CN101126074A - 一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其培养方法 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其培养方法 Download PDF

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CN101126074A CNA2007100251565A CN200710025156A CN101126074A CN 101126074 A CN101126074 A CN 101126074A CN A2007100251565 A CNA2007100251565 A CN A2007100251565A CN 200710025156 A CN200710025156 A CN 200710025156A CN 101126074 A CN101126074 A CN 101126074A
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Abstract

一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌，其特征在于命名为黄色淤泥链霉菌(Streptomyces flavolimosus：S.Flavolimosus)，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2007年4月27日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2027。该菌发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒性，并且能诱导肿瘤细胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株。

Description

一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其培养方法
一、技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌。
二、背景技术
现有技术：癌症是全世界一个主要死亡原因，据WTO统计资料显示，全世界目前大约有2460万癌症患者，2005年全世界5800万死亡总数中，癌症约占所有死亡的760万，为13％。到2020年，癌症每年可造成1000多万人死亡，但是迄今为止还没有有效的药物能够对癌症有治疗作用，由于传统的药物一般来源于陆地生物，于是人们将发现新型抗癌药物的希望寄托于海洋生物身上。
微生物是一种重要的天然产物资源。由于微生物的生物多样性极其庞大，目前认为自然界中95％～99％的微生物种群未被分离培养或描述，  微生物代谢产物为药品开发提供了取之不尽的化合物多样性。地球表面70％的面积是海洋，海洋环境具有高盐、高压、低温、寡营养等特点。在这种特殊的环境中，海洋微生物形成了独特的代谢途径，其次生代谢物的化学结构具有极大的复杂性、多样性和高生物活性，其中很多具有抗肿瘤的活性。从海洋微生物代谢产物中寻找有效的抗肿瘤药物己成为国内外重要的研究课题，此项研究虽然起步较晚，但发展迅速，目前已有许多化合物进入临床实验。
三、发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其制备方法，该菌株发酵液对肿瘤细胞具有很强的细胞毒性。
本发明的技术解决方案为：本发明采用的菌株是海洋链霉菌ACMA006菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年4月27号，馆藏号为：CGMCCNO.-2027。
本发明菌株ACMA006系从海泥中分离得到，观察分析了该菌形态特征、培养特征的、生理生化特性、细胞壁化学组分分析以及16SrDNA序列，结果表明该菌具有以下特征：(1)基生菌丝纤细多分枝，呈网状，颜色较深，气生菌丝发达，后期形成孢子丝，孢子丝直或波曲，孢子表面光滑，孢子椭圆形。一般12h或24h后菌丝体开始生长，菌丝体沿与菌丝长轴成垂直方向分裂，生长初期基丝和气丝都形成横隔，第4d开始基丝开始断裂，气丝从第5d开始断裂，后期菌丝体断裂呈Y形或短杆状。菌落表面光滑，中央隆起，在多数培养基上菌落呈绒状或粉状；(2)菌株ACMA006在多数培养基上生长状态良好，孢子为浅黄色，气生菌丝白色或浅黄色，可溶性色素浅黄至黄褐色；(3)革兰氏染色阳性，能水解淀粉、硝酸盐还原呈阳性，明胶液化、纤维素水解反应呈阴性，能使牛奶凝固和胨化，不产生H2S，不产生黑色素。能利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露醇、琥珀酸钠、甘油，不能利用蔗糖、鼠李糖、肌醇、山梨醇，对半乳糖和木糖能利用但利用率不高；细胞壁化学组分分析表明菌株ACMA006全细胞水解液中无特征性糖，无枝菌酸。(4)菌株ACMA006的16SrDNA核苷酸序列含有1507bp，将其与GeneBank等数据库中进行最大同源性比较，发现ACMA006的16SrDNA序列与链霉菌属16SrDNA序列同源性达到100％。
本发明的链霉菌ACMA006菌株，不抗酸，糖型为C型，不含枝菌酸；从形态特征、培养特征、生理生化特性以及16SrDNA序列的综合分析结果，将该菌株鉴定为链霉菌的一个新种，命名为黄色淤泥链霉菌(Streptomycesflavolimosus：S.Flavolimosus)，该菌发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒性，并且能诱导肿瘤细胞凋亡。是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株。
本发明按常规方法制备。即从海泥中分离筛选对肿瘤细胞具有很强细胞毒作用的菌株；通过发酵液发酵和离心处理制备具有抗肿瘤活性的发酵液；菌株发酵液诱导细胞凋亡试验；菌株形态特征和培养特征的观察、生理生化特性、细胞壁化学组分分析以及16SrDNA序列分析，确定其物种类型。
16SrDNA序列分析：菌株ACMA006的16SrDNA核苷酸序列为1507bp，序列如下：
ATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTC
GAACGATGAAGCCTTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACG
TGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATA
CCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGA
AGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAG
GCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGA
GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATG
GGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTT
GTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGA
AGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGC
GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGG
ATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCT
AGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAG
ATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGAC
GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC
CACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGT
GCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT
AAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGC
TTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAA
AGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA
CCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGA
GACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATG
CCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTG
CGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTG
GGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCA
GCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGT
CACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGG
AGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
GTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTC
四、附图说明
图1.海洋放线菌ACMA006对HepG2细胞的毒性测定；
图2.海洋放线菌ACMA006对HLF细胞毒性测定；
图3.阿霉素对HepG2细胞生长的抑制率；
图4.阿霉素对HLF细胞生长的抑制率；
图5光学显微镜下海洋放线菌ACMA006基生菌丝形态特征(400×)；
图6光学显微镜下海洋放线菌ACMA006气生菌丝形态特征(400×)；
图7电子显微镜下海洋放线菌孢子丝形态特征(4500×)；
图8ACMA006发酵液诱导HepG2细胞凋亡的DNA ladder分析：1.药物组；2.对照组；
图9ACMA006发酵液诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化(×400)，经ACMA006菌株发酵液作用的细胞；
图10ACMA006发酵液诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化(×400)，阴性对照组细胞。
五、具体实施方式
实施例1：MTT法测定菌株的抗肿瘤活性
采用人宫颈癌Hela细胞，以MTT法对96株海洋微生物菌株的发酵液进行细胞毒性的初筛，发现4株放线菌和2株细菌具有抗肿瘤活性。对这6株菌发酵液的细胞毒性进行复测，结果表明只有一株放线菌具有很强的抗肿瘤活性，ID50大于6000，将其命名为ACMA006，结果见表1、表2。
表1海洋微生物抗肿瘤活性的测定
  菌株类型   受试菌株数/株   具有抗肿瘤活性的菌株数/株  具有抗肿瘤活性的菌株百分数/％
  放线菌   31   4  12.9
  细菌   63   2  3.2
  真菌   2   0  0
  总计   96   6  6.3
表2具有细胞毒活性的海洋微生物的ID50
  样品   ID50
  BAMA001   40
  BAMA022   20
  ACMA006   6000
  ACMA018   80
  ACMA030   70
  ACMA031   30
实施例2：ACMA006菌株发酵液对肿瘤细胞与正常细胞的毒性
通过MTT法检测海洋放线菌ACMA006发酵液对肝癌细胞HepG2及正常人肺成纤维细胞HLF的毒性，当发酵液稀释倍数为11000时，肿瘤细胞的存活率约为50％，而正常细胞的存活率约为90％，(结果见图1、图2)；常用的抗肿瘤药物阿霉素对肿瘤细胞的IC50约为0.04μg/ml，对正常细胞的IC50约为0.08μg/ml。与阿霉素相比，该放线菌发酵液具有对肿瘤细胞杀伤作用强，对正常细胞毒副作用小等特点，因此可以作为新型抗肿瘤药物的来源，(结果见图3、图4)。
实施例3：具有抗肿瘤活性S.Flavolimosus ACMA006菌株的筛选、分离
实验方案流程的流程为：样品采集→富集培养→稀释涂布平板→三区划线纯化→斜面保藏。样品为采集的海水、海泥、海鱼、海虾、贝类、藻类等，采用了不同的分离培养基进行选择培养分离细菌、放线菌、真菌；并通过反复的三区划线来纯化菌株。结果分离到31株海洋放线菌，63株海洋细菌，2株海洋真菌。采用人宫颈癌Hela细胞，以MTT法对96株海洋微生物菌株的发酵液进行细胞毒性的初筛，发现4株放线菌和2株细菌具有抗肿瘤活性。对这6株菌发酵液的细胞毒性进行复测，结果表明只有一株放线菌具有很强的抗肿瘤活性，ID50大于6000，将其命名为ACMA006。试验中还发现ACMA006不仅能抑制Hela细胞的生长，对大肠癌(lovo细胞)、肝癌(7721细胞、HepG2细胞)和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)等细胞株都具有很强的细胞毒活性，结果见表3。
表3.海洋放线菌ACMA006对不同肿瘤细胞系的ID50
  细胞系   ID50
  Hela细胞   6000
  HepG2细胞   6000
  7721细胞   5000
  Lovo细胞   5500
  SP2/0细胞   7000
将ACMA006菌株用石蜡油封藏法保存：在已长好的斜面菌种上加入无菌石蜡油，高出斜面1cm，直立试管放入4℃冰箱保藏。
实施例4：ACMA006菌株的鉴定
(1)形态特征观察
方法：分别于高氏一号培养基、葡萄糖天门冬素培养基、蔗糖察氏培养基、无机盐淀粉培养基、葡萄糖酵母膏培养基、伊莫松培养基、营养琼脂培养基、甘油牛肉膏蛋白胨培养基上28℃插片培养7～10d，光学显微镜观察基内菌丝和气生菌丝的形态特征，电子显微镜观察孢子丝以及孢子的形态。
结果：菌丝体沿与菌丝长轴成垂直方向分裂。菌丝体直径约为0.8μm，基生菌丝纤细多分枝，呈网状，颜色较深，气生菌丝发达，孢子丝直或波曲，孢子丝以横隔分裂方式形成孢子，孢子表面光滑，孢子呈球形或椭圆形。一般12h或24h后菌丝体开始生长，生长初期基丝和气丝都形成横隔，第4d开始基丝开始断裂，气丝从第5d开始断裂，后期菌丝体断裂呈Y形或短杆状。菌落表面光滑，中央隆起。(见图5，图6，图7)
(2)培养特征
方法：分别于高氏一号培养基、葡萄糖天门冬素培养基、蔗糖察氏培养基、无机盐淀粉培养基、葡萄糖酵母膏培养基、伊莫松培养基、营养琼脂培养基、甘油牛肉膏蛋白胨培养基8种培养基上28℃培养，分别于第7、14、21、28d观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝以及可溶性色素颜色。
结果：菌株ACMA006在不同培养基上的培养特征见表4。在蔗糖察氏培养基上生长状态较差，在高氏一号培养基上生长状态良好，在其他6种培养基上生长旺盛。高氏培养基基内菌丝黄色，气生菌丝白黄色，有浅黄色可溶性色素。葡萄糖天门冬素培养基基内菌丝淡黄色，气生菌丝白黄色，有浅黄色可溶性色素。蔗糖察氏培养基基内菌丝白黄色，气生菌丝白色，无可溶性色素。无机盐淀粉培养基基内菌丝灰黄色，气生菌丝白黄色，有浅黄色可溶性色素。葡萄糖酵母膏培养基基内菌丝黄褐色，气生菌丝浅黄色，有浅黄色可溶性色素。伊莫松培养基基内菌丝黄褐色，气生菌丝浅黄色，有浅黄色可溶性色素。营养琼脂培养基基内菌丝黄褐色，气生菌丝白黄色，有浅黄色可溶性色素。甘油牛肉膏蛋白胨培养基基内菌丝黄褐色，气生菌丝浅黄色，有浅黄色可溶性色素。
表4菌株ACMA006的培养特征
  基内菌丝   气生菌丝   孢子丝   可溶性色素
  高氏一号培养基   黄色到褐色   白色到浅黄   淡黄色到白色   黄色到褐色
  葡萄糖天门冬素培养基   白色到黄色   白色到黄色   黄色   黄色
  蔗糖察氏培养基   白色到黄色   白色到牙黄色   白色到牙黄色   淡黄色到黄色
  无机盐淀粉培养基   白色到黄色   白色到牙黄色   牙黄色   浅黄
  葡萄糖酵母膏培养基   牙黄到深黄   牙黄到黄褐   白色   无色到黄色
  伊莫松培养基   牙黄到深黄色   白色到牙黄色   白色到牙黄色   无色到黄色
  营养琼脂培养基   黄色到金黄色   乳白到牙黄色   白色到牙黄色   黄色
  甘油牛肉膏蛋白胨培养基   黄色到深黄色   黄色深黄色   白色到黄色   黄色
(3)生理生化特性分析
根据张纪中等的方法观察记录各种生理生化特征及生态特征。
菌株ACMA006的生理生化特征见表5。革兰氏染色阳性，淀粉水解强、硝酸盐还原强，能使牛奶凝固和胨化，明胶液化、纤维素水解反应呈阴性，不产生H2S，不产生黑色素。能利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露醇、琥珀酸钠、甘油，不能利用蔗糖、鼠李糖、肌醇、山梨醇，含木糖的培养基上少量生长，含半乳糖的培养基上极少生长。将ACMA006菌株接种于高氏1号培养基上，在不同的温度下观察其生长状态，发现其在9℃以下和39℃以上不能生长，该菌为好氧菌，最适生长温度28℃。
表5菌株ACMA006的生理生化特征
  特征   结果   碳源利用   结果
  革兰氏染色   +   葡萄糖   +
  淀粉水解   强   果糖   +
  硝酸盐还原   强   木糖   少量生长
  明胶液化   -   蔗糖   -
  纤维素生长   -   鼠李糖   -
  牛奶凝固   +   阿拉伯糖   +
  牛奶胨化   +   半乳糖   生长极少
  产H2S   -   甘露醇   +
  产黑色素   -   肌醇   -
  最适生长温度   28℃   山梨醇   -
  最低生长温度   9℃   甘油   +
  最高生长温度   39℃   琥珀酸钠   +
“+”表示该反应为阳性或能利用该糖，“-”表示该反应为阴性或不能利用该糖
(4)细胞壁化学组分分析
全细胞水解液化学组分分析以王平改进的薄层层析法以及高效液相色谱法进行，枝菌酸分析按刘志恒等的方法进行。
结果表明，菌株ACMA006不含特征性糖，糖型为C型，无枝菌酸。
(5)16SrDNA序列分析
方法：总DNA的提取按徐平等的方法。常规PCR扩增16SrDNA，PCR产物经上海英骏公司纯化后测序。
结果：菌株ACMA006的16SrDNA核苷酸序列为1507bp，将其与GeneBank等数据库中进行最大同源性比较，发现ACMA006的16SrDNA序列与链霉菌属16SrDNA序列同源性达到100％。
(6)菌株ACMA006菌种鉴别
根据菌株ACMA006的16SrDNA核苷酸序列分析结果表明，该菌与链霉菌属16SrDNA序列同源性达到100％；而且细胞壁化学组分分析表明，该菌株不含特征性糖，糖型为C型，无枝菌酸，这些都表明该菌应属于链霉菌属。进一步观察分析了该菌形态特征、培养特征、生理生化特性、细胞壁化学组分等，发现ACMA006有很多特点类似于链霉菌属的淤泥链霉菌(Streptomyces limosus)，但又不完全一样(表4～7)；而且，菌株ACMA006和淤泥链霉菌的菌丝都能形成横隔，断裂成球形，类似于诺卡氏菌属。因而，从传统分类来看菌株ACMA006应属于淤泥链霉菌的亚种。但16SrDNA序列分析结果表明，菌株ACMA006的16SrDNA核苷酸序列含有1507bp，和淤泥链霉菌16SrDNA核苷酸序列相差60bp，但差异小于5％(序列同源性为95.59％)。根据《链霉菌鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》以及《放线菌的分类学》等所阐述的原理，我们认为菌株ACMA006是链霉菌属的一个新种，将其命名为黄色淤泥链霉菌(Streptomyces flavolimosus)。
作为判断依据的主要参考：
[1]R.E.布坎南，N.E.吉本斯，《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)，北京：科学出版社，1984.
[2]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.《链霉菌鉴定手册》.北京：科学出版社，1975.
[3]徐丽华，李文均，刘志恒等.《放线菌系统学一原理、方法和实践》.北京：科学出版社，2007.
表6淤泥链霉菌的培养特征
  基丝   气丝   可溶性色素
  淀粉琼脂   褐黄   灰白   浅黄(淀粉硝酸盐琼脂)
  葡萄糖天门冬素琼脂   柠檬黄后变黑，反面黄   白，后烬灰   柠檬黄
  蔗糖察氏琼脂   无色变深黄   无   柠檬黄(甘油察氏琼脂)
表7淤泥链霉菌的生理生化特征
    特征     结果     碳源利用     结果
    明胶液化     全部液化(+)     葡萄糖     +
    纤维素生长     不生长     木糖     +
    淀粉水解     强     阿拉伯糖     +
    黑色素     -     鼠李糖     -
    果糖     +
    半乳糖
    棉子糖     -
    甘露醇     +
    肌醇     -
    蔗糖     -
实施例5：ACMA006菌株发酵液的制备
试验表明该菌为好氧菌，最适生长温度28℃。pH值为6～11范围内都能较好生长，最适生长pH为8～10。放线菌ACMA006在中等盐浓度环境中能很好生长，最适生长所需NaCl浓度范围在3％～11％之间，盐浓度大于15％时完全不能生长。
菌种保藏培养基和种子培养基为高氏1号培养基，发酵培养基为2216E培养基。其配方如下：
(1)高氏1号培养基(pH7.2～7.4)
可溶性淀粉20g                      KNO3       1g
NaCl               0.5g            K2HPO4     0.5g
FeSO4              0.01g           MgSO4      0.5g
琼脂               20g             陈海水     1000ml
重铬酸钾           0.1g·1000ml-1
(2)2216E培养基(pH 8.0)
蛋白胨             5g              酵母膏     1g
琼脂               20g             陈海水     1000ml
挑取活化的ACMA006单菌落接种到高氏1号斜面培养基中，28℃培养6天后，加入灭菌蒸馏水，刮取培养基表面，用玻璃珠打匀，接种到装有灭好菌的种子培养液的三角瓶中，28℃，140r/min振荡培养6天；接种5％的种子液于发酵培养基中，28℃，140r/min振荡培养6天，然后将发酵液连同菌丝体超声破碎，4℃下10000r/min离心10min，小心吸出上清，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管中，-20℃保存，用时以RPMI1640培养液适当稀释。
实施例6：DNA ladder琼脂糖电泳分析ACMA006菌株发酵液诱导细胞凋亡试验
方法：收集经菌株发酵液作用的肝癌细胞HepG2细胞，PBS洗涤3次，加入细胞裂解液，50℃保温3h-5h，加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，将上清移至新的eppendorf管中，加入等体积氯仿/异戊醇抽提，将上清移至新的eppendorf管中，加入0.1倍体积3m0l/L的NaAc溶液和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜，12000r/min离心10min，弃去上清，70％乙醇洗涤2-3次，加入TE缓冲液37℃水浴1h溶解DNA沉淀，2％琼脂糖凝胶50v电泳2h后拍照。
结果：细胞在凋亡过程中会发生染色质的断裂，细胞核DNA会被降解成180bp-200bp或其整倍数的片段，琼脂糖电泳会出现典型的DNA梯形条带(DNAladder)这被作为判断有无发生凋亡的客观指标之一。肝癌细胞HepG2经ACMA006菌株发酵液作用后，出现DNA ladder(图8)，表明该菌株发酵液中含有使肿瘤细胞凋亡的活性物质。
实施例7：荧光染色法观察ACMA006菌株发酵液诱导细胞凋亡试验
方法：将HepG2细胞传代培养24h后，加入ACMA006菌株发酵液，继续培养24h，加入Hoechst33258，使终浓度达到5μg·ml-1，37℃染色90min，荧光显微镜下观察。
结果：肝癌细胞HepG2经ACMA006菌株发酵液作用后，在荧光显微镜下观察，细胞核内可见浓染致密的颗粒或块状绿色荧光，荧光亮度明显增强，部分细胞的核收缩、碎裂，形成凋亡小体(图9)。正常细胞的细胞核呈均匀弥散荧光，核的大小、形态一致(图10)。表明ACMA006菌株发酵液能诱导肿瘤细胞凋亡。
序列表
<110>东南大学
<120>一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌及其培养方法
<160>1
<210>1
<211>1057
<212>DNA
<222>(1)...(1057)
<400>1
ATCCTGGCTC AGGACGAACG CTGGCGGCGT GCTTAACACA TGCAAGTCGA ACGATGAAGC
CTTTCGGGGT GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTTCACTC
TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATAACA CTCTGTCCCG CATGGGACGG
GGTTAAAAGC TCCGGCGGTG AAGGATGAGC CCGCGGCCTA TCAGCTTGTT GGTGGGGTAA
TGGCCTACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA CACTGGGACT
GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGAAA
GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC CTCTTTCAGC
AGGGAAGAAG CGAAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCGC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA
GCCGCGGTAA TACGTAGGGC GCAAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA
GGCGGCTTGT CACGTCGGAT GTGAAAGCCC GGGGCTTAAC CCCGGGTCTG CATTCGATAC
GGGCTAGCTA GAGTGTGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG AAATGCGCAG
ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG CCATTACTGA CGCTGAGGAG
CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGTTGGG
AACTAGGTGT TGGCGACATT CCACGTCGTC GGTGCCGCAG CTAACGCATT AAGTTCCCCG
CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCA
GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT TACCAAGGCT TGACATATAC
CGGAAAGCAT CAGAGATGGT GCCCCCCTTG TGGTCGGTAT ACAGGTGGTG CATGGCTGTC
GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGTTCTGT
GTTGCCAGCA TGCCCTTCGG GGTGATGGGG ACTCACAGGA GACTGCCGGG GTCAACTCGG
AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT GCCCCTTATG TCTTGGGCTG CACACGTGCT
ACAATGGCCG GTACAATGAG CTGCGATGCC GCGAGGCGGA GCGAATCTCA AAAAGCCGGT
CTCAGTTCGG ATTGGGGTCT GCAACTCGAC CCCATGAAGT CGGAGTTGCT AGTAATCGCA
GATCAGCATT GCTGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACGTCAC
GAAAGTCGGT AACACCCGAA GCCGGTGGCC CAACCCCTTG TGGGAGGGAG CTGTCGAAGG
TGGGACTGGC GATTGGGACG AAGTCGTAAC AAGGTAGCCG TACCGGAAGG TGCGGCTGGA
TCACCTC

Claims (3)

1.一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌，其特征在于命名为黄色淤泥链霉菌(Streptomyces flavolimosus：S.Flavolimosus)，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2007年4月27日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2027。
2.一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌的发酵培养方法，其特征在于生长环境中的pH值为6～11，培养基盐浓度环境中所需NaCl质量浓度范围为3％～11％，具体操作步骤为：
a.挑取活化的ACMA006单菌落接种到高氏1号斜面培养基中，28℃培养6天；
b.向斜面培养基中加入灭菌蒸馏水，刮取培养基表面，接种到装有灭好菌的种子培养液中，28℃，140r/min振荡培养6天，得种子液；
c.将上步所得种子液按发酵培养基质量5％接种于发酵培养基中，28℃，140r/min振荡培养6天，得海洋链霉菌发酵液。
3.如权力要求2所述的一种具有抗肿瘤活性海洋链霉菌的培养方法，其特征在于所述最佳pH值为8～10。
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