CN104877928B - 一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种油田微生物采油技术，尤其涉及一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法；混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3.3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.10279，鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.2568；通过采油菌挑选、菌株活化及培养、血平板法初筛、排油圈法复筛获得。

Description

一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种油田微生物采油技术，尤其涉及一种产生物表面活性剂的混合菌及其筛选方法。
背景技术
强化采油是一类通过改善油藏及油藏流体的物理和化学特性，提高原油采收率的开采技术。石油开采技术大致可以分为一次采油、二次采油和三次采油。一次采油是利用油层中的天然能量进行的；二次采油是利用一定工艺技术恢复油层压力来进行油田开发的，常见的为注水采油；此后提高采收率的技术属于三次采油。目前，除中东地区外，世界主要产油国家的主力油田都已进入开发后期。因此大力开发各类新型三次采油技术，提高油井采收率，对于提高原油产量，缓解石油危机意义重大。
微生物可在石油勘探、采收和石油环保三方面发挥重要作用。我国在“九五”、“十五”期间，先后对微生物采油技术立项攻关。中国石化与中科院合作，在胜利油田围绕石油微生物技术进行了大量的室内基础研究和矿场应用研究。胜利油田1995年就建立了石油微生物菌种库，已掌握了120多种不同用途的菌种。石油微生物技术在石油工业的生产过程中具有较强的适应性和广阔的应用前景，它不但能进一步提高石油采收率，延长油田开发寿命，而且能够有效地降解石油污染物，解决油田生产中的原油污染问题，没有二次污染。目前，世界采油工业采收率也就50％左右，美国能源部(DOE)的研究表明，微生物可提高采收率10％-15％，可延长油藏开发5-10年。挪威Statoil公司在Norne油田使用微生物采油技术，结果增产7％-10％，预计在15年内可累计增3000万桶原油。我国胜利油田在四个块区的微生物采油试验也已累计增油6万余桶。
目前，世界各主要产油国都把微生物采油技术确定为新一代采油技术进行重点研究，在生物增产领域，新的生物表面活性剂制剂，可以应用在射孔、作业洗修井、完井等工艺中，解决植物胶残渣的伤害，并有良好的降粘清洁油垢，诱导油流，不伤害油藏。用该技术完井，在环境保护的有利基础上，比同类油 井增产30％以上。然而，如何筛选产生物表面活性剂的混合菌，尚未取得突破性进展。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可生化提取得到高效的生物表面活性催化制剂的产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法。
本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌，混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3.3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.10279，鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.2568。
进一步的，里氏木霉的活菌数为总活菌数的10-20％，施氏假单胞菌的活菌数为总活菌数的20-30％，鼠李糖乳杆菌的活菌数为总活菌数的50-70％。
本发明还提供一种产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括以下步骤：
S1、采油菌挑选：包括以下11种菌株：
购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的：
3.3711 里氏木霉 Trichoderma reesei
1.10279 施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri
1.926 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa
1.2568 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus
1.1858 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis
4.1476 扭托甲基杆菌 Methylobacterium extorquens
1.6492 嗜热栖热菌 Thermus thermophilus
购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)的：
43052TM诺卡氏菌Nocardioides luteus Prauser
39323TM拟孢囊菌Kibdelosporangium aridum subsp.aridum Sheareret al.
33911TM脱硫杆菌Desulfobacter postgatei
购自英国典型菌种保藏中心(NCTC)的：
NCTC 10651 链杆菌 Streptobacillus moniliformis
S2、菌株活化及培养；
S3、血平板法初筛：采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌株，得到初筛发酵液；
S4、排油圈法复筛：采用排油圈法复筛步骤S2中的初筛发酵液，得到产生物表面活性剂的混合菌。
本发明还提供产生物表面活性剂的混合菌，在制备生物表面活性剂上的应用。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
BEROTM是利用微生物生化提取得生物表面活性催化制剂，在提高采油方面比微生物生化更具直接性，效果反应快，是国内外油田化学最先进的提高采收率、强化采油的技术。BEROTM增产技术，具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、不损伤油层和无污染等优点，可以让低渗透的老油田重新获得强化生产。
生物表面活性剂是微生物采油技术中较领先的技术，它运用基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物工程技术，具有高效释放固体粒子表面碳氢化合物(油)的能力。生物表面活性剂是一种高效、环保型液体产品，具有非常高的释放固体表面原油的能力，可进行生物降解，能迅速剥离固体表面的碳氢化合物(原油)。生物表面活性剂注入地层后，可以将近井地带结晶、堆积在岩石颗粒上的蜡及沥青质剥落下来，一部分生物表面活性剂附着在岩石表面，使岩石润湿性由油湿转变为水湿，降低原油在地层空隙中的流动阻力，使原油从岩石颗粒表面释放，从微孔隙中析出，进入水中的BEROTM分子，可以被水运送到砂岩地层周围更远的地带，并打开新的流通通道，在砂岩地层中产生新的出油通道，达到注水井解堵增注、油井解堵增产、驱油、提高采收率的目的。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
本发明所涉及的培养基，具体如下：
1.1斜面培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。
1.2种子培养基
葡萄糖5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，MgSO4*7H2O2g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。
1.1淀粉培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，溶于1000mL水中，121℃蒸汽灭菌20min。
1.3明胶培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于100mL水中，加入明胶12～18g，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌，溶化后调pH 7.2～7.4，121℃蒸汽灭菌30min。
1.4石蕊牛奶培养基
牛奶粉100g，石蕊0.075g，溶于1000mL水中，pH6.8，121℃蒸汽灭菌15min。
1.5糖发酵培养基
蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于蒸馏水1000mL，调pH至7.6。将上述培养基分装于试管内，试管内放置德汉氏小管，121℃蒸汽灭菌20min。配置20％葡萄糖、乳糖溶液各10mL，再121℃蒸汽灭菌30min。分别灭菌后，每管以无菌操作加入20％的无菌糖溶液0.5mL。
1.6葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨5g，葡萄糖5g，KH2PO42g，溶于蒸馏水1000mL，调pH 7.0～7.2， 过滤分装后112℃蒸汽灭菌30min。
1.7柠檬酸盐培养基
NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCI5g，MgSO40.2g，柠檬酸钠2g，琼脂20g，溶于蒸馏水1000mL中。将上述各成分加热熔解后，调pH至6.8，加入指示剂1％溴麝香草酚蓝乙醇溶液10mL，摇匀后脱脂棉过滤，再分装试管在121℃蒸汽灭菌20min后制成斜面。
1.8醋酸铅培养基
pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10％醋酸铅水溶液1mL。将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL加热溶解，待冷却至60℃时加入硫代硫酸钠0.25g，调pH为7.2，分装于三角瓶中，115℃蒸汽灭菌15min。取出后冷却至55～60℃，加入灭菌的10％醋酸铅水溶液1mL，混匀后倒入灭菌试管。
1.9卵黄琼脂平板培养基
酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCI10g，琼脂20g，5％卵黄悬液，溶于1000mL水中，用1MNaOH调pH至7.0，121℃蒸汽灭菌20min。
1.10硝酸盐培养基
硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL。调pH至7.4，分装于试管中，121℃蒸汽灭菌15min。
1.11血平板分离培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。在培养基冷却至45℃左右时，加入100mL新鲜猪血上清液，混匀。
1.12 SOC培养基
胰化蛋白胨0.5g，酵母提取物2g，氯化钠0.05g，氯化钾(250mmol/L)1mL，氯化镁(2mol/L)0.5mL(单独灭菌)，葡萄糖溶液(1mol/L)2mL(无菌滤器除菌)，注意：1.氯化钾(250mmol/L)和氯化镁(2mol/L)在用SOC培养基时加入；2.待培养基温度降至60℃以下时再加入葡萄糖。
1.13初始发酵培养基
葡萄糖20g，蛋白胨4g，KH2PO45g，K2HPO45g，MgSO4*7H2O 0.25g， NaCI 2g，CaCI20.08g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。
实施例二
本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，包括以下步骤：
2.1菌株的活化
将冷藏的11株微生物采油菌株转接于斜面培养基上，37℃培养2d。
2.2种子培养
取斜面活化后的种子一环，转接于种子液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养16h，转速为160r/min。
2.3发酵培养
以4％的接种量将种子液种于初始发酵培养基中(200mL/500mL)，37℃摇床培养72h，转速为160r/min。
2.4产生物表面活性剂采油菌株的筛选
2.4.1血平板法初筛
利用生物表面活性剂的溶血特性，采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌株。用无菌牙签将待筛选菌株点种在冷却的血平板培养基上，每个菌种重复三次作为平行实验，37℃培养24h～48h。根据血平板上溶血圈直径来初步判断菌株产生物表面活性剂的能力。
2.4.2排油圈法复筛
取直径为15cm的培养皿，加入100mL的水后加入1mL的液体石蜡，待液体石蜡扩散成一个圆形油膜时，在其中心加入10μL经离心、萃取后的去杂发酵液，测定排油圈的直径，跟踪检测5天，重复测量三次去平均值。
实施例三
本发明提供一种产生物表面活性剂的混合菌的系统分类鉴定方法，包括：
3.1形态学鉴定
3.1.1单菌落形态观察
将筛选出的菌株平板划线，37℃培养24～48h，进行菌落形态观察。
3.1.2菌体形态观察
对菌种进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，在光学显微镜下进行形态观察。
3.2生理生化性质鉴定
对菌株进行淀粉水解实验、明胶液化实验、石蕊牛奶实验、糖发酵实验、甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验、柠檬酸盐实验、硫化氢实验、接触酶实验、卵磷脂酶实验和硝酸盐实验。
3.3 rDNA序列分析
3.3.1基因组DNA的提取：
选择培养至数生长期的菌悬液1500μL，12000r/min，1min，收集菌体；
菌体重悬于300μLTE缓冲液中；
加入溶菌酶6μL，37℃保温30min；
加入68℃预热的10％SDS 16.5μL；
加蛋白酶K(20mg/mL)18μL，55℃保温2h；
加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，混匀，12000r/min，离心5min，取上清至新的离心管中，重复2～3次；
上清溶液中加入1/10体积醋酸钠(3mol/L)和等体积的异戊醇，-20℃保持1.5～2h后12000r/min，5min；
上清溶液中加入等体积预冷的70℃乙醇，12000r/min，离心15min，弃上清，离心管置于通风橱内干燥；
沉淀用50μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。
3.3.2PCR扩增、反应物纯化、连接及转化
通用引物：正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，选用MAX胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，将纯化产物同pMD18-T载体进行连接，而后转化进x菌株感受态细胞中进行蓝白筛选实验，挑取若干白斑活化，通过菌落PCR实验验证转化结果。
3.3.3 16S rDNA序列分析
将挑取的阳性克隆子送至测序公司测序，将测序结果提交至GenBank进行Blast分析并绘制系统进化树。
实施例四
本发明还提供实施例二所筛选出的产生物表面活性剂的混合菌，所产生的表面活性剂的定性分析方法及结果。
4.1分析方法
a、将薄层层析硅胶与0.4％的CMC-Na溶液以1：3的比例倒入研钵内研磨混匀，均匀铺在玻璃板上，自然阴干，105℃活化30min后备用。
b、发酵液10000r/min，离心20min，上清液用等体积的氯仿/甲醇(2/1，v/v)混合液萃取12h，萃取两次，取下层作为点样样品。
c、用毛细管吸取离心萃取后的样品进行点样。
d、选取氯仿/甲醇/水(65/25/4，v/v/v)的混合液作为扩展剂。将适量的扩展剂倒入层析槽中，将点好样的层析板置于析槽中(注意扩展剂不可以高于标准线)，盖好层析槽盖，层析结束后取出层析板，自然晾干后喷上显色剂。三种显色剂分别为：1.苯酚-硫酸试剂，检测糖脂类表面活性剂，显棕色。2.钼酸铵-高氯酸显色剂，检测磷脂类表面活性剂类型，显蓝绿色。3.0.5％茚三酮丙酮显色剂；检测脂肽类表面活性剂，显红色。
实施例五
本发明还提供实施例二所筛选出的产生物表面活性剂的混合菌，所产生的表面活性剂的定量分析方法及结果。
5.1分析方法
a、生物表面活性剂的提取
发酵液10000r/min离心20min，取上清液；用浓盐酸调上清液pH＝2.0，4℃静置过夜；10000r/min离心20min，收集沉淀，用少量pH为2的盐酸溶液洗涤沉淀后，用1mol/L的NaOH溶液将沉淀的pH调至7.0，冷冻干燥得表面活 性剂粗品；将粗品溶于氯仿/甲醇(2/1，v/v)溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，冷冻干燥得到实验室用表面活性剂样品。
b、标准表面活性剂溶剂的配制
称取75mg已提纯的实验室用表面活性剂溶解于无菌蒸馏水中，倒入容量瓶中用无菌蒸馏水定容至50mL，得到浓度为1500mg/L的标准表面活性剂溶液，将其稀释一定倍数得到浓度分别为300mg/L、600mg/L、900mg/L和1200mg/L的标准表面活性剂溶液，冰柜4℃保存。
c、排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关系曲线的绘制
据相关文献报道，排油圈的直径与表面活性剂的量呈线性关系，以标准生物表面活性剂浓度为横坐标，排油圈直径为纵坐标，绘制排油圈直径与生物表面活性剂浓度的关系曲线。
d、精密度实验
连续测量1200mg/L的标准表面活性剂溶液排油圈6次，计算RSD值。
e、重复性实验
取同批发酵液6份，平行测量其排油圈大小，计算RSD值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种产生物表面活性剂的混合菌，其特征在于：混合菌包括里氏木霉、施氏假单胞菌和鼠李糖乳杆菌，其中里氏木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3.3711，施氏假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.10279，鼠李糖乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1.2568，里氏木霉的活菌数为总活菌数的10-20％，施氏假单胞菌的活菌数为总活菌数的20-30％，鼠李糖乳杆菌的活菌数为总活菌数的50-70％，
所述产生物表面活性剂的混合菌的筛选方法，依次包括以下步骤：
S1、采油菌挑选；包括以下11种菌株：
购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的：
购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)的：
43052TM诺卡氏菌Nocardioides luteus Prauser；
39323TM拟孢囊菌Kibdelosporangium aridum subsp.aridum Shearer etal；
33911TM脱硫杆菌Desulfobacter postgatei；
购自英国典型菌种保藏中心(NCTC)的：
NCTC 10651链杆菌Streptobacillus moniliformis；
S2、菌株活化及培养；将冷藏的11株微生物采油菌株转接于斜面培养基上，37℃培养2d；取斜面活化后的种子一环，转接于种子液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养16h，转速为160r/min；以4％的接种量将种子液种于初始发酵培养基中(200mL/500mL)，37℃摇床培养72h，转速为160r/min；
S3、血平板法初筛：采用血平板法初步筛选产生物表面活性剂的菌株，得到初筛发酵液；用无菌牙签将待筛选菌株点种在冷却的血平板培养基上，每个菌种重复三次作为平行实验，37℃培养24h～48h；
S4、排油圈法复筛：采用排油圈法复筛步骤S3中的初筛发酵液，得到产生物表面活性剂的混合菌。
2.根据权利要求1所述的产生物表面活性剂的混合菌，在制备生物表面活性剂上的应用。
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