缓冲液微粒结合疏水性降低的油泥砂，使其中的宏蛋白质组进入水相提取液。经离心、过滤、沉淀、洗涤和干燥，获得提纯的宏蛋白质组。本发明有助于对油泥砂中微生物宏基因组翻译产生的宏蛋白质组进行分析，从而获得油藏微生物的代谢信息，为实施微生物采油提供数据基础。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种提取油泥砂中宏蛋白质组的提取液，其特征是由聚苯基甲基硅氧烷和pH8.0～8.2磷酸盐缓冲液组成；聚苯基甲基硅氧烷密度为1010-1120kg/m3，聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液体积比1:2～2:1。
2.利用权利要求1的提取液进行油泥砂中宏蛋白质组的提取方法，其特征是包括如下步骤：
1)：将油泥砂加入聚苯基甲基硅氧烷和磷酸盐缓冲液组成的提取液中；经超声震荡后摇床震荡使油泥砂和提取液混合均匀，离心去除大颗粒杂质；
2)：吸出上层水相提取液，使用微孔滤膜过滤；
3)：向滤液中加入丙酮，经离心分离出沉淀；
4)：用丙酮洗涤沉淀；
5)：洗涤后的沉淀用真空干燥机干燥，获得提纯的宏蛋白质组。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中加入聚苯基甲基硅氧烷为0～4℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中超声震荡时间为5～30min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中摇床震荡时间为8～12h。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中离心去除大颗粒杂质的离心速率是6000～10000r/min。
7.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤3)中丙酮的量是1～4倍磷酸盐缓冲液的体积；温度为0～4℃。
8.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤4)中丙酮的量是0.01～0.05倍磷酸盐缓冲液的体积；温度为0～4℃。
9.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤5)中真空干燥机干燥时间10～60min；干燥温度为-80～-10℃。
10.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)、3)、4)操作的环境温度为0～4℃。
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