CN112795492A - 一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和应用 - Google Patents

一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和应用，属于微生物技术领域。所述蝉棒束孢菌是一株产胞外多糖的高产菌株，产生的胞外多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力和Fe3+还原能力，显示出良好的抗氧化活性；同时，在25～200μg/mL浓度范围内可激活小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生NO，显示出良好的免疫激活活性；而且还具有良好的流变特性和悬浮性能、较好的吸湿和保湿性能，可以作为抗氧化和保湿原料、增稠剂和悬浮稳定剂等应用到食品、化妆品中。

Description

一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和应用，属于微生物技术领域。
背景技术
蝉花(Cordyceps Cicadae)又名金蝉花，是蝉花真菌与宿主蝉幼虫形成的无性子实体(孢梗束)，是一种珍贵的药食两用真菌。在我国、日本、韩国等亚洲国家有着悠久的应用历史。在《本草纲目》、《中华药物大全》和《中华药海》中，都有关于蝉花的药性与应用方面的记载。近年来对蝉花的药理学研究证明，蝉花具有免疫调节、抗肿瘤、调节脂类代谢、改善肾功能、抗氧化、镇静催眠、解热镇痛、促进造血、抗疲劳、抗衰老、降压、降血糖等功效。蝉花和冬虫夏草的功效相近，而价格却比冬虫夏草低很多，在民间常被用作冬虫夏草的代用品(王琪,刘作易.药用真菌蝉花的研究进展[J].中草药,2004(04):469-471)。卫健委发布2020年第9号公告，批准蝉花子实体为新食品原料，蝉花将在食品领域有着广泛的应用前景。
蝉棒束孢(Isaria cicadae)，是蝉花的分生孢子阶段即无性型时期，是形成蝉花虫草的真菌，含有多糖、核苷类物质、麦角固醇、多球壳菌素、虫草酸、透明质酸及酶等生物活性物质，具有许多生物活性功能如免疫调节、抗肿瘤、调节神经系统、改善肾功能、抗菌、抗病毒等。据文献报道，其中某些生物活性物质含量等于或超过冬虫夏草，蝉棒束孢具有很高的食用、营养和药用价值，是最具开发价值的珍贵虫生真菌之一(李增智,陈祝安,陈以平主编.国宝虫草金蝉花[M].第一版,合肥:合肥工业大学出版社,2016.3)。
由于野生蝉花资源少，加上过度的采挖及生态条件变化，其产量远不能满足市场的需求。同时，野生蝉花又受到自然生长条件的限制，产品质量存在差异，影响功效的发挥，这些都制约着蝉花产业发展。筛选获得优良的蝉花菌种是开发蝉花及其活性成分行之有效的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：筛选并提供一株优良的蝉花菌种。
为了解决上述问题，本发明提供了一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌，拉丁文为Isaria cicadae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.18807，保藏日期：2019年11月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。本发明提供的蝉棒束孢菌(Isaria cicadae，记为蝉棒束孢菌C1)是一株生长快、胞外多糖产量高的菌株，该胞外多糖分子量分布较窄，均一性良好，表现出良好的抗氧化能力，具有良好的免疫活性和保湿性、表观黏度和悬浮性能，可作为抗氧化和保湿原料、增稠剂和悬浮稳定剂等应用到食品、化妆品中。
本发明还提供了利用上述蝉棒束孢菌制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述胞外多糖由所述的蝉棒束孢菌接种到发酵培养基后经过发酵得到。
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40～60g/L，蛋白胨2～4g/L，酵母粉2～4g/L，KH2PO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O 0.2～1.5g/L；所述发酵培养基的pH值为6～7。
优选地，所述蝉棒束孢菌以种子液的形式接种到发酵培养基中，所述种子液的接种量为5～10vol％。
优选地，所述发酵的培养条件为：发酵温度20～30℃，转速120～200r/min，发酵时间72～100h。
优选地，所述发酵所得的发酵产物纯化后，得到所述胞外多糖。
更优选地，所述纯化的方法为醇沉淀纯化。
本发明还提供了一种上述方法制备的胞外多糖。
本发明还提供了上述蝉棒束孢菌或上述胞外多糖在食品中的应用。
本发明还提供了上述蝉棒束孢菌或权利要求8所述的胞外多糖在化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的蝉棒束孢菌C1菌株生长快、发酵周期短，胞外多糖产量可达5g/L，产生的胞外多糖具有良好的抗氧化性、流变特性和悬浮稳定性，可以作为抗氧化和保湿原料、增稠剂和悬浮稳定剂等应用到食品、化妆品领域中。实施例的结果表明，本发明提供的蝉棒束孢菌C1产生的胞外粗多糖在0.2～2mg/mL的浓度范围内，具有很强的清除DPPH自由基的能力和Fe3+还原能力，该胞外多糖清除DPPH自由基和还原力的IC50值分别为0.8mg/mL和1.0mg/mL，表现出良好的抗氧化能力；该胞外多糖在相对湿度为81％的环境下，吸湿率可达40％～45％，具备良好的吸湿性能；在相对湿度为43％下，保湿率可达85～98％，介于甘油和透明质酸之间，具有较好的保湿性能。
附图说明
图1为蝉棒束孢菌C1在PDA固体平板的菌落形态；
图2为蝉棒束孢菌C1在PDA固体平板的菌丝体和孢子形态；
图3为蝉棒束孢菌C1所产多糖的紫外光谱图；
图4为蝉棒束孢菌C1所产多糖的红外光谱图；
图5为蝉棒束孢菌C1所产多糖分子量分布图；
图6为蝉棒束孢菌C1所产多糖的单糖离子色谱图；
图7为蝉棒束孢菌C1所产多糖对DPPH自由基的清除率；
图8为蝉棒束孢菌C1所产多糖的还原力；
图9为CEPS多糖刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响；
图10为蝉棒束孢菌C1所产多糖在相对湿度为43％的保湿性图；
图11为蝉棒束孢菌C1所产多糖在相对湿度为81％的保湿性图；
图12为浓度对蝉棒束孢菌C1所产多糖的表观黏度的影响；
图13为CEPS多糖对活性炭悬浮0h的影响；
图14为CEPS多糖对活性炭悬浮4h的影响；
图15为CEPS多糖对活性炭悬浮8h的影响。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
本发明提供了一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌，拉丁文为Isaria cicadae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.18807，保藏日期：2019年11月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。
本发明的蝉棒束孢菌C1是从浙江天目山的野生蝉花中分离得到。本发明提供的蝉棒束孢菌C1在平板上最初形成白色絮状菌丝，呈放射状生长，随着生长时间延长，菌丝体逐渐呈白色绒毛状，气生菌丝发达，菌落呈白色圆形隆起，最后中间颜色加深逐渐变为加深，背面无色，培养后期产生浅黄色粉状的孢子。本发明蝉棒束孢菌C1菌株的ITS核苷酸序列为596bp，核酸序列见SEQ ID No.3；经Blast分析，本发明菌株同源性最高的菌株是Isariacicadae(蝉棒束孢)，同源性为99.98％，与Isaria cicadae属于同一个种，将其命名为Isaria cicadae C1。本发明提供的蝉棒束孢菌C1菌株生长快，发酵周期短，在优化培养基中培养，多糖产量高达5g/L，是一株产胞外多糖的高产菌株。本发明提供的蝉棒束孢菌C1产生的胞外多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力和Fe3+还原能力，显示出良好的抗氧化活性；同时，在25～200μg/mL浓度范围内可激活小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生NO，显示出良好的免疫激活活性；而且还具有良好的流变特性和悬浮性能、较好的吸湿和保湿性能，可以作为抗氧化和保湿原料、增稠剂和悬浮稳定剂等应用到食品、化妆品领域中。
本发明提供了利用上述技术方案中所述的蝉棒束孢菌C1制备胞外多糖的方法，所述胞外多糖由所述的蝉棒束孢菌C1接种到发酵培养基后经过发酵得到。在本发明中，所述发酵培养基优选包括如下浓度的组分：葡萄糖40～60g/L，蛋白胨2～4g/L，酵母粉2～4g/L，KH2PO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O 0.2～1.5g/L；进一步优选为葡萄糖60g/L，蛋白胨4g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L；在本发明中，所述发酵培养基的pH为6～7，进一步优选为7。本发明特定的发酵培养基适合蝉棒束孢菌C1产胞外多糖，提高胞外多糖的产量。在本发明中，所述蝉棒束孢菌C1优选以种子液的形式接种到发酵培养基中。在本发明中，所述种子液的制备方法优选为在种子培养基中接种蝉棒束孢菌C1，在26℃、摇床转速150r/min的条件下培养2d。在本发明中，所述种子培养基包括以下浓度的组分：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH自然。得到种子液后，本发明将所述种子液接种到发酵培养基中。在本发明中，所述种子液的接种量优选为5％～10％，进一步优选为6％。在本发明中，所述发酵培养的条件优选为：发酵温度20～28℃，转速120～200r/min，发酵时间64～120h；进一步优选为发酵温度25～28℃，转速150～180r/min，发酵时间72～100h；更进一步优选为发酵温度28℃，转速160r/min，发酵时间96h。本发明优化的培养条件适合蝉棒束孢菌C1产胞外多糖，提高了胞外多糖的产量。发酵后，本发明还优选包括将发酵产物进行纯化，得到所述胞外多糖。在本发明中，所述纯化的方法优选包括醇沉淀纯化；所述醇沉淀的试剂优选为乙醇，所述乙醇的添加量优选占发酵液和乙醇总体积的20％～60％，进一步优选为30％～40％，更进一步优选为30％。
本发明提供了上述技术方案中所述的蝉棒束孢菌C1所产的胞外多糖，所述胞外多糖由上述技术方案中所述的方法得到。在本发明中，所述胞外多糖的单糖组成由葡萄糖和半乳糖醛酸组成，所述葡萄糖和半乳糖醛酸的质量比为98：2。在本发明中，所述胞外多糖的重均分子量Mw为1.675×106Da；所述胞外多糖的数均分子量Mn为1.561×106Da；所述胞外多糖的分散系数PD(Mw/Mn)为1.07。本发明提供的胞外多糖分子量分布较窄，均一性良好。本发明的胞外多糖经过纯化后，纯度可达90％以上。本发明提供的胞外多糖可激活小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生NO，在25～200μg/mL浓度范围内，随着多糖浓度的增加，NO的释放量逐渐增加，且呈现剂量效应，具有较好的免疫激活活性。另外，本发明提供的胞外多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力和Fe3+还原能力，显示出良好的抗氧化活性；而且还具有良好的流变特性和悬浮性能、较好的吸湿和保湿性能，可以作为抗氧化和保湿原料、增稠剂和悬浮稳定剂等应用到食品、化妆品领域中。
本发明提供了上述技术方案中所述的蝉棒束孢菌C1或上述技术方案中所述的胞外多糖在食品中的应用。本发明所述的蝉棒束孢菌C1发酵得到的胞外多糖具有良好的抗氧化性、悬浮稳定性，可以作为抗氧化、悬浮稳定剂等应用到食品领域中。同时该胞外多糖具有剪切变稀的流变特性，不仅可以为食物提供良好的口感，同时还可以在较低的能量下运行，减少机械运转过程中的能量损耗，为蝉花多糖在食品加工中的应用提供了理论基础。
本发明提供了上述技术方案中所述的蝉棒束孢菌C1或上述技术方案中所述的胞外多糖在化妆品领域中的应用。本发明提供的蝉棒束孢菌C1发酵得到的胞外多糖具有良好的抗氧化性、保湿性能和悬浮稳定性，可以作为抗氧化和保湿原料、悬浮稳定剂等应用到化妆品领域中。
实施例1
蝉棒束孢菌C1的筛选和鉴定
(1)蝉花菌株的分离
本发明的蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)C1是从浙江天目山的野生蝉花中分离纯化得到的。
具体的分离和纯化方法如下
挑选顶部有饱满淡黄色孢子粉的蝉花，用无菌接种针蘸取少量孢子粉，接种于添加终浓度为50～100mg/mL的氨苄青霉素的土豆固体平板，其中，土豆固体平板的组分如下：马铃薯200g/L，蔗糖50g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，维生素B1 0.1g/L和琼脂20g/L；该土豆固体平板的pH为6，121℃灭菌20min后待用。接种后，置于26℃～30℃恒温培养箱中倒置培养3～5d，待平板长出单菌落，进一步划线分离得到纯的菌株，保存于土豆斜面(同土豆固体平板配制)。
将初筛的菌株分别接种到基础发酵培养基，其中基础发酵培养基的组分如下：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L；pH自然，121℃灭菌20min后待用。接种后，进行发酵培养，发酵培养的条件为：发酵温度28℃，发酵时间4d，转速150r/min。发酵结束后，将发酵液在4℃，10000r/min离心除菌体、加入4倍体积的无水乙醇沉淀，离心收集沉淀，用去离子水溶解后，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，选取多糖含量高的菌株即为本发明蝉棒束孢菌C1。
结果发现，本发明蝉棒束孢菌C1在液体培养基中生长迅速，接种后1～2d即可观察到白色小球形菌丝体，液体培养基逐渐浑浊，随着发酵时间的延长，液体培养基逐渐呈黏糊状。发酵液经离心除菌体、乙醇沉淀、用去离子水溶解后，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，经计算每升发酵液胞外多糖含量可达1.22g/L。
(2)蝉棒束孢菌C1菌株的鉴定
a)菌落菌体形态观察
将蝉棒束孢菌C1接种于PDA固体平板，置于26℃～30℃培养箱中培养72～96h，观察菌丝体生长情况。蝉棒束孢菌C1在平板上最初形成白色絮状菌丝，呈放射状生长，随着生长时间延长，菌丝体逐渐呈白色绒毛状，气生菌丝发达，菌落呈白色圆形隆起，最后中间颜色加深逐渐变为加深，本面无色，培养后期产生浅黄色粉状的孢子，如图1所示。显微观察菌丝体和孢子的形态，可以看到菌丝管状，分隔，壁光滑，无色透明，培养后期，由于营养条件不佳，形成暗褐色的厚垣孢子，如图2所示。
该蝉棒束孢菌C1菌株在固体平板上生长快，4～5d长满平板，而一般情况下食用菌在固体平板上需要培养7d以上，甚至更长时间才能布满菌丝。该菌株在液体培养基中成长较快，接种后1～2d即可观察到生长出白色小球形颗粒，液体培养基逐渐浑浊且有白色的菌落带产生，培养3～4d，液体呈现黏糊状，说明该菌生长迅速。
b)ITS序列分析
挑取蝉棒束孢菌C1菌株在PDA固体平板上菌丝体，采用真菌基因组提取试剂盒(TIAN GEN公司)提取总DNA，按照Bioteke 2×powerTaq PCR MasterMix试剂盒说明，采用真菌核糖体基因间隔区通用ITS1和ITS4作为引物，进行PCR扩增，其中，ITS1的核酸序列如SEQ ID No.1所示，具体序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4核酸序列如SEQ ID No.2所示，具体序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。将PCR扩增产物采用1％琼脂糖切胶回收试剂盒(BioFlux)回收，纯化后送往上海美吉生物公司进行测序，在GenBank NCBI网站做Blast分析。
检测结果：本发明蝉棒束孢菌C1菌株的ITS核苷酸序列为596bp，核酸序列见SEQID No.3；经Blast分析，本发明菌株同源性最高的菌株是Isaria cicadae(蝉棒束孢)，同源性为99.98％。根据Goodfellow和O'Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及ITS的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当ITS的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可得本发明蝉棒束孢菌C1菌株与Isaria cicadae属于同一个种，将其命名为Isaria cicadae C1，该菌株已于2019年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18807。
实施例2
蝉棒束孢菌C1所产的胞外多糖的发酵制备方法
蝉棒束孢菌C1种子液制备：在种子培养基中接种蝉棒束孢菌C1，在26℃、摇床转速150r/min的条件下培养2d；其中，种子培养基由以下质量百分含量的组分组成：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，0.2％KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH自然。
将本发明蝉棒束孢菌C1种子液接种到发酵培养基进行发酵培养，其中发酵培养基由如下组分构成：葡萄糖60g/L，蛋白胨4g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，该发酵培养基的pH为7。蝉棒束孢菌C1以种子液的形式接种到发酵培养基中，蝉棒束孢菌C1的种子液的接种量(v/v)为6％。接种后进行发酵培养，发酵培养的条件为：转速为160r/min，温度28℃，装液量为70mL/250mL三角瓶，发酵培养96h，获得发酵液。
将发酵液经4℃，10000r/min离心20min除菌体，发酵上清液加30％(v/v)的无水乙醇，静置6h，离心收集沉淀，用相同质量分数的乙醇反复清洗多次后，冷冻干燥获得蝉棒束孢胞外多糖(文中简写为CEPS)，经称重计算，蝉棒束孢菌菌株C1在发酵培养基中胞外多糖的产量为5g/L。
不同来源的蝉棒束孢(或蝉拟青霉，早期分类中将蝉花真菌归类于蝉拟青霉，后来单独独立出来为蝉棒束孢菌，在此与前期做的蝉拟青霉的参考文献一起进行比较)菌株液体发酵所产胞外多糖的发酵条件和产量存在较大差异。Sharma等报道蝉棒束孢菌株在优化培养基中胞外多糖的产量可达0.648g/L(培养时间6d)(Sharma S K,Gautam N,Atri NS.Optimized extraction,composition,antioxidant and antimicrobial activitiesof exo and intracellular polysaccharides from submerged culture of Cordycepscicadae[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2015)；韦朝阳对实验保藏蝉拟青霉菌株所产胞外多糖的产量进行分析，胞外多糖产量为0.227g/L(培养时间5d)(韦朝阳.蝉拟青霉深层发酵及其胞内多糖的结构研究[D].浙江大学，2015)，王琪等对蝉拟青霉(Paecilomyses cicadae)0305-3菌株发酵产胞外多糖条件进行优化，多糖产量可达3.24g/L(培养时间7d)(王琪,刘作易.提高蝉拟青霉多糖产量的液体发酵条件研究[J].贵州农业科学,2010(06):98-100)。而张学秋对实验保藏蝉拟青霉菌株产胞外多糖的条件进行优化，最优条件下胞外多糖的最高产量为5.96g/L(培养时间5d)(张学秋.蝉拟青霉发酵产胞外多糖的研究[D]，江南大学，2018)；陈显群等对分离的蝉花真菌在土豆培养基中培养120h，胞外多糖的产量可达5.64g/L(陈显群,羊悦,杨胜利.蝉花液体发酵产胞外多糖培养基优化研究[J].食用菌,2015(1)，10-13)。由此可见，本发明中蝉棒束孢菌C1菌株在此优化培养基中产糖发酵周期短、胞外多糖产量较高，是一株潜在的产胞外多糖的菌株。
实施例3
不同碳源对蝉棒束孢菌C1胞外多糖产量的影响
在基础培养基的基础上(组成：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L；pH自然)，其他培养条件不变，调整发酵培养基的碳源种类，分别添加蔗糖、红薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉为碳源，添加量为20g/L，考察不同碳源对蝉棒束孢C1胞外多糖产量的影响。不同碳源下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表1。
表1碳源对蝉棒束孢菌C1胞外多糖产量的影响
Figure BDA0002958835790000091
由表1的结果可知，不同的碳源对蝉棒束孢产胞外多糖的含量影响很大，蝉棒束孢菌C1在葡萄糖、蔗糖和木薯淀粉为碳源，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量高，而菌株对马铃薯淀粉、红薯淀粉、小麦淀粉的利用能力差，胞外多糖含量低。故优选葡萄糖为蝉棒束孢菌C1产胞外多糖的碳源。
实施例4
氮源对蝉棒束孢菌C1胞外多糖产量的影响
培养方法同实施例3，调整发酵培养基的氮源种类，分别添加蛋白胨、硝酸钠、酵母粉、硫酸铵和蚕蛹粉等5种不同的氮源，添加量为4g/L，考察不同氮源对蝉棒束孢C1胞外多糖产量的影响。不同氮源培养下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表2。
表2氮源对蝉棒束孢菌C1胞外多糖产量的影响
氮源 蚕蛹粉 蛋白胨 硫酸铵 硝酸钠 酵母粉
胞外多糖产量(g/L) 2.2 2.84 0.75 1.73 2.6
由表2的结果可知，不同的氮源对蝉棒束孢产胞外多糖的含量影响很大，蝉棒束孢菌C1对有机氮源能力强，在蛋白胨、酵母粉为氮源，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量高，而菌株对无机氮源的利用能力差，胞外多糖含量低。故优选酵母粉和蛋白胨为蝉棒束孢菌C1产胞外多糖的氮源。
实施例5
不同葡萄糖浓度对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
在基础培养基的基础上(组成：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L；pH自然)，其他培养条件不变，调整葡萄糖浓度为20g/L、40g/L、60g/L、80g/L和100g/L，考察葡萄糖浓度对蝉棒束孢C1胞外多糖产量的影响。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表3。
表3葡萄糖浓度对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
葡萄糖浓度(g/L) 20 40 60 80 100
胞外多糖产量(g/L) 1.32 2.85 3.15 2.48 2.31
由表3的结果可知，葡萄糖浓度对蝉棒束孢产胞外多糖的含量影响很大，浓度为60g/L时，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高，故优选葡萄糖浓度为60g/L。
实施例6
蛋白胨和酵母粉比例和含量对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
在以60g/L葡萄糖为碳源的基础培养基上，其他培养条件不变，调整蛋白胨、酵母粉的比例(以A1代表蛋白胨，B1代表酵母粉，A到F添加量(g/L)分别为A1：B1＝1：3；A1：B1＝2：2；A1：B1＝3：1；A1：B1＝3：3；A1：B1＝2：4；A1：B1＝4：2)考察6种蛋白胨和酵母粉配比对蝉棒束孢C1胞外多糖的产量的影响。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表4。
表4蛋白胨和酵母粉配比对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
Figure BDA0002958835790000101
由表4的结果可知，不同蛋白胨和酵母粉配比对蝉棒束孢产胞外多糖的含量有影响，当氮源添加量为蛋白胨4g/L和酵母粉2g/L时，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高，故优选氮源为蛋白胨4g/L和酵母粉2g/L。
实施例7
无机盐含量对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
在以60g/L葡萄糖为碳源，2g/L酵母粉和4g/L蛋白胨为氮源的基础培养基上，其他培养条件不变，调整KH2PO4和MgSO4·7H2O的配比(以C代表KH2PO4，D代表MgSO4·7H2O，A到G添加量(g/L)分别为C：D＝0.5：0.5；C：D＝0.5：1；C：D＝1：0.5；C：D＝1：1；C：D＝1.5：1.5；C：D＝1：2；C：D＝2：1)，考察7种不同配比的无机盐对蝉棒束孢菌株C1胞外多糖产量的影响。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表5。
表5不同无机盐配比对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>、MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O配比(g/L) A B C D E F G
胞外多糖产量(g/L) 2.48 2.55 2.70 3.45 3.13 2.95. 3.25
由表5的结果可知，无机盐配比对蝉棒束孢产胞外多糖的含量影响很大，KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量分别为1g/L时，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高，进一步采用正交实验确定了最佳无机盐为KH2PO4为1.5g/L和MgSO4·7H2O为0.25g/L。
实施例8
摇床转速对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量影响
培养方法同实施例2，调整摇床转速，考察不同摇床转速对蝉棒束孢C1胞外多糖的产量的影响，其中摇床转速分别为120r/min、140r/min、160r/min、180r/min和200r/min。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表6。
表6摇床转速对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量影响
转速(r/min) 120 140 160 180 200
胞外多糖产量(g/L) 3.62 3.75 4.85 4.23 3.68
由表6可知，在转速为160r/min下，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高。
实施例9
培养温度对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
培养方法同实施例2，调整培养温度，考察不同培养温度对蝉棒束孢C1胞外多糖的产量的影响。其中培养温度分别为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表7。
表7培养温度对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
培养温度(℃) 22 24 26 28 30
胞外多糖产量(g/L) 3.22 3.40 4.12 4.96 3.93
由表7的结果可知，温度在28℃条件下，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高。
实施例10
接种量对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
培养方法同实施例2，调整接种量，考察不同接种量对蝉棒束孢C1胞外多糖的产量的影响。其中接种量分别为2％、4％、6％、8％、10％(V/V)。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表8。
表8接种量对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
接种量(％) 2 4 6 8 10
胞外多糖产量(g/L) 2.84 3.11 5.04 4.45 4.12
由表8的结果可知，接种量为6％下，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高，故优选接种量为6％。
实施例11
初始pH对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
培养方法同实施例2，调整发酵培养基的初始pH，考察不同初始pH值对蝉棒束孢C1胞外多糖的产量的影响。其中初始pH值分别为4、5、6、7和8。各条件下获得的发酵液中胞外多糖的含量见表9。
表9初始pH对蝉棒束孢菌C1产胞外多糖产量的影响
初始pH 4 5 6 7 8
胞外多糖产量(g/L) 1.52 2.48 3.85 5.10 3.62
由表9中结果可知，初始pH值为7时，蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖含量最高，故优选初始pH为7。
实施例12
本发明蝉棒束孢菌C1所产胞外多糖(CEPS)性质的研究
(1)CEPS的紫外光谱分析
用蒸馏水将实施例2得到的胞外多糖配制成0.20～0.25mg/mL的CEPS溶液，充分溶解后过0.22μm滤膜于190～400nm波长范围内对其进行紫外光谱扫描。检测结果见图3。由图3的结果可知，CEPS在190nm～200nm附近有强吸收峰，在260nm～280nm处没有吸收特征，说明该物质含多糖类物质、不含蛋白和核酸，可初步判定CEPS是多糖类物质。
(2)CEPS的红外光谱分析
采用KBr压片法，在4000～400cm-1范围内(分辨率4cm-1)对实施例2得到的胞外多糖CEPS进行红外光谱扫描分析，检测结果见图4。由图4的结果可知，CEPS的红外光谱具有多糖的典型谱图。在2942cm-1、3394cm-1、1653cm-1处的吸收峰分别是C–H和O–H伸缩振动、酰胺基团中的N-H变角振动的结果，而在1405cm-1处的吸收峰归因于C-H的变角振动。多糖的特征吸收峰出现在1200cm-1～1000cm-1范围内，对于某一特定的多糖在该区域谱峰的位置和强度都具有专一性；在1044cm-1的宽吸收峰是由C–OH伸缩振动和糖环的C–O–C伸缩振动引起的呋喃环的吸收峰。
(3)CEPS的分子量测定
将实施例2得到的胞外多糖CEPS溶解成浓度为3～5mg/mL的溶液，采用HPSEC-MALLS-RI测定其分子量。分析条件：美国Waters HPLC高效液相色谱仪(Waters 2695)；色谱柱为TSK-GEL G6000PWXL，规格为7.8mm×300mm(TOSOH，日本)；柱温：35℃；流动相：0.15mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4(pH＝7)；流速：0.5mL/min；进样量：100μL检测器：2414示差折光检测器，多角度激光散射仪(Wyatt，HELEOS8)。采用Astra数据分析软件采集并分析光散射的数据。
CEPS在HPSEC-MALLS-RI谱图如图5所示，呈现单一对称峰。CEPS的重均分子量(Mw)为1.675×106Da，数均分子量(Mn)为1.561×106，分散系数PD(Mw/Mn)为1.07，接近于1，说明CEPS的分子量分布较窄，均一性好。
(4)CEPS的单糖组成
称取实施例2得到的胞外多糖CEPS的多糖样品2～5mg，加入0.5mL 2mol/L的三氟乙酸，110℃条件下水解6h，再用1mL的甲醇反复溶解氮吹，定容到50mL容量瓶中，过0.22μm滤膜。采用HPAEC5000系统测定单糖组成，色谱柱：CarboPac PA20(ID 3×150mm)；流动相：水、NaOH(250mmol/L)和NaAc(1mol/L)梯度洗脱；流速为0.5mL/min；以PAD为检测器，进样体积为10μL；以鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸为标准品。
结果如图6所示，与标准单糖的离子色谱图的保留时间相比，CEPS由葡萄糖和半乳糖醛酸组成，其比例为98:2。
与目前报道的蝉棒束孢(或蝉拟青霉)所产的胞外多糖的单糖组成比较发现，CEPS多糖所含的单糖组成不同于已报道的多糖的单糖组成(含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等)；分子量大小也不同，这些都说明蝉棒束孢菌C1所产的胞外多糖CEPS不同于现有报道的蝉棒束孢(或蝉拟青霉)所产的胞外多糖，是一种新的多糖。
(5)CEPS中多糖含量的测定——硫酸苯酚法
采用硫酸苯酚法测定多糖含量，以葡萄糖为标准液，以葡萄糖含量为横坐标，以490nm处吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为y＝0.003x+0.001(R2＝0.996)将多糖用水复溶后，配成1.0mg/mL的浓度，适当稀释后，即可测定CEPS的多糖含量。经计算可知CEPS中多糖含量在90％以上。
实施例13
CEPS的抗氧化活性评价
(1)DPPH自由基清除率
将DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)母液配成浓度为10-4mol/L，样品配成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的浓度，待用。
取0.4mL稀释后的样品中加入3.6mL 10-4mol/L DPPH溶液，常温下避光反应30min，于517nm波长下测吸光值，以0.4mL无水乙醇和3.6mLDPPH溶液混合作为空白对照。DPPH自由基的清除率为：
Figure BDA0002958835790000151
式中，A0：对照样品吸光度值，A1：待测样品吸光度值
以Vc为对照，在0.2～2mg/mL的浓度范围内实施例2的胞外多糖样品对DPPH自由基清除率如图7所示。由图7的结果可知，CEPS具有较好的清除DPPH自由基的能力，在一定范围内与浓度成一定的剂量关系，随着浓度的增加，抗氧化能力增强的趋势；多糖浓度为2mg/mL，DPPH自由基清除率可达61.12％；Vc在0.8mg/mL的浓度下清除率趋于稳定，且多糖的IC50为0.8mg/mL，清除能力能达到Vc浓度的一半。
(2)还原力的测定
pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制：将一定比例的NaH2PO4和Na2HPO4按照一定比例混合，然后用pH计进一步验证；0.01g/mL的铁氰化钾；1g/mL的三氯乙酸，0.001g/mL的FeCl3.7H2O。多糖样品浓度分别配成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL，取1mL样品依次加入2.5mL pH6.6的磷酸缓冲溶液，2.5mL 0.01g/mL的铁氰化钾，50℃，反应20min后，加入2.5mL的1g/mL的三氯乙酸，混匀后3000r/min，离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL水，0.5mL0.001g/mL FeCl3·7H2O，反应10min，在700nm处测吸光值。以Vc作为对照，检测CEPS胞外多糖样品在0.2～2mg/mL的浓度范围内的还原力，检测结果见图8。
由图8的结果可知，在0.2～2mg/mL多糖浓度范围内，随着多糖浓度的增加，多糖的还原力增强。当浓度为2mg/L时，多糖的还原力达到0.352，相对比Vc的还原力，多糖的还原力IC50值在1mg/mL，还原力约为Vc的1/4，说明CEPS具有一定的还原能力。
实施例14
CEPS的免疫活性研究
将CEPS在无菌条件下用PBS配成5mg/mL的母液离心，用PBS稀释至浓度为0.5mg/mL、2mg/m、5mg/mL，备用。将培养好的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞(细胞浓度为5×105)加入96孔板，使每孔加入180μL细胞悬液，再加入待测作用终浓度9μg/mL，25μg/mL，50μg/mL和200μg/mL的多糖样品，以10μg/mL LPS为阳性对照，PBS缓冲液为阴性对照，37℃、5％CO2条件下培养48h，取100μL上清于96孔板，加入50μL，Griess试剂室温孵育10min。在543nm下测吸光度，根据标准曲线检测实施例2的胞外多糖样品的免疫活性，检测结果见图9。
具体检测方法如下：
巨噬细胞产生NO的测定：由于NO极其不稳定，在体内很快生成亚硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-)，故本试验采用Griess试剂测定样品中的NO2-和NO3-作为衡量细胞产生NO水平的指标。(Griess试剂的配制：1％对氨基苯磺酰胺，0.1％α-萘胺，2.5％稀盐酸，在烧杯中加入6.25mL正磷酸，加蒸馏水250mL，加入2.5g对氨基苯磺酰胺和0.25gα-萘胺，用磁力搅拌器全部溶解，棕色试剂瓶4℃冰箱保存。)
配制不同浓度的0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L、40μmol/L、100μmol/L的亚硝酸钠溶液，各取100μL，加入50μL Griess试剂混匀后，于A543nm处测吸光值。以吸光度值对亚硝酸钠的浓度做标准曲线，Y＝0.0102X+0.0383(R2＝0.9992)。
由图9的结果可知，以脂多糖LBS作为阳性对照，浓度为10μg/mL时，NO的释放量为40.56μmol/L；CEPS多糖在25～200μg/mL浓度范围内，随着多糖浓度的增加，NO的释放量逐渐增加，且呈现剂量效应；当多糖浓度为200μg/mL，NO的释放量的释放量为33μmol/L。说明CEPS能够刺激RAW264.7细胞产生NO，显示出良好的免疫激活活性。目前有关蝉棒束孢(或蝉拟青霉)多糖的免疫活性的研究主要集中在菌丝体或胞内多糖，而胞外多糖的研究未见相关报道。本发明蝉棒束孢菌C1所产的胞外多糖CEPS具有刺激巨噬细胞RAW264.7细胞产生NO，显示出良好的免疫活性，将来可用于功能性食品开发中。
实施例15
CEPS的保湿性能测定
将实施例2胞外多糖CEPS、甘油和透明质酸置于真空干燥箱过夜干燥；准确称取0.5g，做3组平行。置于20℃，相对湿度分别为RH为43％、RH为81％的恒温恒湿箱内，一定时间段称各试样的质量，待吸湿达到饱和的试样继续放置，48h后精确称取各试样质量，由试样前后的质量差，求保湿率和吸湿率：
保湿率＝Hn/H0×100％，式中：H0为试样含水量，Hn为放置后试样含水量；
吸湿率＝(Mn-M0)/M0×100％，式中：M0为称量样品吸湿前重量(g)，Mn：样品吸湿48h后重量(g)。
检测结果见表10、图10和图11。
表10 CEPS、甘油和透明质酸的48h保湿率结果
Figure BDA0002958835790000171
由表10的结果可知，在相对湿度为43％和81％时样品的保湿率，甘油<多糖CEPS<透明质酸，多糖CEPS的保湿率介于甘油和透明质酸之间，展示出较好的保湿性。
图10、图11分别是多糖CEPS在48h内在相对湿度分别为43％和81％时的吸湿曲线。在相对湿度为43％时CEPSE的吸湿率低于甘油和透明质酸，而在相对湿度为81％时，吸湿率：甘油>CEPSE>透明质酸，继续放置48h，结果发现CEPS的保湿效果介于甘油和透明质酸之间。多糖因分子量、单糖组成、链结构等差异，展示出不同的保湿性和吸湿性能。本发明的CEPS具有很好的保水性，可作为保湿性原料应用于化妆品中。
实施例16
CEPS的流变特性研究
用蒸馏水将实施例2的胞外多糖CEPS配制成质量百分含量为0.1％、0.3％、0.5％的系列浓度的多糖溶液，在35℃水浴中轻微搅拌，使其能够溶解充分，静置过夜。采用AR-G2型旋转式流变仪对多糖组分的流变性质进行研究。测定条件为：40mm不锈钢平行板，板间距1mm。在25℃、选择流动模式，考察不同浓度多糖的流变特性，检测结果见图12。
由图12的结果可知，在同一浓度下，剪切速率从0.1s-1增加至500s-1时，CEPS多糖溶液黏度逐渐降低，溶液呈剪切变稀现象，属于典型的非牛顿假塑性流体。同时看到，在同一剪切速率下，CEPS多糖溶液的表观粘度随着多糖浓度的增加而增大。Jittra等认为多糖分子之间能够通过链-链缠结形成有序结构，而剪切力可以破坏这种有序结构，导致黏度下降。多糖剪切变稀的流变行为不仅可以为食物提供良好的口感，同时由于多糖在高剪切速率下的黏度较低，因此可以在较低的能量下运行，减少机械运转过程中的能量损耗，为CEPS多糖在食品加工中的应用提供了理论基础。CEPS多糖在低浓度下显示出较高的黏度，可作为增稠剂应用于食品、化妆品中。目前有关蝉棒束孢(或蝉拟青霉)多糖流变特性的研究较少，而蝉棒束孢菌C1所产的胞外多糖CEPS展示出良好的流变性能，可应用于食品、化妆品中。
实施例17
CEPS的悬浮性能研究
用蒸馏水将实施例2的胞外多糖CEPS配制0.075mg/mL的多糖溶液，同时以常用的稳定剂海藻酸钠、黄原胶和瓜尔胶(浓度：5mg/mL)为对照，每管中加入0.4mg/mL的活性炭，混匀，静置，观察样品的悬浮情况，观测结果见图13～15，1～4样品管依次是海藻酸钠、黄原胶、瓜尔胶和CEPS多糖。图13～15分别为悬浮0h、4h、8h不同样品的悬浮情况。由图13～15的结果可知，在最初阶段，4个样品对活性炭均有好的悬浮能力，活性炭均匀分布；随着时间的延长，4个样品对活性炭的悬浮出现差异，悬浮4h时，悬浮效果：黄原胶＝CEPS多糖>瓜尔胶>海藻酸钠，CEPS多糖的悬浮性能与黄原胶相当，但浓度却比黄原胶要低很多，CEPS多糖的悬浮性能稳定；随着悬浮时间的延长，悬浮8h的效果同悬浮4h，悬浮稳定性良好。可见，CEPS多糖展现出良好的悬浮稳定性，可作为悬浮稳定剂应用在食品和化妆品中。
SEQUENCE LISTNG
<110> 上海应用技术大学
<120> 一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌株、胞外多糖及制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
tccgtaggtgaacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tcctccgcttattgatatgc 20
<210> 3
<211> 596
<212> DNA
<213> 蝉棒束孢菌C1(Isaria cicadae C1)
<400> 3
tgcggaagga tcattaacga gttttgaaac gagttgtagc tggccttccg aggcatgtgc 60
acgctctgct catccactct acccctgtgc acttactgta ggttggcgtg ggctcctttg 120
cgggagcatt ctgccggcct atgtatacta caaacacttt aaagtatcag aatgtaaacg 180
cgtctaacgc atctataata caacttttag caacggatct cttggctctc gcatcgatga 240
agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 300
ttgaacgcac cttgcgctcc ttggtattcc gaggagcatg cctgtttgag tgtcatggaa 360
ttctcaactt ataaatcctt gtgatctata agcttggact tggaggcttg ctggccctcg 420
ttggtcggct cctcttgaat gcattagctc gattccgtac ggatcggctc tcagtgtgat 480
aattgtctac gctgtgaccg tgaagtgttt tggcgagctt ctaaccgtcc attaggacaa 540
ctttttaaca tctgacctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatc 596

Claims (10)

1.一株产胞外多糖的蝉棒束孢菌，拉丁文为Isaria cicadae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.18807，保藏日期：2019年11月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。
2.一种利用权利要求1所述的蝉棒束孢菌制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述胞外多糖由所述的蝉棒束孢菌接种到发酵培养基后经过发酵得到。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40～60g/L，蛋白胨2～4g/L，酵母粉2～4g/L，KH2PO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O0.2～1.5g/L；所述发酵培养基的pH值为6～7。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蝉棒束孢菌以种子液的形式接种到发酵培养基中，所述种子液的接种量为5～10vol％。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养条件为：发酵温度20～30℃，转速120～200r/min，发酵时间72～100h。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵所得的发酵产物纯化后，得到所述胞外多糖。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化的方法为醇沉淀纯化。
8.一种权利要求2～7任一项所述的方法制备的胞外多糖。
9.权利要求1所述的蝉棒束孢菌或权利要求8所述的胞外多糖在食品中的应用。
10.权利要求1所述的蝉棒束孢菌或权利要求8所述的胞外多糖在化妆品中的应用。
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