CN113999775B - 一种柴达木中国美味蘑菇及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柴达木中国美味蘑菇及其应用，属于生物技术领域。所述柴达木中国美味蘑菇由来源于青海省柴达木盆地的野生大肥菇组织分离并纯化获得，命名为柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU‑TP‑08，保藏号为CCTCC NO:M 2021511。本发明提供了适合柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU‑TP‑08菌丝体液体发酵的培养基和胞外多糖富集的培养基，通过优化液体培养基，克服其液体培养生长缓慢的问题，其菌丝体的产量达到6.93g/L，胞外多糖的产量达到2.42g/L。柴达木中国美味蘑菇胞外多糖具有抑制Aβ淀粉样蛋白引起的神经损伤从而起到神经保护的作用。

Description

一种柴达木中国美味蘑菇及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及柴达木中国美味蘑菇亚种(Agaricussinodeliciosus var.Chaidam)ZJU-TP-08菌株及其应用。
背景技术
柴达木中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam)是青藏高原柴达木盆地一种珍稀的野生食用真菌，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇。其子实体肥大，菌盖直径6-20cm，初半球形，后扁半球形，顶部平或略下凹，菌盖边缘有不规则鳞片，菌褶为深褐色，呈现白色双层环伞菌子实体。
柴达木中国美味蘑菇主要生长在戈壁草滩土层下20～70cm。由于生长在特殊生态环境下，其具有菌肉结构紧密、含水量低、富有弹性、耐储运、适应性广、抗逆性强等特点，是一种食用价值很高，分类十分重要的野生型食用真菌。其子实体具有抗疲劳、缓解缺氧、提高劳动耐力等强身健体的功效，其作为天然、传统的美味食品和民间医药受到了当地人民的高度重视。
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及其发酵液中分离出的代谢产物，是一类由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的天然高分子多聚物。柴达木大肥菇中的多糖具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和提高免疫力的生物活性，申请号为2018115794083的中国专利公开了从柴达木双层环伞菌中分离的子实体多糖、发酵液多糖和菌丝体多糖具有抗疲劳、抗缺氧损伤的作用。在传统培育中，主要通过人工固体栽培来培养真菌。该方法具有培养周期长、培养环境条件难以控制、产品质量稳定性难保证等缺点。这些缺点阻碍了食用菌工业化的进程。
食用菌液体深层发酵技术是在生物系统反应器中采用液体培养基，借助培养基的溶氧，从而为菌体提供代谢所需得氧气，并可通过控制适宜的外界条件，来获得大量菌丝体及多种胞外产物。与传统人工栽培和天然采摘相比，液体深层发酵在培养周期短、原料来源广泛、培养条件易于控制、产物具有多样性、菌龄一致、产量高、便于大规模生产等方面有突出的优点，具有广阔的应用前景。
柴达木中国美味蘑菇作为在食用和药用价值都很高的珍稀地下食用菌，因其产量低，加上产地偏远，以及发酵水平低等问题，限制了柴达木中国美味蘑菇多糖工业化的发展。因此，从野生柴达木中国美味蘑菇中分离鉴定出品质优良的种质进行人工驯化，并探究一种适合其多糖发酵生产的液体深层发酵技术，对于开发柴达木中国美味蘑菇多糖规模化和工业化生产具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于挖掘一种生长在青藏高原柴达木盆地地区的柴达木中国美味蘑菇亚种食用菌资源，并提供一种基于菌种液体化的柴达木中国美味蘑菇液体培养方法，以有效克服柴达木中国美味蘑菇在现有液体发酵培养条件下存在的菌丝容易老化从而产量低下的问题。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种柴达木中国美味蘑菇，从生长在柴达木盆地戈壁地区表面盐层50-60cm下的野生柴达木双层环伞菌子实体组织中分离，经人工正常大气压下纯化与培养，得到新的菌株。利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性和ITS序列分析对该菌株鉴定为担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam，并将其命名为柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08(Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam ZJU-TP-08)，该菌株已于2021年5月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2021511，保藏地址：中国武汉，武汉大学。
该菌株具有下述生物学特性：
菌落特征：在PDA培养基上形成明显的菌落，直径在560-660mm之间，菌落呈铁饼状，从中央辐射状向四周平展，菌落中心部有隆起，四周平展，呈草帽状；边缘整齐，生长初期乳白色后期为微黄色或浅褐色，不透明，表面湿润光滑。
生长特性：在温度18-23℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH分别为8和3，最适生长初始pH为5.0；菌丝萌芽阶段为4-7天。
菌丝体菌株的保存方法：在温度4℃下以PDA斜面试管形式保存。
研究表明，本发明的菌株具有合成多糖、麦角甾醇、叶酸、萜类的能力。其中合成的胞外多糖具有抑制Aβ淀粉样蛋白引起的神经损伤从而起到神经保护的功效。
本发明提供了一种柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌种接入种子培养基中培养，得到种子液；
(2)将种子液接种到生产培养基中，20～23℃的条件下培养，得到柴达木中国美味蘑菇食用菌菌丝体，所述生产培养基以每升重量份计包括：果糖30～32g，酵母提取物8～9g，磷酸二氢钾1.7～2g，无水硫酸镁1～1.5g，维生素B1 0.5～0.6g。
本发明在传统的固体栽培技术上加以改进，首先将食用菌菌种接种到固体培养基中制得固体菌种，然后将所述的固体菌种加入液体培养基中制得液体菌种，最后将液体菌种接种到生产培养基中进行生产培养。
相较于人工固体培育方式，本发明以母种制成种子液通过液体发酵方式生产菌丝体，具有接种量可调整，准确易控制等优点，适合菌株规模化生产。本发明对适合柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌丝体液体发酵培养基的组成成分进行优化，在上述生产培养条件下，在短时间内有效提升菌丝体生物量。
优选的，步骤(1)中，所述活化为将柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌种接种到PDA培养基上，在20～23℃的条件下培养15～25天，制得固体菌种。
待菌丝铺满培养基后，避开母种子块，取下菌丝接种于种子培养基中，振荡培养得到液体种子。为了使菌丝大小生长均匀，振荡培养时可向培养基中加入无菌的玻璃珠。
优选的，所述种子培养基以每升重量份计包括：麦芽糖18～20g，葡萄糖9～11g，蛋白胨5～6g，磷酸二氢钾0.2～0.3g，无水硫酸镁0.4～0.5g，维生素B1 1～1.5g。
优选的，种子液培养条件为在20～23℃、转速130～150rpm的条件下培养15～25天，至发酵液中出现大量细小、均匀的絮状菌丝且菌液清亮。
优选的，步骤(2)中，种子液以体积比5％～10％接种于生产培养基中，在20～23℃的条件下培养10～15天。
优选的，所述生产培养基以每升重量份计包括：果糖30g，酵母提取物8g，磷酸二氢钾1.79g，无水硫酸镁1.18g，维生素B1 0.5g。研究结果表明，采用上述培养基可使得柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌丝体生物量达到6.93g/L。
进一步的，本发明对适合柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08液体富集胞外多糖培养基的组成成分进行优化。具体的，本发明提供了一种柴达木中国美味蘑菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将活化的柴达木中国美味蘑菇菌种接入种子培养基中培养，得到液体菌种；
2)将液体菌种接种到发酵培养基中，20～23℃的条件下培养10～15天，收集发酵液，分离提取柴达木中国美味蘑菇胞外多糖，所述发酵培养基以每升重量份计包括：果糖42～45g，酵母提取物10～12g，磷酸二氢钾8～10g，无水硫酸镁6～8g，维生素B1 0.05～0.15g。
优选的，步骤1)中，将柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌种接种到PDA培养基上，在20～23℃的条件下活化培养，制得固体菌种；再将固体菌种接种到种子培养基中，20～23℃、转速130～150rpm的条件下培养15～25天，制得液体菌种，所述种子培养基以每升重量份计包括：麦芽糖18～20g，葡萄糖9～11g，蛋白胨5～6g，磷酸二氢钾0.2～0.3g，无水硫酸镁0.4～0.5g，维生素B1 1～1.5g。
优选的，步骤2)中，液体菌种以体积比5％～10％接种于发酵培养基中。
优选的，所述发酵培养基以每升重量份计包括：果糖43.2g，酵母提取物11g，磷酸二氢钾9g，无水硫酸镁7g，维生素B1 0.1g。采用该培养基可使得柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08液体发酵产胞外多糖产量达到2.42g/L。
优选的，步骤2)中，发酵液中胞外多糖的分离提取方法包括：将发酵液浓缩后进行醇沉，制得粗多糖；粗多糖依次经脱色、脱蛋白、层析进行纯化制得中性多糖、酸性多糖组分；所述层析为采用DEAE-FF柱，依次收集超纯水洗脱的中性多糖和0.1M氯化钠溶液洗脱的酸性多糖组分。
优选的，采用Sephacryl S-200凝胶过滤柱对中性多糖、酸性多糖组分分别进行纯化，以超纯水为流动相以0.8mL/min的流速分别对分离组分进行洗脱。
进一步的，本发明提供了由上述制备方法制备的柴达木中国美味蘑菇多糖，其中包含岩藻糖、氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸。
本发明还提供了上述柴达木中国美味蘑菇多糖在制备治疗神经损伤的药物中的应用。研究表明，所述多糖可以显著改善Aβ1-42诱导损伤的神经细胞的活力。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供了一种食用真菌柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08，其具有合成多糖、麦角甾醇、叶酸、萜类的能力，其中合成的胞外多糖具有抑制Aβ淀粉样蛋白引起的神经损伤从而起到神经保护的功效。
(2)本发明提供了适合柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌丝体液体发酵的培养基和胞外多糖富集的培养基，通过优化液体培养基，克服其液体培养生长缓慢的问题，其菌丝体的产量达到6.93g/L，胞外多糖的产量达到2.42g/L。通过液体深层发酵，在短时间内获得大量真菌菌丝体、胞外多糖等物质，使得发酵产物的附加值进一步提高。
(3)相比现有的固体菌种直接接种的生产培养方式，采用本发明的食用菌培养方法能够获得液体菌种的使用效果，具有接种量大小可调整，准确易控制，适应菌株大批量液体发酵及产胞外多糖等优点；本发明从母种制成的种子液通过液体发酵生产菌丝体及多糖产物具有投资小、操作简便等优点。此外，本发明以机械替代人工，减轻劳动强度，能极大地解放农村劳动生产力，更能够较好地控制菌种用量，利于标准化生产，产品质量稳定，形成区域性规模生产。采用本发明的食用菌培养方法能够实现中国美味蘑菇低成本高效益的技术转变。
附图说明
图1为柴达木中国美味蘑菇在PDA培养基生长情况图，其中左图为培养初期的菌丝，菌丝呈现白色；右图为培养后期的菌丝，菌丝呈现微黄色。
图2为柴达木中国美味蘑菇菌丝体微观图。
图3为柴达木中国美味蘑菇的系统发育树。
图4为柴达木中国美味蘑菇液体发酵种子液制备，其中左图为种子液正视图；右图为种子液俯视图。
图5为不同碳源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵的影响试验。
图6为不同氮源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵的影响试验。
图7为Aβ1-42淀粉样蛋白对人神经母瘤细胞SHSY-5Y细胞损伤模型的建立。
图8柴达木中国美味蘑菇中性多糖(EPS-1)，酸性多糖(EPS-2)及粗多糖对Aβ1-42诱导损伤的人神经母瘤细胞SHSY-5Y的保护作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08的分离鉴定
1、柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08菌种来源：由海拔从四周4000m到中部2600m的柴达木盆地诺木洪生长在盆地戈壁地区表面盐层50-60cm下的野生柴达木双层环伞菌子实体组织中分离，经人工正常大气压下纯化与培养得到。
2、菌落特征：在PDA培养基上形成明显的菌落，直径在560-660mm之间，菌落呈铁饼状，从中央辐射状向四周平展，菌落中心部有隆起，四周平展，呈草帽状；边缘整齐，生长初期乳白色，后期为微黄色或浅褐色，不透明，表面湿润光滑，参见附图1。
3、菌丝形态特征：菌丝生长初期为白色，生长后期出现微黄色。在显微镜下可观察到菌丝的微观结构，可观测到多条粗壮菌丝，参见图2。
4、生长特性：在温度18-23℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH分别为8和3，最适生长初始pH为5.0；菌丝萌芽阶段为4-7天。
5、菌丝体菌株的保存方法：在温度4℃下以PDA斜面试管形式保存。
6、分子鉴定：分别取直径约1.5cm的分离菌株扩大培养物接种于培养基中，培养20天，收集菌丝体，采用CTAB法进行菌丝体总DNA的提取。釆用设计的真菌核糖体基因间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4对供试DNA序列进行PCR扩增。
引物ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′；
引物ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。
将PCR产物测序后，ITS序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果输入GeneBank数据库进行BLAST比对分析，然后利用MEGA软件中的neighbor-joining算法构建NJ系统发育树，结果如图3所示。由图可知，柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08与Agaricus sinodeliciosus，Agaricus bitorquis及Agaricus subperonatus亲缘性最接近，其中结合分子鉴定的结果可知柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08与Agaricus sinodeliciosus亲缘性最高，因此我们将该菌株命名为柴达木中国美味蘑菇。
利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对上述菌株鉴定为担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam，并将其命名为柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08(Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam ZJU-TP-08)，该菌株已于2021年5月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2021511，保藏地址：中国武汉，武汉大学。该培养物的存活性由2021年5月18日检测完毕，结果为存活。
实施例2：柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08的液体培养及多糖的制备
1、柴达木中国美味蘑菇液体种子液的制备
待菌丝铺满试管或者培养皿(直径90mm)后，接种于液体培养基。接种铲在火焰上灼烧、杀菌，待其冷却后轻轻刮菌丝(横向、纵向分割菌丝)，尽量避开母种子块。将上述菌丝接种至一级种子液中。一级种子液培养基配方(g/L)：麦芽糖20g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.5g，维生素B1 1g。一块平板菌丝可接2-3瓶种子液。或者采用挖菌丝块的接种方法，用接种铲铲5-6块正方形菌丝体薄块接种于液体种子液中。置于摇床中进行摇瓶发酵培养。在23℃，150rmp下培养15～20d后，即得到液体种子，如图4所示。
为了菌丝大小生长均匀，可向培养液中加入15～25颗无菌的玻璃珠。
2、单因素试验优化的液体培养基组成条件
2.1不同碳源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵的影响试验
基础培养基为(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，KH2PO4 1，MgSO47H2O0.5，VB1 0.5。用玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖代替基础培养基中的碳源。接种量为10％，在23℃，150r/min下培养10d，考察不同碳源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵生物量和胞外多糖产量的影响。结果如图5所示。
分析：以生物量作为考察指标通过对碳源筛选(图5A)，柴达木中国美味蘑菇生长最适的碳源是果糖、其次是可溶性淀粉。
以胞外多糖的产量作为考察指标通过对碳源筛选，利用硫酸苯酚法检测发酵液多糖的分泌量(图5B)，以可溶性淀粉作为碳源，检测到的多糖浓度最大，其次是果糖及蔗糖。
考虑到可溶性淀粉本身是一种大分子多糖，可通过硫酸苯酚法检出，对结果产生极大的干扰，因此综合上述指标可得出，柴达木中国美味蘑菇液体发酵代谢最适的碳源是果糖。
2.2不同氮源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵的影响试验
基础培养基为(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，KH2PO4 1，MgSO47H2O0.5，VB1 0.5。酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、棉籽饼粉、尿素、硝酸钠、硫酸铵等量代替基础培养基中的氮源，每种氮源重复3次，接种量为10％，在23℃，150r/min条件下培养10d，考察不同氮源对柴达木中国美味蘑菇液体发酵生物量和胞外多糖产量的影响。结果如图6所示。
分析：以生物量作为考察指标通过对氮源筛选(图6A)可知，柴达木中国美味蘑菇生长最适的氮源是酵母提取物、其次是棉籽饼粉。
以胞外多糖的产量作为考察指标通过对氮源筛选，利用硫酸苯酚法检测发酵液多糖的分泌量(图6B)，柴达木中国美味蘑菇生长分泌胞外多糖最适的氮源是酵母提取物、其次是棉籽饼粉。
因此综合上述指标可得出，柴达木中国美味蘑菇液体发酵代谢最适的氮源是酵母提取物。
3、菌丝体生长培养基优化设计与验证
在碳源、氮源、单因素试验的基础上，对适合柴达木中国美味蘑菇菌丝体液体发酵培养基的组成成分进行优化并分析，以确定最佳培养基组分及含量，并通过试验加以验证。
表1.菌丝体生长培养基优化实验设计(单位:g/L)
Figure BDA0003325559910000091
在果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1初始浓度分别定为30、5、3、3、0.5g/L的条件下，由表1结果可知，由于果糖，VB1对生物量不显著，可将其添加量分别定为30g/L，0.5g/L。同时，由结果显示酵母提取物、KH2PO4、MgSO4对生物量影响显著，其中影响程度大小为：MgSO4>酵母提取物>KH2PO4，后续进行中心组合设计实验(CCD)进一步优化实验。
表2.培养基中心组合设计优化实验(单位:g/L)
Figure BDA0003325559910000101
在果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1初始浓度分别定为30、5、3、3、0.5g/L的条件下，进一步采用中心组合设计实验，对柴达木中国美味蘑菇生长的液体培养的培养基进行优化。由表2结果可知，在果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1浓度分别定为30、8、3、1、0.5g/L浓度下，最适合菌丝体生长，菌丝体生物量为5.91g/L。此外，在表2的基础上，由中心组合设计拟合的最适合菌丝体生长的培养基为果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1浓度分别为30、8、1.79、1.18、0.5g/L浓度下，生物量的预测值达到6.8g/L，本发明中柴达木中国美味蘑菇液体发酵菌丝体实测值高达6.93g/L。
而柴达木中国美味蘑菇以相同条件在常规的生长培养液(培养基组成：麦芽糖20g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L和VB1 0.5g/L)中制得的菌丝体生物量仅为1.58g/L。
4、胞外多糖富集培养基响应面优化设计与验证
在碳源、氮源、单因素试验的基础上，对适合柴达木中国美味蘑菇菌丝体液体富集胞外多糖培养基的组成成分进行优化并分析，以确定最佳培养基组分及含量，并通过试验加以验证。
表3.胞外多糖富集培养基优化实验设计(单位:g/L)
Figure BDA0003325559910000111
在果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1初始浓度分别定为50、9、0.5、7、0.1g/L的条件下，进一步采用Box–Behnken设计实验，对柴达木中国美味蘑菇生长的液体培养的培养基进行优化。由表3结果可知，在果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1浓度分别定为50、12.36、0.5、7、0.1g/L浓度下，最适合菌丝体产胞外多糖，胞外多糖产量为2.05g/L。此外，在表3的基础上，由Box–Behnken设计拟合的最适合菌丝体生长的培养基为果糖、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4、VB1浓度分别为43.2、11、9、7、0.1g/L浓度下，多糖的预测值达到2.23g/L，本发明中柴达木中国美味蘑菇液体发酵产胞外多糖实测值高达2.42g/L。
5、进一步分析胞外多糖成分，胞外多糖的单糖组成为岩藻糖:氨基半乳糖:鼠李糖:阿拉伯糖:氨基葡萄糖:半乳糖:葡萄糖:木糖:甘露糖:核糖:半乳糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖醛酸＝0.38:0.49:1:0.97:3.71:5.7:62.35:0.17:7.57:0.15:0.16:0.18:0.58。
实施例3：柴达木中国美味蘑菇ZJU-TP-08胞外多糖的分离纯化及神经保护活性的研究
1、柴达木中国美味蘑菇液体发酵多糖的分离纯化
发酵结束后，将发酵液在60℃下过滤蒸发至原体积的1/8倍。然后将4倍体积的95％乙醇倒进浓缩液中混合均匀，4℃放置1天。通过离心，得到的沉淀即为胞外粗多糖。粗多糖经脱色、脱蛋白、透析、冻干等处理后，在不同NaCl浓度(0、0.1、0.2、0.3M)、流速为0.8mL/min、体积为2倍的条件下，经DEAE-FF柱(φ2cm×30cm)进一步纯化。根据苯酚-硫酸法的结果，自动收集两个纯化的EPS馏分(10mL/管)，分别命名为中性多糖EPS-1和酸性多糖EPS-2。采用Sephacryl S-200凝胶过滤柱(φ1.6cm×70cm)对分离组分EPS-1和EPS-2进行纯化，使用超纯水为流动相以0.8mL/min的流速对分离组分进行洗脱。自动蒸馏器(10mL/管)收集，透析冻干。紫外光谱和Bradford的方法用于进一步检测蛋白质的存在。
2、多糖神经保护活性的研究
2.1Aβ1-42寡聚体的制备和鉴定：22.2μL冷却的HFIP加入到1mg Aβ1-42中，室温孵育60min。将肽-HFIP溶液放置冰上10min后，使HFIP在室温下挥发、过夜。真空冷冻干燥机干燥60min，除去所有的HFIP。冰上制作5mmol/L Aβ/100％DMSO：44.4μL新鲜脱水DMSO+1mg Aβ42。加2175.6μL DMEM/F12培养液稀释，使终浓度为200μmol/L，4℃孵育24h。4℃，14 000r/min离心10min。转移上清液至新管，即为寡聚体多肽母液，分装于4℃放置24h后，置于-80℃冰箱保存，制备得Aβ1-42寡聚体。
2.2细胞培养：人神经母细胞瘤细胞系SHSY-5Y细胞购自上海细胞生化所细胞库，采用含10％胎牛血清、1％青-链霉素(双抗)的DMEM/F12培养基在湿度为95％、二氧化碳为5％的条件下于37℃培养。培养皿中加入10ml培养基，培养2天后，1：2往下传代。
2.3细胞铺板：将上述培养好的细胞用1mL胰酶消化后，加入2mL的DMEM/F12完全培养基，缓慢吹打细胞，制成细胞悬浮液后，置于2mL离心管，继续吹打均匀成单个细胞。对细胞进行适当稀释后，取100μL的上述细胞稀释液(细胞浓度约为2～1*105CFU/mL)加入96孔板中，至于细胞培养箱(37℃、5％CO2)培养。
2.4Aβ1-42对SHSY-5Y细胞损伤造模：将上述制成的200μM Aβ1-42的寡聚物分别用培养基稀释成0、1、5、10、20、40、80、100μM的浓度，加入上述以贴壁培养8h的SHSY-5Y细胞中，继续培养24h后，用CCK8染色2h后，在450nm处测得吸光值。结果如图7所示。
由附图7可知，不同浓度的淀粉样蛋白Aβ1-42对人神经母瘤细胞SHSY-5Y的细胞活性的影响有显著的差异。随着淀粉样蛋白Aβ1-42浓度的增加人神经母瘤细胞SHSY-5Y的细胞活性逐渐下降，当Aβ1-42添加的终浓度为80μM时，培养24h后，与未处理相比，人神经母瘤细胞SHSY-5Y的细胞活性下降51.32％。后续实验将以Aβ1-42添加终浓度为80μM进行细胞损伤模型进行后续实验。
2.5三种多糖(中性多糖、酸性多糖、粗多糖)组分对损伤细胞的保护作用：当细胞生长满培养瓶70％-80％时，采用血球计数板计数。在96孔板每孔加入2～1*104个细胞。待细胞贴壁后，将终浓度分别为0、0.01、0.025、0.05、0.1mg/mL的多糖溶液或者对照品添加到细胞培养液中，并加入总浓度为80μM的Aβ1-42，终体积为100μL，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24h后，培养结束后再用CCK-8法检测细胞活力。于37℃、5％、CO2细胞培养箱内继续孵育2小时。酶标仪提前预热，测定OD450吸光值。结果如图8所示。
由附图8可知，以Aβ1-42处理未添加任何成分的SHSY-5Y细胞为对照组，添加终浓度的为0.01～0.1mg/mL的中性多糖、酸性多糖及粗多糖对Aβ1-42诱导损伤的SHSY-5Y细胞活力有一定的改善作用。其中，与对照组相比，终浓度为0.05mg/mL的酸性多糖对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用最佳，细胞活力提高23.44％。其次是终浓度为0.05mg/mL的粗多糖，粗多糖对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y诱导的细胞活力提高19.82％。
因此，柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08经液体发酵分泌的胞外多糖对Aβ1-42诱导损伤的人神经母瘤细胞有保护作用。其中，0.05mg/mL的酸性多糖对改善Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的效果最明显。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种柴达木中国美味蘑菇及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 703
<212> DNA
<213> 柴达木中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus var. Chaidam)
<400> 1
gtgtctctgt gatatgtttt ctagacgggt tgtagctggc tctttggagc atgtgcacac 60
ctgtctggac ttcattttca tccacctgtg caccttttgt agtctttttc aggtattgag 120
ggaagtggtc agcctatcag ctcttgctgg ataaggactt gcagtgtgta aacagtgctg 180
tccttgacct tgaccatgga atctttttcc tgtcagagac tatgttattc attatactct 240
gtagaatgtc attgaatgtt tttacgtggg cttatatgcc tatgaaaatt attatacaac 300
tttcagcaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt 360
aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcatcttg cgctccttgg 420
tattccgagg agcatgcctg tttgagtgtc attatattct caactcccca atactttgtt 480
gtaaaggaga gcttggattg tgggggcttg ctggccactt gcttggggtc agctcctctg 540
aaatgcatta gcagaaccgt ctgcgatctg ccacaagtgt gataatttat ctacactggc 600
gaggggattg ctttctgtga tgttcagctt ctaatcgtct caggacaatt tctcgaatgc 660
ttgacctcaa atcaggtagg actacccgct gaacttaagc ata 703

Claims (10)

1.一种柴达木中国美味蘑菇，其特征在于，该菌种命名为柴达木中国美味蘑菇亚种(Agaricus sinodeliciosus var.Chaidam)ZJU-TP-08，其保藏号为CCTCC NO:M 2021511。
2.如权利要求1所述的柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化后的柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌种接入种子培养基中培养，得到种子液；
(2)将种子液接种到生产培养基中，20～23℃的条件下培养，得到柴达木中国美味蘑菇食用菌菌丝体，所述生产培养基以每升重量份计包括：果糖30～32g，酵母提取物8～9g，磷酸二氢钾1.7～2g，无水硫酸镁1～1.5g，维生素B1 0.5～0.6g。
3.如权利要求2所述的柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化为将柴达木中国美味蘑菇亚种ZJU-TP-08菌种接种到PDA培养基上，在20～23℃的条件下培养15～25天，制得固体菌种。
4.如权利要求2所述的柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养基以每升重量份计包括：麦芽糖18～20g，葡萄糖9～11g，蛋白胨5～6g，磷酸二氢钾0.2～0.3g，无水硫酸镁0.4～0.5g，维生素B1 1～1.5g；种子液培养条件为在20～23℃、转速130～150rpm的条件下培养15～25天。
5.如权利要求2所述的柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，种子液以体积比5％～10％接种于生产培养基中，培养10～15天。
6.如权利要求2所述的柴达木中国美味蘑菇菌丝体的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生产培养基以每升重量份计包括：果糖30g，酵母提取物8g，磷酸二氢钾1.79g，无水硫酸镁1.18g，维生素B10.5g。
7.一种柴达木中国美味蘑菇多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将活化的如权利要求1所述的柴达木中国美味蘑菇菌种接入种子培养基中培养，得到液体菌种；
2)将液体菌种接种到发酵培养基中，20～23℃的条件下培养10～15天，收集发酵液，分离提取柴达木中国美味蘑菇胞外多糖，所述发酵培养基以每升重量份计包括：果糖42～45g，酵母提取物10～12g，磷酸二氢钾8～10g，无水硫酸镁6～8g，维生素B1 0.05～0.15g；
发酵液中胞外多糖的分离提取方法包括：将发酵液浓缩后进行醇沉，制得粗多糖；粗多糖依次经脱色、脱蛋白、层析进行纯化制得中性多糖及酸性多糖组分。
8.如权利要求7所述的柴达木中国美味蘑菇多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述发酵培养基以每升重量份计包括：果糖43.2g，酵母提取物11g，磷酸二氢钾9g，无水硫酸镁7g，维生素B1 0.1g。
9.如权利要求7所述的柴达木中国美味蘑菇多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述层析为采用DEAE-FF柱，依次收集超纯水洗脱的中性多糖和0.1M氯化钠溶液洗脱的酸性多糖。
10.如权利要求7-9任一项所述的制备方法制备的柴达木中国美味蘑菇多糖在制备治疗神经损伤的药物中的应用。
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