CN104974952A

CN104974952A - 一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法

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Publication number: CN104974952A
Application number: CN201510287619.XA
Authority: CN
Inventors: 段浩
Original assignee: Suzhou Ze Fang New Energy Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ze Fang New Energy Technology Co Ltd
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104974952B

Abstract

本发明涉及一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法，该混合菌由三种菌株混合组成，分别为名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)且保藏编号为CCTCC AB 205091、名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)且保藏编号为CCTCC S2013441和名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)且保藏编号为CCTCC AB 205141的菌株组成，该混合菌是通过待筛选采油菌株的挑选、将挑选好的待筛选采油菌株进行活化及培养、将活化及培养好的待筛选采油菌株利用血平板法进行初步筛选得到初筛发酵液、及初筛发酵液采用排油圈法进行复筛后筛选所得。该混合菌综合了三种菌株的优点，能够产生应用于油田采油的生物表面活性剂，且该混合菌的筛选方法适用面广泛，有效降低了筛选成本，此外该筛选方法准确性高、选择性强、流程方便易操作，且与现有技术相比周期更短。

Description

一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种油田采油用微生物，尤其涉及一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法。

背景技术

强化采油是一类通过改善油藏及油藏流体的物理和化学特性提高原油采收率的开采技术。石油开采技术大致可以分为一次采油、二次采油和三次采油，其中一次采油是利用油层中的天然能量进行的；二次采油是利用一定工艺技术恢复油层压力来进行油田开发的，常见的为注水采油；此后提高采收率的技术属于三次采油。目前除中东地区外，世界主要产油国家的主力油田都已进入开发后期，因此大力开发各类新型三次采油技术，提高油井采收率，对于提高原油产量，缓解石油危机意义重大。

微生物可在石油勘探、采收和石油环保三方面发挥重要作用。我国在“九五”、“十五”期间，先后对微生物采油技术立项攻关，中国石化与中科院合作，在胜利油田围绕石油微生物技术进行了大量的室内基础研究和矿场应用研究，胜利油田1995年就建立了石油微生物菌种库，已掌握了120多种不同用途的菌种。石油微生物技术在石油工业的生产过程中具有较强的适应性和广阔的应用前景，它不但能进一步提高石油采收率，延长油田开发寿命，而且能够有效地降解石油污染物，解决油田生产中的原油污染问题，没有二次污染。目前，世界采油工业采收率也就50％左右，美国能源部(DOE)的研究表明，微生物可提高采收率10％-15％，可延长油藏开发5-10年。挪威Statoil公司在Norne油田使用微生物采油技术，结果增产7％-10％，预计在15年内可累计增3000万桶原油。我国胜利油田在四个块区的微生物采油试验也已累计增油6万余桶。

目前，世界各主要产油国都把微生物采油技术确定为新一代采油技术进行重点研究，在生物增产领域，新的生物表面活性剂制剂，可以应用在射孔、作业洗修井、完井等工艺中，解决植物胶残渣的伤害，并有良好的降粘清洁油垢，诱导油流，不伤害油藏。用该技术完井，在环境保护的有利基础上，比同类油井增产30％以上。然而，如何筛选产生物表面活性剂的混合菌，尚未取得突破性进展。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可生化提取得到高效的生物表面活性催化制剂的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法。

本发明的技术方案是：

本发明公开了一种产生物表面活性剂的混合菌，其由三种菌株混合组成，该三种菌株分别为，

(1)名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，保藏编号为CCTCC AB205091；

(2)名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)，保藏编号为CCTCC S2013441；

(3)名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏编号为CCTCC AB205141。

本发明还公开了上述产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括下述步骤：

(1)待筛选采油菌株的挑选；

(2)将(1)中挑选好的待筛选采油菌株进行活化及培养；

(3)将经(2)中活化及培养好的待筛选采油菌株利用血平板法进行初步筛选，得到初筛发酵液；

(4)将(3)中所得初筛发酵液采用排油圈法进行复筛，得到产生物表面活性剂的混合菌。

其进一步的技术方案是：

步骤(1)中待筛选采油菌株包括保藏编号为CCTCC AB 205091且名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、保藏编号为CCTCC S2013441且名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)和保藏编号为CCTCC AB 205141和名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株。

步骤(2)中待筛选采油菌株的活化过程为：将待筛选采油菌株转接于斜面培养基上，37℃下培养2d，其中斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

步骤(2)中待筛选采油菌株的培养过程依次包括种子培养和发酵培养。

所述种子培养的过程为：取经斜面培养基培养活化后的带筛选菌株的种子一环，转接于种子液体培养基中，37℃摇床培养16h，转速为160r/min，其中种子液体培养基为：葡萄5g，牛肉3g，蛋白胨10g，MgSO₄·7H₂O为2g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

所述发酵培养的过程为：以4％的接种量将种子培养所得种子液接种于初始发酵培养基中，37℃摇床培养72h，转速为160r/min，其中初始发酵培养基为：葡萄糖20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄为5g，K₂HPO₄为5g，MgSO₄·7H₂O为0.25g，NaCl为2g，CaCl₂为0.08g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

步骤(3)中血平板法的步骤为：用无菌牙签将经发酵培养好的待筛选菌株点种在冷却的血平板分离培养基上，37℃培养24h～48h，根据血平板上溶血圈直径来初步判断菌株产生物表面活性剂的能力，其中血平板分离培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min，在培养基冷却至45℃左右时，加入100mL新鲜猪血上清液，混匀。

步骤(4)中排油圈法的步骤为：取点种有待筛选菌株且直径为15cm的血平板分离培养皿，加入100mL水后加入1mL液体石蜡，待液体石蜡扩散成一个圆形油膜时，在其中心加入10μL经离心、萃取后的去杂发酵液，测定排油圈的直径并跟踪测定5天。

本发明还公开了上述产生物表面活性剂的混合菌提取制备所得的生物表面活性剂。

其进一步的技术方案是：

所述生物表面活性剂的主要成分是为鼠李糖脂。

所述的生物表面活性剂的理化指标为：外观呈现棕茶色半透明浓缩液体且有酵素气味；pH值为5～7，密度为1～1.1g/cm³，完全溶于水且能够与任何矿化度的污水配伍，但不溶于油；沸点为100℃，且耐温≤220℃。

本发明还公开了上述生物表面活性剂在制备油田采油用生物表面活性剂中的应用。

本发明还公开了上述生物表面活性剂在油田采油中的应用。

其进一步的技术方案是：

所述生物表面活性剂的应用浓度为0.5～3.0wt.％，最优的应用浓度为2.0％。

所述生物表面活性剂适用于不高于220℃的工作环境。

所述生物表面活性剂应用于稠油热采井增产。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明提供的混合菌综合了三种菌株的优点，能够产生应用于油田采油的生物表面活性剂，且该混合菌的筛选方法适用面广泛，有效降低了筛选成本，此外该筛选方法准确性高、选择性强、流程方便易操作，且与现有技术相比周期更短。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是菌株DN4-3的生长曲线；

图2为种龄对脂肽发酵的影响；

图3为不加生物表面活性剂静态洗油效果图；

图4为添加2％生物表面活性剂静态洗油效果图；

图5为不加生物表面活性剂静态洗油后油砂图

图6为添加2％生物表面活性剂静态洗油后油砂图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、本发明所述产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)菌株的活化：将待筛选采油菌株转接于斜面培养基上，37℃下培养2d，其中斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL， pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min，本具体实施例中待筛选采油菌种中包括保藏编号为CCTCC AB 205091且名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、保藏编号为CCTCC S2013441且名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)和保藏编号为CCTCC AB 205141和名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株，其中CCTCC代表保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，此外还包括有里氏木霉菌(Trichoderma reesei)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、保藏编号为ATCC43052的诺卡氏菌(Nocardioides luteus Prauser)，保藏编号为ATCC39323的拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum subsp.aridum Shearer)、保藏编号为ATCC33911的脱硫杆菌(Desulfobacter postgatei)和保藏编号为NCTC10651的链杆菌(Streptobacillus moniliformis)。

(2)种子培养：取(1)中经斜面培养基培养活化后的带筛选菌株的种子一环，转接于种子液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养16h，转速为160r/min，其中种子液体培养基为：葡萄糖5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，MgSO₄·7H₂O为2g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(3)发酵培养：以4％的接种量将(2)中种子液接种于初始发酵培养基中(200mL/500mL)，37℃摇床培养72h，转速为160r/min，其中初始发酵培养基为：葡萄糖20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄为5g，K₂HPO₄为5g，MgSO₄·7H₂O为0.25g，NaCl 2g，CaCl₂为0.08g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

(4)血平板法初筛：用无菌牙签将经(3)发酵培养好的待筛选菌株点种在冷却的血平板分离培养基上，每个菌种重复三次作为平行实验，37℃培养24h～48h，根据血平板上溶血圈直径来初步判断菌株产生物表面活性剂的能力。这是利用生物表面活性剂的溶血特性来进行筛选的，其中血平板分离培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min，在培养基冷却至45℃左右时，加入100mL新鲜猪血上清液，混匀。

(5)排油圈法复筛：取上述(4)中点种有待筛选菌株且直径为15cm的血平板分离培养皿，加入100mL的水后加入1mL的液体石蜡，待液体石蜡扩散成一个圆形油膜时，在其中心加入10μL经离心、萃取后的去杂发酵液，测定排油圈的直径，跟踪检测5天，重复测量三次去平均值。

二、由上述方法筛选所得的产生物表面活性剂的混合菌由三种菌株混合组成，该三种菌株分别为，(1)名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，保藏编号为CCTCC AB 205091，保藏日期2014年11月21日；(2)名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)，保藏编号为CCTCC S2013441，保藏日期为2013年3月1日；(3)名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏编号为CCTCC AB 205141，保藏日期为2005年10月21日。

三、筛选所得混合菌系统分类鉴定如下所述：

(1)形态学鉴定：包括单菌落形态观察，可将筛选出的菌株进行平板画线，37℃培养24～48h，然后进行菌落形态观察；还包括菌体形态观察，可对菌种进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，然后在光学显微镜下进行形态学观察。

(2)生理生化性质鉴定：对菌株进行淀粉水解实验(淀粉培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，溶于1000mL水中，121℃蒸汽灭菌20min)、明胶液化实验(明胶培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于100mL水中，加入明胶12～18g，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌，溶化后调pH 7.2～7.4，121℃蒸汽灭菌30min)、石蕊牛奶实验(石蕊牛奶培养基：牛奶粉100g，石蕊0.075g，溶于1000mL水中，pH6.8，121℃蒸汽灭菌15min)、糖发酵实验(糖发酵培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于蒸馏水1000mL，调pH至7.6，将上述培养基分装于试管内，试管内放置德汉氏小管，121℃蒸汽灭菌20min。配置20％葡萄糖、乳糖溶液各10mL，再121℃蒸汽灭菌30min。分别灭菌后，每管以无菌操作加入20％的无菌糖溶液0.5mL)、甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验、柠檬酸盐实验(柠檬酸盐培养基：NH₄H₂PO₄为1g，K₂HPO₄为1g，NaCl5g，MgSO₄，0.2g，柠檬酸钠2g，琼脂20g，溶于蒸馏水1000mL中。将上述各成分加热熔解后，调pH至6.8，加入指示剂1％溴麝香草酚蓝乙醇溶液10mL，摇匀后脱脂棉过滤，再分装试管在121℃蒸汽灭菌20min后制成斜面)、硫化氢实验、接触酶实验、卵磷脂酶实验(卵黄琼脂平板培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCI10g，琼脂20g，5％卵黄悬液，溶于1000mL水中，用1M NaOH调pH至7.0，121℃蒸汽灭菌20min)和硝酸盐实验(硝酸盐培养基：硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，调pH至7.4，分装于试管中，121℃蒸汽灭菌15min)。

(3)rDNA序列分析：a.基因组DNA的提取：选择培养至数生长期的菌悬液1500μL，12000r/min，1min，收集菌体；菌体重悬于300μLTE缓冲液中；加入溶菌酶6μL，37℃保温30min；加入68℃预热的10％SDS 16.5μL；加蛋白酶K(20mg/mL)18μL，55℃保温2h；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，混匀，12000r/min，离心5min，取上清至新的离心管中，重复2～3次；上清溶液中加入1/10体积醋酸钠(3mol/L)和等体积的异戊醇，-20℃保持1.5～2h后12000r/min，5min；上清溶液中加入等体积预冷的70℃乙醇，12000r/min，离心15min，弃上清，离心管置于通风橱内干燥；沉淀用50μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。b.PCR扩增、反应物纯化、连接及转化：设计通用引物：正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID:1)，反向引物为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID:2)，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，选用MAX胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，将纯化产物同pMD18-T载体进行连接，而后转化进x菌株感受态细胞中进行蓝白筛选实验，挑取若干白斑活化，通过菌落PCR实验验证转化结果。c.16S rDNA序列分析：将挑取的阳性克隆子送至测序公司测序，将测序结果提交至GenBank进行Blast分析并绘制系统进化树。采用引物16S rDNA进行PCR扩增，得到16S rDNA序列长度为1500bp，将得到的序列提交到NCBI上进行序列比对，利用blast将所测得的基因序列与GenBank数据库进行序列同源性比较，获取相近典型菌株的基因序列，输入序列进行blast比对搜索并进行分析，采用双向测通、序列拼接，有99种菌与之序列的相似性达到98％，基本可以判断菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

四、本发明所述混合菌所产生的表面活性剂的定性分析方法及结果。

a、将薄层层析硅胶与0.4％的CMC-Na溶液以1：3的比例倒入研钵内研磨混匀，均匀铺在玻璃板上，自然阴干，105℃活化30min后备用。

b、发酵液10000r/min，离心20min，上清液用等体积的氯仿/甲醇(2/1，v/v)混合液萃取12h，萃取两次，取下层作为点样样品。

c、用毛细管吸取离心萃取后的样品进行点样。

d、选取氯仿/甲醇/水(65/25/4，v/v/v)的混合液作为扩展剂。将适量的扩展剂倒入层析槽中，将点好样的层析板置于析槽中(注意扩展剂不可以高于标准线)，盖好层析槽盖，层析结束后取出层析板，自然晾干后喷上显色剂。三种显色剂分别为：1.苯酚-硫酸试剂，检测糖脂类表面活性剂，显棕色。2.钼酸铵-高氯酸显色剂，检测磷脂类表面活性剂类型，显蓝绿色。3.0.5％茚三酮丙酮显色剂；检测脂肽类表面活性剂，显红色。通过形态观察、革兰氏染色、生理生化反应和16s rDNA序列分析，鉴定该菌株为铜绿假单胞菌。

五、本发明所述混合菌所产生的表面活性剂的定量分析方法及结果。

a、生物表面活性剂的提取：发酵液10000r/min离心20min，取上清液；用浓盐酸调上清液pH＝2.0，4℃静置过夜；10000r/min离心20min，收集沉淀，用少量pH为2的盐酸溶液洗涤沉淀后，用1mol/L的NaOH溶液将沉淀的pH调至7.0，冷冻干燥得表面活性剂粗品；将粗品溶于氯仿/甲醇(2/1，v/v)溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，冷冻干燥得到实验室用表面活性剂样品。

b、标准表面活性剂溶剂的配制：称取75mg已提纯的实验室用表面活性剂溶解于无菌蒸馏水中，倒入容量瓶中用无菌蒸馏水定容至50mL，得到浓度为1500mg/L的标准表面活性剂溶液，将其稀释一定倍数得到浓度分别为300mg/L、600mg/L、900mg/L和1200mg/L的标准表面活性剂溶液，冰柜4℃保存。

c、排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关系曲线的绘制：据相关文献报道，排油圈的直径与表面活性剂的量呈线性关系，以标准生物表面活性剂浓度为横坐标，排油圈直径为纵坐标，绘制排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关系曲线。

d、精密度实验：连续测量1200mg/L的标准表面活性剂溶液排油圈6次，计算RSD值。

e、重复性实验：取同批发酵液6份，平行测量其排油圈大小，计算RSD值。

将活化后的菌株接种于种子培养基中，160r/min摇床培养，每隔2h取种子培养液。将其稀释一定倍数后于波长620nm处进行吸光度的测定。以培养时间为横坐标，其结果参见图1。

将种龄分别为14h、15h、16h、17h、18h、19h的种子液，以4％的接种量接入初始发酵培养基，37℃，160r/min发酵72h，测定表面活性剂产量，结果如图2所示。由图2可知，处于对数生长中后期的菌株对新培养环境的适应能力较强，接种后能够快速生长，有利于提高生物表面活性剂的产量，而且此时的菌体浓度相对较高，有利于保持较高的接种量。

薄层层析结果：采用磷脂及类脂显色剂，不显颜色，因此初步判断不是磷脂类生物表面活性剂。茚三酮显色剂不显颜色。由此判断不是脂肽生物表面活性剂。只有糖脂显色剂有明显的棕黄色斑点。因此，提取的产品里不含有类脂、磷脂及脂肽，只含有糖脂。具体结果参见表1。

表1

展开剂	比例	现象	Rf
				V(氯仿):V(甲醇):V(水)	65:15:2	有棕黄色斑点	0.45
V(氯仿):V(甲醇):V(乙酸)	80:25:1	有棕黄色斑点	0.55
				V(氯仿):V(乙醇)	8:2	有棕黄色斑点	0.50
V(正己烷):V(乙醇):V(乙酸)	80:20:1	有棕黄色斑点	0.52
				V(正丁醇):V(乙酸):V(水)	16:4:8	有棕黄色斑点	0.48

将糖脂显色剂显色的样品提取物再进行薄层层析分析，采用不同的展开剂体系展开点样的硅胶板，显色后确定Rf值。根据糖脂的薄层分析，本实验所测物质的Rf与鼠李糖脂的Rf值相近。因此，可以推断提取物为鼠李糖脂。

六、发明混合菌产生的生物表面活性剂在采油方面的应用。

采用混合菌产生的生物表面活性剂进行测试；实验用油有两种，界面张力测量用油为煤油；降粘率测定及油砂制备用油为古城油田BQ33井原油，该原油在40℃下原油粘度为27000mPa·s。实验用油砂的制备为：实验用砂的量为0.8-1.2mm石英砂(白色)，洗净烘干，在100ml烧杯中放入20g石英砂并加入3g原油加热并搅拌均匀，并将混合好的油砂在50℃水浴放置4天。本实施例中实验用水均为蒸馏水。

(1)静态洗油试验

在放有油砂的100ml烧杯中，分别加入50ml不同浓度的生物表面活性剂溶液，在50℃温度下静置24h，然后用手摇动，使油从油砂内部逸出，计量生物表面活性剂溶液从油砂中洗出的油量。洗油率计算方法:

洗油率＝(V₂/V₁)×100％

式中:V₁—油砂中含油量(ml)；

V₂—洗出油量(ml)。

由表2可看出，随着活性剂浓度的增加，洗油率增加。从试验结果看，本发明混合菌产生的生物表面活性剂可在很低的浓度下(0.5％)起作用，当活性剂浓度为2％时洗油效率最好该，但生物表面活性剂高温热处理后洗油效果有所降低，具体表现在洗出油滴相比明显变大，悬浮力下降，可能是热处理后活性剂活性有所下降。

表2 不同浓度活性剂溶液洗油率测定数据表

其中*代表试验中将2％活性剂溶液放于密封的不锈钢容器中，在220℃进行热处理24h。

(2)静态洗油效果

图3和图4为静态洗油实验过程中的现象，从图3可以看出不加生物表面活性剂的油砂，原油卷缩成大油珠吸附油砂内表面，仅少量漂浮在水相中，大量油珠被砂子包裹粘在油砂内部，洗油效果差。而且部分油珠还携带细砂上浮。从图4可看出，加生物表面活性剂的油砂，原油被分散为细小油珠，油珠源源不断从油砂中析出，石英砂表面洁净，洗油效果好。原因可能是由于活性剂的分子能附着到油砂的表面，然后将油从砂表面剥离下来；一部分活性剂载着油混入水中，另一部分活性剂分子则附着到砂表面，使其它的油分子无法再附着这部分砂；而混入水中的活性剂的憎油特性开始发挥作用，迅速将油远远提开；由于活性剂本身只溶于水不溶于油，留在水中的活性剂将继续上述过程。

图5和图6为实验结束后残留油砂的照片，从图5看，水洗后油砂残余油多，石英砂砂粒之间成团。从图6看，经过生物表面活性剂洗油后的油砂松散洁净，说明活性剂洗油效果显著，而且改变了油砂表面润湿性，有防止原油再粘附的作用。

(3)稠油降粘性能测试

试验中将BQ33井原油与2％活性剂溶液按7:3的质量比混合，放入50℃水浴充分搅拌，观察乳化状况。用NXS-11A型旋转粘度计在不同温度下测定油样的粘度，实验结果见表3，从下表可看出2％活性剂基本没有降粘效果。从加入活性剂溶液的原油看，活性剂改变稠油流动状态，形成稀软状油滴、容易流动，但静置后原油又聚集在一起，分层，乳化效果不好。

表3 加活性剂前后原油粘度测定数据

温度(℃)	50	60	70	80
					原油粘度(mPa.s)	10000	5000	2276	1171
加后粘度(mPa.s)	9380	4500	2222	1030
					降粘率(％)	6.2	10	2.37	12

(4)表面张力及界面张力测定

表4给出不同浓度活性剂溶液的表面张力及与煤油间的界面张力，试验结果是在常温下用K12型表面张力仪测得的平均值。

表4 不同浓度活性剂溶液的表界面张力测定数据

样品浓度(％)	表面张力(mN/m)	界面张力(mN/m)
			0	73.94	36.52
0.5	44.44	1.88

1	44.49	2.96
			1.5	46.00	2.71
2	44.56	3.10
			3	45.01	2.72

将活性剂溶液放于密封的不锈钢容器中，在220℃进行热处理24h后取出，配成不同浓度活性剂溶液测得的表面张力及界面张力数据如表5。

表5 热处理后不同浓度活性剂溶液的表界面张力测定数据

样品浓度(％)	表面张力(mN/m)	界面张力(mN/m)
			0	73.94	36.52
0.5	40.12	2.95
			1	42.10	3.32
1.5	42.49	3.51
			2	42.49	3.98
3	45.24	4.29

从表4可以活性剂溶液能大幅度降低表面张力及油水界面张力，而且在浓度降低时，表面张力及界面张力均呈减小的趋势，说明生物酶在低浓度下也有较好的使用效果，能改变了岩石表面润湿性，降低油流阻力。

从表5可看出，活性剂经220℃、24h的热处理后，表面张力及界面张力数据与未热处理时同浓度样品相差不大，表明该活性剂有较强的耐温性能，可用于稠油热采井增产。

(5)活性剂腐蚀性试验

提供的活性剂原液PH值为5.5，2％浓度的活性剂水溶液的PH值为6.5，属弱酸性，为考察活性剂对钢体的腐蚀性，试验中采取表面打磨且清除表面油污的N80油管试片作为试验材料，将试片放入2％浓度的活性剂水溶液中，密封后放入90℃烘箱中静置24h，观察试片表面现象。试验结果显示，试片表面大部分光亮，但部分试片表面黑色物沉积，清除沉积物发现有浅层点蚀坑，说明活性剂溶液具有轻微的腐蚀性。

本具体实施例说明，该生物表面活性剂可在很低的浓度下(0.5％)起作用，但当活性剂浓度为2％时洗油效率最好；活性剂能将油从油砂表面分离开来，洗油后油砂洁净、松散，有防止原油再粘附的作用；活性剂没有降粘效果，主要是改变稠油流动状态，形成稀软状油滴，容易流动；活性剂溶液能大幅度降低表面张力及油水界面张力，而且有较好的耐高温性能；活性剂溶液呈弱酸性，在高温下活性剂溶液对N80试片具有轻微的腐蚀性。

本发明混合菌产生的生物表面活性剂是利用微生物生化提取得生物表面活性催化制剂，在提高采油方面比微生物生化更具直接性，效果反应快，是国内外油田化学最先进的提高采收率、强化采油的技术，其具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、不损伤油层和无污染等优点，可以让低渗透的老油田重新获得强化生产。

生物表面活性剂是微生物采油技术中较领先的技术，它运用基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物工程技术，具有高效释放固体粒子表面碳氢化合物(油)的能力。生物表面活性剂是一种高效、环保型液体产品，具有非常高的释放固体表面原油的能力，可进行生物降解，能迅速剥离固体表面的碳氢化合物(原油)。生物表面活性剂注入地层后，可以将近井地带结晶、堆积在岩石颗粒上的蜡及沥青质剥落下来，一部分生物表面活性剂附着在岩石表面，使岩石润湿性由油湿转变为水湿，降低原油在地层空隙中的流动阻力，使原油从岩石颗粒表面释放，从微孔隙中析出，进入水中的生物表面活性剂分子，可以被水运送到砂岩地层周围更远的地带，并打开新的流通通道，在砂岩地层中产生新的出油通道，达到注水井解堵增注、油井解堵增产、驱油、提高采收率的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种产生物表面活性剂的混合菌，其特征在于：由三种菌株混合组成，该三种菌株分别为，

(2)名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)，保藏编号为CCTCCS2013441；

2.根据权利要求1所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：包括下述步骤：

(1)待筛选采油菌株的挑选；

(2)将(1)中挑选好的待筛选采油菌株进行活化及培养；

3.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中待筛选采油菌株包括保藏编号为CCTCC AB 205091且名称为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、保藏编号为CCTCC S2013441且名称为类诺卡氏菌属(Nocardioides ginsengagri)和保藏编号为CCTCC AB 205141和名称为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株。

4.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中待筛选采油菌株的活化过程为：将待筛选采油菌株转接于斜面培养基上，37℃下培养2d，其中斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

5.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中待筛选采油菌株的培养过程依次包括种子培养和发酵培养。

6.根据权利要求5所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：所述种子培养的过程为：取经斜面培养基培养活化后的带筛选菌株的种子一环，转接于种子液体培养基中，37℃摇床培养16h，转速为160r/min，其中种子液体培养基为：葡萄5g，牛肉3g，蛋白胨10g，MgSO₄·7H₂O为2g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

7.根据权利要求5所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：所述发酵培养的过程为：以4％的接种量将种子培养所得种子液接种于初始发酵培养基中，37℃摇床培养72h，转速为160r/min，其中初始发酵培养基为：葡萄糖20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄为5g，K₂HPO₄为5g，MgSO₄·7H₂O为0.25g，NaCl为2g，CaCl₂为0.08g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

8.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：步骤(3)中血平板法的步骤为：用无菌牙签将经发酵培养好的待筛选菌株点种在冷却的血平板分离培养基上，37℃培养24h～48h，根据血平板上溶血圈直径来初步判断菌株产生物表面活性剂的能力，其中血平板分离培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min，在培养基冷却至45℃左右时，加入100mL新鲜猪血上清液，混匀。

9.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中排油圈法的步骤为：取点种有待筛选菌株且直径为15cm的血平板分离培养皿，加入100mL水后加入1mL液体石蜡，待液体石蜡扩散成一个圆形油膜时，在其中心加入10μL经离心、萃取后的去杂发酵液，测定排油圈的直径并跟踪测定5天。

10.根据权利要求1所述产生物表面活性剂的混合菌提取制备所得的生物表面活性剂。

11.根据权利要求10所述的生物表面活性剂，其特征在于：主要成分是为鼠李糖脂。

12.根据权利要求10所述的生物表面活性剂，其特征在于：该生物表面活性剂的理化指标为：外观呈现棕茶色半透明浓缩液体且有酵素气味；pH值为5～7，密度为1～1.1g/cm³，完全溶于水且能够与任何矿化度的污水配伍，但不溶于油；沸点为100℃，且耐温≤220℃。

13.根据权利要求10所述的生物表面活性剂在制备油田采油用生物表面活性剂中的应用。

14.根据权利要求10所述的生物表面活性剂在油田采油中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述生物表面活性剂的应用浓度为0.5～3.0wt.％。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述生物表面活性剂的应用浓度为2.0％。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述生物表面活性剂适用于不高于220℃的工作环境。

18.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述生物表面活性剂应用于稠油热采井增产。