CN115786131A

CN115786131A - 一种矢车菊素生产菌株及其应用

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Publication number: CN115786131A
Application number: CN202211077230.9A
Authority: CN
Inventors: 王洪凯; 邹玉; 王秀青; 林福呈
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-09-02
Also published as: CN115786131B

Abstract

本发明公开了一种矢车菊素生产菌株及其应用，属于微生物发酵与代谢产物领域。所述矢车菊素生产菌株为蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)，株号为2‑2，保藏号为：CCTCC NO：M 20221233。菌株2‑2易培养，工艺简便，生产成本低，生长周期短，避免了现有技术利用的植物资源生产周期长，受季节和环境影响大等弊端，可以一年四季规模化生产，具有环境友好型的优点。本发明所述菌株2‑2及其代谢产物包括矢车菊素，矢车菊素的产量较高，所产的矢车菊素可以用于保健品、食品、化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种矢车菊素生产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵与代谢产物领域，具体涉及一种矢车菊素生产菌株及其应用。

背景技术

花青素(anthocyanidin)又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，是花色苷水解而得的有颜色的苷元。水果、蔬菜、花卉中的主要呈色物质大部分与之有关。在植物细胞液泡不同的pH值条件下，花青素使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。已知花青素有20多种，食物中重要的有6种，即天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素。自然状态的花青素都以糖苷形式存在，称为花色苷，很少有游离的花青素存在。花青素主要用于食品着色方面，也可用于染料、医药、化妆品等方面。花青素属于类黄酮化合物，具有清除自由基、抗癌、抗氧化、抗突变、抗辐射、预防心脑血管疾病，改善皮肤弹性、增进视力、改善睡眠、保护肝脏等生理作用，被广泛应用于医药、化妆品、保健品、食品等领域。

植物花青素在蓝莓，桑葚，葡萄等植物中含量较高，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。其颜色随着pH值变化而呈现出红、蓝、紫不同颜色，在500-550nm可见光区域有吸收峰。

矢车菊素-3-O-葡萄糖(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)属黄酮类化合物，具有多种生物活性功能，如抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖、预防糖尿病、保护心脏、增强血液循环和保护感受器细胞等作用。此外，矢车菊素还具有较高的抗癌预防效应。食用富含花色苷的食物可以在一定程度上降低癌症等疾病的风险。有日本研究者发现，黑豆中含有18种以上花青素类物质，其中矢车菊素类的含量相对较高，可以有效改善黄褐斑症状。故老年人多吃含有矢车菊素类食品对保护身体有极为重要的作用。且矢车菊素安全无毒，故被广泛应用于医药、化妆品、保健品、食品等领域中。

矢车菊素是一种水溶性色素，广泛存在于黑米、黑豆、紫薯和蓝莓等蔬菜和水果中，是自然界存在的最普遍的、比较稳定且易于获得的一种花青素之一。然而植物生长受土壤、温度、地域等环境因素影响较大，且收获具有季节性，并且不易储存。用植物生产花青素，因受资源影响，较难做到周年生产。利用微生物生产植物代谢产物，可以有效避免季节性、易受环境影响等问题，具有生产成本低、生产周期短，且可以规模化生产等优势。当前，利用微生物生产代谢产物如紫杉醇等已经有所报道。然而，有关利用微生物生产矢车菊素的研究，国内外尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够生产矢车菊素的菌株2-2，通过高效液相色谱法在五种菌株中筛选到菌株2-2，对该菌株进行复合培养基与不同碳氮源的单因素条件培养后，筛选到提取矢车菊素的最适培养方法，并确定关于该菌株的矢车菊素的提取方法。

本发明所述的矢车菊素生产菌株2-2，于江苏宜兴从蝉的虫体进行组织分离得到。通过对其形态特征观察，基因组DNA提取，PCR扩增和5.8S rDNA-ITS序列分析，在NCBI数据库进行Blast比对，发现菌株2-2与Isaria cicadae strain BCC19486菌株的同源性最高，结合菌体的形态特征，确定该菌株为蝉棒束孢菌，命名为蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)，株号为2-2。该菌株于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20221233。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

本发明所述的矢车菊素生产菌株2-2在pH值为2-12，温度为10℃-37℃条件下生长。同时，菌株2-2能在多种培养基质中生长并代谢花青素，可在不同复合培养基和添加有不同碳源和不同氮源的无机培养基中生长，复合培养基为CM培养基(Conditionalmedium)、PDB培养基(Potato Dextrose Broth)以及GPY培养基(Glucose Peptone Yeastextract medium)中生长，所述不同碳源是指葡萄糖、乙酸、橄榄油、吐温20中的一种或多种组合；所述不同氮源是指硝酸钠、亚硝酸钠、氯化铵中的一种或多种组合。

本发明中所述矢车菊素生产菌株2-2及其发酵代谢产物，绿色环保，市场应用前途广阔。

本发明还提供了所述的矢车菊素生产菌株在矢车菊素生产中的应用。

本发明还提供了一种生产矢车菊素的方法，发酵培养所述矢车菊素生产菌株，分离提取获得矢车菊素。

优选的，发酵培养时使用的培养基为不同复合培养基，或者添加有不同碳源和不同氮源的无机培养基，复合培养基为CM培养基、PDB培养基或GPY培养基；所述不同碳源是指葡萄糖、乙酸、橄榄油、吐温20中的一种或多种组合；所述不同氮源是指硝酸钠、亚硝酸钠、氯化铵中的一种或多种组合。

更为优选的，当发酵培养时使用的培养基为无机培养基(MM培养基)，添加的碳源为乙酸，添加的氮源为氯化铵；当发酵培养时使用的培养基为复合培养基，复合培养基为CM培养基。

优选的，发酵培养的温度为10℃-37℃；发酵培养的pH值为2-12；发酵培养的时间为2-6d。

生产矢车菊素的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将矢车菊素生产菌株2-2接种到PDA培养基上，25℃培养7d，再接入到YES培养基中，25℃培养10d后得到活化的菌液；

(2)发酵培养：将步骤(1)中活化的菌液加入到无机培养基或CM培养基中，在温度为25℃，转速为150rpm条件下，培养6d，代谢产生矢车菊素；

其中，无机培养基中添加的碳源为乙酸，添加的氮源为氯化铵。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的菌株2-2是一种矢车菊素生产菌，可以用于微生物源矢车菊素的生产，开辟出一条微生物生产矢车菊素的新路径与一个新的微生物应用领域。

2.本发明提供的菌株2-2易培养，工艺简便，生产成本低，生长周期短，避免了现有技术利用的植物资源生产周期长，受季节和环境影响大等弊端，可以一年四季规模化生产，具有环境友好型的优点。

3.本发明所述菌株2-2及其代谢产物包括矢车菊素，矢车菊素的产量较高，所产的矢车菊素可以用于保健品、食品、化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为蝉棒束孢菌2-2的微观形态图。

图2为蝉棒束孢菌的不同菌株在YES平板上生长10天的菌落形态图。

图3为菌株2-2所产矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的色谱图；其中，A为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的色谱图；B为菌株2-2所产矢车菊素的色谱图。

图4为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线图。

具体实施方式

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品购于上海麦克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。液相色谱仪(型号高效安捷伦1100)购于美国安捷伦公司；冷冻干燥机LGJ-10E购于四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司。

实施例1：菌株2-2的筛选与鉴定

1、菌株2-2分离与纯化

(1)从江苏宜兴采集到蝉花子实体，于马铃薯固体培养基上培养，分离菌株。定期观察并挑取平板中的菌丝，转接入新的相同的固体培养基上进行纯化，直至为纯培养物，并对菌落形态进行观察。

(2)取上述平板纯化得到的不同菌株逐一进行筛选，在马铃薯培养基、YES培养基上培养，直到获得单菌落，共得到菌株B5-1、菌株5-2、菌株2-2、菌株B9、菌株花小五类菌株，放在20％甘油置于-80℃保存。

所用的培养基配方如下：

马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

YES培养基：酵母提取物20g，蔗糖150g，七水硫酸镁0.5g，微量元素1ml(五水硫酸铜0.5g/L，七水硫酸锌0.1g/L)，蒸馏水1L，用氢氧化钠调节pH为6.5±0.2，115℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

2、矢车菊素生产菌株筛选

挑取上述步骤1中纯化好且产色的菌落，接种于YES培养基中，于25℃中培养7d后观察不同菌株的菌落形态(图2)，并记录其生长速率(表1)。通过高效液相色谱法对不同菌株的矢车菊素含量进行测定，筛选到生产矢车菊素的最佳菌株。

表1菌株生长10天的平均生长速率(mm/d)

5-2	花小	B9	B5-1	2-2
					5.09±0.03**	4.25±0.02**	4.47±0.02**	5.01±0.03**	6.31±0.03

注：*P≤0.05，**P≤0.01表示数据在统计学上具有显著性差异。

3、菌株鉴定

3.1菌落形态特征观察

菌株2-2在YES固体培养基中培养7-10d，菌丝即可铺满直径为9cm平板。菌株菌丝絮状，高3～5mm，呈白色，部分紫色代谢产物可转移到培养基中，菌落反面会呈现红白相间或者红色。当开始产生分生孢子时出现淡黄色，菌落转为土灰色时会有大量孢子产生。

3.2显微形态特征观察

显微镜下观察，单个分生孢子呈椭圆形，且分生孢子梗上的分支多局限于分生孢子梗顶部，瓶梗粗而短，密集，分生孢子较大。图1为菌株2-2显微形态图。

3.3菌株2-2分子生物学鉴定

3.3.1菌株2-2的基因组提取

(1)挑取冻存管中菌株2-2，接种到YES固体培养基中，25℃中培养为3-5天，刮取菌丝；

(2)将步骤(1)中培养得到的菌转入研钵中，加入少量液氮，反复研磨至菌体呈粉末状。将研磨好的菌体转入2mL的EP管中，加入700μl的DNA提取缓冲液；

(3)研磨：将离心管放在组织研磨机中进行研磨，在65Hz下震荡2min；

(4)12000rpm离心10min后，吸取上清液400μl于新的2ml离心管中，加入等体积的CIA(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，放在通风处中的摇床中15-20min；

(5)12000rpm离心10min后吸取上层水相于新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀；

(6)静置半小时以上，或者放入-20℃冰箱中加快核酸沉淀；

(7)12000rpm离心10min后弃掉上清液，加入600μl 75％酒精(v/v)进行沉淀，洗涤两次后倒掉酒精，加入60μl的1×TE，轻弹管壁，使沉淀溶解；

(8)用质量体积比为1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.3.2PCR扩增和测序比对

采用真菌通用引物ITS4(ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)、ITS5(ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)扩增菌株5.8S rDNA-ITS基因序列。PCR扩增采用25μL反应体系和PCR程序如表2和表3所示。

表2 PCR扩增采用25μL反应体系

Green Taq Mix	12.5μl
		DNA	10-100ng
上游引物(10μM)	1μl
		下游引物(10μM)	1μl
ddH<sub>2</sub>O	至25μl

表3 PCR程序

PCR循环结束后取PCR产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

将扩增得到的序列，送浙江尚亚生物技术有限公司测序，得到菌株2-2的ITS区长度为581bp。得到菌株2-2的5.8SrDNA-ITS基因序列(如SEQ ID No.1所示)。

将上述测序结果与网站“https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/”中基因序列比对，发现菌株2-2的5.8S rDNA-ITS基因序列与Isaria cicadae中的一些菌株的ITS序列的同源性最高。

3.3.4菌株2-2鉴定为新功能菌株

根据菌株2-2菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，确定菌株2-2为蝉棒束孢菌，并命名为蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)，株号2-2。该菌株于2022年8月3日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20221233。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

目前，国内外尚无文献报道蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)具有产矢车菊素的功能。因此，蝉棒束孢菌2-2为一株具有产矢车菊素的新功能微生物菌株。

实施例2：优势菌株筛选

一、蝉棒束孢菌的培养与发酵

1、蝉棒束孢菌的培养

研究发现，蝉棒束孢菌适生范围宽，在pH为2-12，温度在20℃-37℃均能生长，具有较宽的酸碱耐受性。同时，蝉棒束孢菌能在多种培养基质中生长并代谢矢车菊素，如CM培养基、PDB培养基、GPY培养基中均生长并生产矢车菊素，能够利用的碳氮源种类较广，碳源有葡萄糖、乙酸、橄榄油、吐温20等，氮源有硝酸钠、亚硝酸钠、氯化铵等。

2、蝉棒束孢菌的液体发酵

(1)菌株活化

分别将保存在冻存管中的蝉棒束孢菌菌株2-2、菌株B5-1、菌株5-2、菌株花小、菌株B9五个菌株无菌接种于PDA培养基上，于25℃中培养7d，获得F2代菌株。YES平板培养基中接入F2代菌株(直径为6mm的菌饼)，25℃条件下培养10d观察蝉棒束孢菌的形态与生长速率。

(2)发酵培养

分别用灭菌牙签刮取上方(1)活化的菌株菌丝约4cm²，放入2mL离心管中，加入1mL无菌水，65Hz振荡一分钟；(a)将振荡后的菌液全部吸出加入培养基中，25℃，150rpm，培养6d；(b)将振荡后的菌液全部吸出加入不同碳源的培养基中，25℃，150rpm，培养6d；(c)将振荡后的菌液全部吸出加入不同氮源培养基中，25℃，150rpm，培养6d；

CM培养基、PDB培养基、GPY培养基复合培养基以及不同碳氮源的无机培养基配方如表4～6所示。

表4复合培养基

表5碳源试验培养基(1L)

将葡萄糖置换成①1％橄榄油+0.05％吐温20(v/v)；②50mM乙酸钠；③1％三油酸甘油酯(v/v)；④0.5％吐温-20(v/v)。

表6氮源试验培养基(1L)

将硝酸钠置换成①1mM硝酸钠；②1mM亚硝酸钠；③硫酸铵；④氯化铵。

二、矢车菊素的测定

1、矢车菊素的提取

将步骤一中培养六天的蝉棒束孢菌置于真空冷冻干燥机中过夜处理，称取用真空压缩机干燥的样品1.0g，加入10ml体积百分比为1％的盐酸-甲醇溶液浸提24h，过滤，获得滤液。准确吸取1.0ml滤液于25ml棕色容量瓶中，用色谱甲醇定容后摇匀，上样检测前过0.25μm微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱法分析。

2、矢车菊素的测定

(1)对照品溶液的配制：准确称取2.5mg矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标品，用色谱甲醇定容至25mL并摇匀，得到浓度为0.1mg/ml的标准液；

(2)色谱条件：色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP柱(250mm×4.60mm，5μm))；流动相：A相为0.5％磷酸溶液，B相为水-乙腈(50∶50，v/v)。进行梯度洗脱：0min(18％B)、23min(50％B)、28min(18％B)、33min(18％B)、40min(stop)；流速：0.8mL/min；检测波长：520nm；柱温：30℃。对照品以及样品的色谱图见图3；

(3)制作标准曲线：准确吸取配置好的矢车菊素标准液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL于棕色容量瓶中，用流动相定容至20mL，得到浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液，上样检测前过0.25μm滤膜。每个体积浓度的标准品溶液重复进样3次，得到相应峰面积，计算平均值。以矢车菊素体积浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，制作标准曲线，标准曲线如图4所示，计算线性回归方程；

(4)样品矢车菊素含量测定：

将步骤1中的样品用高效液相色谱仪进行检测并对结果进行分析汇总。

结果显示：将不同菌株的蝉棒束孢菌在YES平板上培养10天后发现，菌株2-2不仅在生长方面具有优势，并且和其他菌株相比，菌株2-2在培养基背面有明显红色沉降的现象。由图3可知，在试验条件下，矢车菊素在12min左右出现峰面积，0.5～25.0μg/mL样品与峰面积呈良好的线性关系，矢车菊素的标准曲线方程为y＝13.174x+6.3872(R²＝0.9975)。由图3B可知，所获得的菌丝体与矢车菊素标准对照品在相同的时间出现矢车菊素的特征吸收峰。

通过计算，在菌体干重质量相同的条件下，菌株2-2产矢车菊素的量分别是菌株B9、菌株花小、菌株B5-1、菌株5-2的4.65、3.44、1.59、1.73倍，为3.86mg/g。通过在不同复合培养基中发酵菌株2-2，得到矢车菊素最佳复合培养基为CM培养基，分别为PDB培养基、GPY培养基的1.17、1.27倍。通过在不同碳氮源的无机培养基发酵，得到最适矢车菊素生产的无机培养基中添加的碳源为乙酸，氮源为氯化铵：当碳源为乙酸时，分别为葡萄糖、橄榄油、吐温20的1.63、1.24、1.88倍；当氮源为氯化铵时，分别是1mM硝酸钠、1M硝酸钠、亚硝酸钠1.94、2.02、8.50倍。

将菌株2-2接种于PDA培养基上，于25℃中培养7d，获得F2代菌株。在YES培养基中接入F2代菌株(直径为6mm的菌饼)，25℃条件下培养10d；再灭菌牙签刮取蝉棒束孢菌2-2菌株约4cm²的菌丝，放入2mL离心管中，加入1mL无菌水，65Hz振荡一分钟，将振荡后的菌液全部吸出加入MM培养基或CM培养基中，25℃，150rpm，培养6d后得到的矢车菊素产量最高；其中MM培养基中添加的碳源为乙酸，氮源为氯化铵。

菌株2-2发酵周期短，工艺简便，发酵规模可以人为控制，可周年生产，产量高，具有很高的开发应用价值。

Claims

1.一种矢车菊素生产菌株，其特征在于，命名为蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)，株号为2-2，保藏号为：CCTCC NO：M20221233。

2.如权利要求1所述的矢车菊素生产菌株在矢车菊素生产中的应用。

3.一种生产矢车菊素的方法，其特征在于，发酵培养权利要求1所述矢车菊素生产菌株，分离提取获得矢车菊素。

4.如权利要求3所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，发酵培养时使用的培养基为不同的复合培养基，或者添加有不同碳源和不同氮源的无机培养基；复合培养基为CM培养基、PDB培养基或GPY培养基；所述不同碳源是指葡萄糖、乙酸、橄榄油、吐温20中的一种或多种组合；所述不同氮源是指硝酸钠、亚硝酸钠、氯化铵中的一种或多种组合。

5.如权利要求4所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，当发酵培养时使用的培养基为无机培养基，添加的碳源为乙酸，添加的氮源为氯化铵；当发酵培养时使用的培养基为复合培养基，复合培养基为CM培养基。

6.如权利要求3所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，发酵培养的温度为10℃-37℃。

7.如权利要求3所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，发酵培养的pH值为2-12。

8.如权利要求3所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，发酵培养的时间为2-6d。

9.如权利要求3所述的生产矢车菊素的方法，其特征在于，包括以下步骤：