CN103333816A - 海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于发酵工程领域中一种筛选可利用海水进行发酵生物表面活性剂菌种的筛选方法。首先将海水、土样等样品按5％的量添加至含盐且浓度逐渐提高(1％、2％、3％和3.5％)的烃降解培养基中，在30℃、180rmp转速的恒温摇床上进行富集培养，每次3-5天。富集后的菌液稀释到一定程度后在含NaCl3.5％的血平板上涂布培养，30℃培养1-3d，取血平板上透明圈边缘清晰而大的菌落，接种于肉胨斜面30℃培养1-2d后，4℃保存备用。各菌株液体肉胨培养基(营养肉汤培养基)培养后，按5％的接种量接入含NaCl3.5％或海水配制的产表面活性剂培养基中，30℃培养3d后评价产表面活性剂的能力，即得可利用海水发酵产表面活性剂菌株，技术路线如附图所示。

Description

海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选方法
技术领域
本发明专利涉及一种筛选可利用海水进行发酵生物表面活性剂菌种的筛选方法，属发酵工程领域。 
背景技术
生物表面活性剂是由微生物在一定条件下产生的同时具有亲水性和疏水性两种结构的代谢产物，同一般化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂除具有显著降低表面张力、较低的临界胶束浓度，对温度、pH和盐度不敏感外，还具有专一性强，低毒性、可生物降解、环境友好、可利用廉价农副产品生物发酵生产等优点，某些生物表面活性剂还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用及生理活性。生物表面活性剂以其特殊的优势已在石油、食品、化妆品、药学和环境等领域获得广泛的应用。 
沿海滩涂土壤盐渍化，淡水缺乏，水质不佳，如果兴办发酵企业，水资源成本将是不小的成本。而沿海地区海水资源丰富。因此由本地区的相关生境采集样本，筛选可用于海水发酵的产表面活性剂菌株，是解决问题的关键。嗜盐或耐盐的产表面活性剂微生物，除利用海水发酵生产表面活性剂外，也可直接用于疏水性污染污染物的修复。 
海水的平均盐度为3.5％。目前海水发酵型产表面活性剂菌株的相关研究报道很少。本技术将为沿海地区相关无公害高端生物化工产品的生产提供新的选择，同时对今后修复海上石油污染也将发挥一定作用。 
本发明的目的是提供一种分离可利用海水、以废弃食用油脂或葡萄糖等碳源直接发酵的产表面活性剂的菌株的方法，其具体步骤如下： 
(1)采样 
主要采集以下样品：近海海水；沿海滩涂植物根际土壤；盐场卤水；盐场土样。采集后立刻带回保存于4℃中。 
(2)富集培养 
取土样和水样接种于盐度逐渐升高的产表活培养基中，即由1％、2％、3％升至3.5％，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上振荡培养，每次3-5天时间，培养基明显乳化时按10％的量接种下一盐度的产表活培养基。直到含盐3.5％的培养基培养完成，驯化结束。 
产表面活性剂培养基成份为：NaNO32.5g，K2HPO44.0g，KH2P044.0g，CaCl2·2H2O0.1g，MgSO40.2g，KCl1.0g，酵母粉1.0g，炸货油30mL或可溶性碳源30g，NaCl10-35g(即浓度为1％-3.5％)，去离子水1000mL，pH值最后调整为6.5，分装摇瓶后加入碳源，121℃灭菌20min后备用。 
(3)高盐血平板分离 
取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生。平板采用肉胨培养基中加入5％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠35，琼脂15，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5％(V/V)的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板。 
(4)菌种保存、编号 
挑取菌落特征有代表性、产明显溶血圈的菌落(附图1)30个以上接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用。 
(5)海水发酵验证 
各菌株用肉胨培养基培养种子后，按5％的接种量接产表活培养基(含3.5％的NaCl)和海水产表活培养基进行摇瓶发酵，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上培养3d后(附图2)测定表面张力和发酵液排油圈大小。测定表面张力采用表面张力仪，排油圈测定大小的方法是：在90mm培养皿小盖中，加入20mL去离子水，滴加100μL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入10μL的发酵液。如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入。取排油圈较大且表面张力明显降低的菌株3-5株。海水产表活培养基的配制方法为：酵母粉1g，炸货油30mL(或可溶性碳源30g)，中速滤纸过滤后的天然海水1000mL，自然pH值，分装入150mL摇瓶(装液量30mL)，121℃灭菌后备用。 
取获得的菌株进行生理生化分析和分子鉴定，以获得菌株的属种分类信息，便于下一步的改良和发酵工艺优化。 
海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选路线见附图3。 
由于采用上述技术方案，本发明所具有的优点和有益效果是：能够较快地分离到有效利用海水进行发酵产生生物表面活性剂的菌株，方法简便有效。 
附图说明 
附图1是富集液在高盐(3.5％)血琼脂平板上的表现，附图2是入选菌株105-1在海水发酵培养基中的表现，附图3是海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选路线。 
具体实施方式
将海水、土样等样品按5％的量添加至含盐且浓度逐渐提高(1％、2％、3％和3.5％)的烃降解培养基中，在30℃、180rmp转速的恒温摇床上进行富集培养，每次3-5天。富集后的菌液稀释到一定程度后在含3.5％NaCl的血平板上涂 布培养，30℃培养1-3d，取血平板上透明圈边缘清晰而大的的菌落，接种于肉胨斜面30℃培养1-2d后，4℃保存备用。各菌株液体肉胨培养基(营养肉汤培养基)培养后，按5％的接种量接入含3.5％NaCl或海水配制的产表面活性剂培养基中，30℃培养3天后评价产表面活性剂的能力，通过综合评价，即得可利用海水发酵产表面活性剂菌株。通过这种方法得到的微生物多是细菌。 
通过以上方法，由江苏射阳港、陈家港和大丰港等沿海地区采集海水、土样等，通过富集、分离和筛选，筛选出105-1、S2、J3-1和V23-1等菌株，其中105-1利用含3.5％NaCl的高盐产表活培养基摇瓶发酵3d，发酵液稀释100倍表面张力达47mN/m左右，稀释10倍在柴油中的排油圈达2.6cm左右，发酵产物为鼠李糖脂，用硫酸-苯酚法测定的糖脂含量为11g/L；在添加酵母粉和炸货油的海水中(不加无机盐)摇瓶发酵3d，发酵液稀释100倍表面张力达46mN/m左右，稀释5倍在柴油中的排油圈达2.9cm左右，不加酵母粉只添加炸货油的海水中摇瓶发酵3d，发酵液稀释100倍表面张力达50mN/m左右，发酵液原液在柴油中的排油圈达2.8cm左右，可见该菌株不论在含3.5％NaCl的高盐发酵培养基中还是在海水发酵培养基中，均有较好的表现。 

Claims (4)

1.一种海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：
(1)采样
主要采集以下样品：近海海水；沿海滩涂植物根际土壤；盐场卤水；盐场土样。采集后立刻带回保存于4℃中。
(2)富集培养
取土样和水样接种于盐度逐渐升高的产表活培养基中，即由1％、2％、3％升至3.5％，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上振荡培养，每次3-5天时间，培养基明显乳化时按10％的量接种下一盐度的产表活培养基。直到含盐3.5％的培养基培养完成，驯化结束。
(3)高盐血平板分离
取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生。
(4)菌种保存、编号
挑取菌落特征有代表性、产明显溶血圈的菌落30个以上接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用。
(5)海水发酵验证
各菌株用肉胨培养基培养种子后，按5％的接种量接产表活培养基(含3.5％的NaCl)和海水产表活培养基进行摇瓶发酵，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上培养3d后测定表面张力和发酵液排油圈大小。测定表面张力采用表面张力仪，排油圈测定大小的方法是：在90mm培养皿小盖中，加入20mL去离子水，滴加100μL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入10μL的发酵液。如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入。取排油圈较大且表面张力明显降低的菌株3-5株，之后进行生理生化分析和分子鉴定，以获得菌株的属种分类信息，便于下一步的改良和发酵工艺优化。
2.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：产表面活性剂培养基成份为：NaNO3 2.5g，K2HPO4 4.0g，KH2PO4 4.0g，CaCl2·2H2O 0.1g，MgSO4 0.2g，KCl 1.0g，酵母粉1.0g，炸货油30mL或可溶性碳源30g，NaCl 10-35g(即浓度为1％-3.5％)，去离子水1000mL，pH值最后调整为6.5，分装摇瓶后加入碳源，121℃灭菌后备用。
3.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：
海水产表活培养基的配制方法为：酵母粉1g，炸货油30mL(或可溶性固体碳源30g)，中速滤纸过滤后的天然海水1000mL，自然pH值，分装入150mL摇瓶(装液量30mL)，121℃灭菌后备用。
4.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：
血平板采用肉胨培养基中加入5％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠35g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。配制血平板时要加1.5％的琼脂粉，灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5％的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板。
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