CN113355264B - 一株产甘油的嗜高温菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株嗜高温菌株，对进行菌株鉴定、形态学观察、生理生化鉴定、生长曲线测定以及单因素轮换法对其发酵条件进行初步优化，鉴定该菌株为嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus)；生长曲线显示，在0～6h为生长延迟期，6～21h为对数生长期，此后进入平台期，24h后进入衰亡期；通过生理生化鉴定，确定其有较优甘油生产功能，优化后其甘油产量在6％左右。

Description

一株产甘油的嗜高温菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产甘油的嗜高温菌及其应用。

背景技术

嗜高温菌分裂周期短、代谢速率快、生长率高、适应性强，被广泛应用于环境保护、能源利用、石油开采、液体燃料生产、生物转化及抗生素生产等领域。利用高温菌进行工业发酵,可以缩短生产周期、避免微生物感染，在食品等行业中也具有广泛应用前景。

甘油是丙三醇的俗称，是含有三个碳原子、三个羟基的醇类化合物,无色,具有甜味的黏稠液体,不挥发,易溶于水,吸收性很强,可作为润滑剂。无论是在临床上用于润滑肠道、与镇咳祛痰药配制成止咳糖浆，还是在生活中用于润滑皮肤、制造化妆品，甘油都在其中占据了重要的位置。在食品工业中甘油常用作甜味剂、烟草剂的吸湿剂和溶剂等。

现下甘油的主要生产方式还是化学合成法或使用天然油脂进行皂化反应，发酵法虽已有应用，但多为酵母等真菌发酵。申请人通过筛选获得一株嗜高温细菌，对其进行形态学观察及生理生化鉴定等，确定了菌株的分类地位并鉴定其产甘油，通过对菌株发酵条件进行优化，提高了菌株的甘油产量，为细菌发酵生产甘油这一途径提供了新的思路。

发明内容

本发明提供了一种产甘油的嗜高温菌，还提供了该菌株在生产甘油中的应用。

一方面，本发明提供了一种产甘油的嗜高温菌株，所述菌株为嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus)Y4，保藏编号为CGMCC No.22049，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年3月22号，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355。

另一方面，本发明还提供了上述菌株在生产甘油中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述菌株的发酵方法，所述方法包括利用培养基对所述菌株进行发酵的步骤。

在一个实施方式中，所述培养基的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉中的一种或任意几种，优选，葡萄糖；更优选的，所述碳源的浓度为2-10％(质量比)，优选，5％。

在一个实施方式中，所述发酵的时间为10-96h，优选，15-96h，更优选，24h-96h。

在一个实施方式中，所述发酵的温度为45-60℃，优选，50℃。

在一个实施方式中，所述发酵的盐度为10‰～20‰，优选，15‰；优选的，所述盐为NaCl。

在一个实施方式中，所述发酵的pH为6-8，优选，7。

在一个实施方式中，所述菌株的接种量为6％～18％(体积比)，优选，6％-10％。

另一方面，本发明还提供了一种生产甘油的方法，所述方法包括利用上述菌株发酵生产甘油的步骤。

进一步的，所述方法还包括从发酵产物中分离甘油的步骤。

本发明在黑松的根系土壤中筛选获得了一株嗜高温菌，其可产甘油。通过对其发酵条件进行优化，研究得菌株最佳生长条件：碳源为葡萄糖、50℃、盐度为15‰、pH＝7、接种量为6％等，同时测得其在最佳发酵条件下甘油产量为6.003％。为进一步提高甘油产量，可对该株细菌进行驯化，获得更高的甘油产量。

附图说明

附图中：

图1.菌株形态观察结果。

图2.菌株透射电镜照片。

图3.菌株系统发育树。

图4.菌株生长曲线。

图5.不同碳源对菌株生长的影响。

图6.不同温度对菌株生长的影响。

图7.不同盐度对菌株生长的影响。

图8.不同pH对菌株生长的影响。

图9.不同接种量对菌株生长的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1.菌种分离纯化、筛选及鉴定

将10g黑松的根系土壤装入盛有200mL LB液体培养基的500mL锥形瓶，于55℃培养箱震荡培养48h，得到菌株富集液。取菌悬液进行10^-1～10^-7梯度稀释，分别将100μL稀释液用涂布棒均匀涂抹于LB固体培养基平板，55℃下恒温培养24h，后多次进行划线纯化，筛选得到目标菌株-嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus)，菌种名称为Y4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22049，保藏日期为2021年3月22号，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355。

在自然光下观察菌落形态(大小、形状、颜色、边缘和透明度等)；取复壮后菌体进行革兰氏染色并镜检，观察菌落颜色和形态；同时，将菌体用戊二醛等溶液处理，进行透射电镜观察。依照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化测定。

如图1-2所示，菌落为圆形、乳白色，边缘透明不规则，表面光滑、湿润；通过革兰氏染色和光学显微镜观察发现，菌株被染为紫色，属革兰氏阳性菌，短小杆状，可见明显芽孢；透射电镜显示，菌株为长杆状，有鞭毛，胞外产物较多。

对该菌株采用API 50CH试剂盒进行生理生化鉴定，结果如表1所示：

表1生理生化鉴定结果

由表1可知，该菌株的发酵产物中有甘油产生且无影响甘油含量测定的糖类，可使用高碘酸-氧化法进行甘油测定。

对菌株DNA进行提取并使用27F通用引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳验证后，送至华大基因科技公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行Blast相似性比对分析，使用MEGA软件中的NJ法构建系统发育树。菌株经PCR扩增后，得到1500bp的基因序列片段，将测序后获得的基因序列在数据库进行序列对比，该菌株序列与Aneurinibacillusthermoaerophilus的16SrDNA序列同源性高达99.87％，同时结合菌株的形态观察及生理生化鉴定结果，鉴定菌株为Aneurinibacillus thermoaerophilus，并编号为Aneurinibacillus thermoaerophilus Y4。同时构建系统发育树，如图3所示，显示菌株与Aneurinibacillus thermoaerophilus亲缘关系最近。

实施例2.菌株的生长曲线和发酵条件

取2ml菌株的种子液接种到100ml发酵培养基中，于55℃恒温培养箱震荡培养，采用紫外分光光度法每隔3h进行OD_600nm测定，绘制24h内以培养时间为横坐标、平均OD_600nm为纵坐标的生长曲线。

培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水溶解至1000mL，自然pH,121℃灭菌20min。

采用单因素轮换法依次考察不同碳源、温度、盐度、pH、接种量对菌株生长的影响，以获得最佳发酵条件。使用酶标仪检测菌株在不同生长条件下的OD_600nm，每组设置3个重复。

在摇床振荡培养的条件下，用紫外分光光度计测得菌株培养0、3、6、9、12、15、18、21、24h的OD600nm，每个时间点设置3组平行。

如图4所示，由该菌的生长曲线可知，菌株在0～6h为生长延迟期，6～21h为对数生长期，此后进入平台期，24h后进入衰亡期。

2.1不同碳源对发酵的影响

取菌株种子液2ml分别接种在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉为碳源的发酵培养基上，其他条件相同且适宜，50℃，120r/min振荡培养24h后使用酶标仪测定其OD值，以空白培养基作对照，比较不同碳源对发酵的影响，每个碳源设3个重复。

如图5所示，菌株在生长过程中，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉均被利用，但是葡萄糖更利于菌株的生长，获得最大菌株生长密度。依据实验结果可以推测葡萄糖是菌株生长的最佳碳源。

2.2不同温度对菌株生长的影响

将2ml种子液接种至发酵培养基中，控制发酵初始盐度、pH及其他发酵条件一致且适宜，改变发酵温度，分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温度下进行试验，以空白培养基作对照，探究最适发酵温度；每个温度设3个重复。

如图6所示，当温度在45～60℃范围内，菌株均能生长，可说明菌株有较强的温度适应能力，但是温度在40℃时不利于菌株的生长。50℃时获得菌株生长最大密度，可以推测温度为50℃是菌株最佳生长温度且低于40℃不利于菌株的生长。

2.3不同盐度对菌株生长的影响

将2ml种子液接种至发酵培养基中，控制发酵温度、pH及其他发酵条件一致且适宜，改变发酵时菌株所处环境的盐浓度(NaCl)，分别按照2.5‰、5‰、10‰、15‰、20‰盐浓度进行试验，以空白培养基作对照，探究最适发酵盐浓度。每个盐浓度设3个重复。

如图7所示，当盐度为5‰～15‰时，随着盐度的升高，菌株密度不断增大；但是当盐度高于15‰时，随着盐度的升高,菌株的发酵减弱，可能是因为高浓度的盐浓度影响降解细菌细胞的渗透压，严重者可导致菌体裂解死亡。当盐浓度在10‰～20‰时，菌株发酵均良好，可推测菌剂发酵的最佳的盐浓度为15‰.

2.4不同pH对菌株生长的影响

在控制温度、盐度及其他发酵条件一致且适宜的条件下，将2ml种子液分别接种在pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培养基上，50℃，120r/min振荡培养24h后测定其降解效能，以空白培养基对照，比较不同pH值对发酵的影响；每个pH设3个重复。

如图8所示，当pH值为5或者9时，菌株几乎不发酵；而当pH值在6～8时，菌株发酵随着pH值趋向中性而增强，可见菌株的发酵与环境pH有很大的相关性，可推测趋近中性的环境更利于菌株发酵且pH值为7时是菌株的最佳发酵条件。

2.5不同接种量对菌株生长的影响

在控制温度、盐度及其他发酵条件一致且适宜的条件下，改变发酵时种子液的接种量，分别按照2％、6％、10％、14％、18％的接种量进行试验，以空白培养基作对照，探究最适接种量。每个接种量设3个重复。

如图9所示，接种量在2％～18％范围内，菌株均能生长，可说明菌株有较强的耐盐能力。但是接种量为2％时，不利于菌株的发酵；接种量在6％～18％时，随着接种量的变多菌株密度变化不大。可以推测接种量为6％是菌株最佳接种量。

实施例3.菌株在最佳发酵条件下的甘油产量

配制0.023mol/L的高碘酸钠溶液、20％碘化钾溶液、0.05mol/L的硫代硫酸钠溶液、20％盐酸溶液和淀粉指示剂，利用高碘酸-氧化法对菌株在最佳生长条件下的甘油产量进行测定。

将菌株在最佳发酵条件下：pH7.0、2％葡萄糖、15‰盐度、6％接种量，温度50℃，培养24h后，采用高碘酸氧化还原法测定甘油产量。

取菌株发酵液10ml于小烧杯中加少量蒸馏水溶解，转移至100ml容量瓶中定容。移取上述溶液10ml于碘量瓶并加入20ml高碘酸钠溶液，混合均匀后于黑暗中避光静置40min，再加入20％碘化钾溶液和20％盐酸溶液各15ml，用硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时，加入2～3ml淀粉指示剂，继续滴定溶液至蓝色消失且30s内不再恢复蓝色，同时做试样空白对照。

式中：

w——样品中甘油的含量，％；

V1——试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；

V2——空白试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；

C——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；

M——甘油相对分子质量；

实验测得，该菌株发酵液中甘油产量为6.003％。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种产甘油的嗜高温菌株，所述菌株为嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus)Y4，保藏编号为CGMCC No.22049，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的菌株在生产甘油中的应用。

3.一种对权利要求1所述菌株进行发酵的方法，所述方法包括利用培养基对所述菌株进行发酵的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉中的一种或任意几种。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基的碳源为葡萄糖。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为10-96h。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为45-60℃。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的盐度为10‰～20‰。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的pH为6-8。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌株的接种量为6％～18％。

11.一种生产甘油的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述菌株发酵生产甘油的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从发酵产物中分离甘油的步骤。

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