CN102986539B

CN102986539B - 杏鲍菇菌株kqh-1及制备方法

Info

Publication number: CN102986539B
Application number: CN201210503870.1A
Authority: CN
Inventors: 郭永红; 张微思; 罗孝坤; 罗晓莉; 张利菁
Original assignee: Kunming Fungus Food Co Ltd; Scientific Research Institute Of Supply And Marketing Cooperative Society Of Yunnan Province; Kunming Edible Fungus Institute Of China Federation Of Supply And Marketing Cooperatives
Current assignee: Kunming Edible Fungus Institute of China Federation of Supply and Marketing Cooperatives
Priority date: 2012-12-02
Filing date: 2012-12-02
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2032-12-02
Also published as: CN102986539A

Abstract

本发明公开了一种杏鲍菇菌株及制备杏鲍菇菌种的方法，属于微生物技术领域。本发明杏鲍菇<i>Pleurotus？eryngii</i>的菌株KQH-1已于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.6701。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于杏鲍菇的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。

Description

杏鲍菇菌株KQH-1及制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种杏鲍菇菌株KQH-1及制备杏鲍菇菌种的方法。

背景技术

杏鲍菇Pleurotuseryngii是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。菇体具有杏仁香味，肉质肥厚，口感鲜嫩，味道清香，营养丰富，能烹饪出几十道美味佳肴。还具有降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、增强机体免疫能力、防止心血管病等功效，极受人们喜爱。

在杏鲍菇栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。杏鲍菇菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于杏鲍菇的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率一般为60%-80%，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了杏鲍菇商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为杏鲍菇纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行杏鲍菇资源的保护应用不广泛。

发明内容

本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地杏鲍菇子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备杏鲍菇液体及固体优良菌种，为杏鲍菇资源保护提供优良菌种。

本发明采用的真菌是杏鲍菇PleurotuseryngiiKQH-1；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年10月11日；保藏登记入册的编号CGMCCNo.6701。

杏鲍菇的子实体单生或群生，菌盖宽2~12cm，初呈拱圆形，后逐渐平展，成熟时中央浅凹至漏斗形，表面有丝状光泽，平滑、干燥、细纤维状，幼时盖缘内卷，成熟后呈波浪状或深裂；菌肉白色，具有杏仁味，无乳汁分泌；菌褶延生，密集，略宽，乳白色，边缘及两侧平，有小菌褶；菌柄2~8cm至0.5~3cm，偏心生或侧生。杏鲍菇属于中低温结实性菌类。

本发明的技术方案：

①采集野生杏鲍菇子实体；

②组织分离或孢子分离；

③纯化菌株及菌株鉴定；

④生物学特性比较及生产性状比较；

⑤确定优良菌株；

⑥菌种生产及菌种应用；

经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的杏鲍菇液体菌种专用菌株KQH-1。

本发明真菌Pleurotuseryngii培养方法（以下为重量百分比）：

菌种分离纯化培养基：2%杏鲍菇下脚料、0.001%V_B1、2%葡萄糖、2%琼脂；

杏鲍菇菌株分离及鉴定方法：

1、将杏鲍菇子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得杏鲍菇分离试管种。

2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得杏鲍菇纯化试管种。

3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的杏鲍菇（Pleurotuseryngii）Identities=510/536（95%），Gaps=9/536（1%），分析确定分离得到的纯培养物为杏鲍菇菌丝体。

本发明杏鲍菇菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种。

液体菌种制备方法：

液体培养基配方为：5-10%麸皮、0.5-1%黄豆粉、0.5-1%麦芽糖、1-3%玉米粉，余下为水，pH自然。

1、将杏鲍菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。

2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。

3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/（v·min）；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为20-26℃；通气培养72-96小时，获得杏鲍菇液体菌种。

固体菌种制备方法：

固体培养基配方为：木屑75-90%、麸皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、杏鲍菇生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。

2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天.

3、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。

具体实施方式

实施例一：

1、将杏鲍菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得杏鲍菇分离试管种。

2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7天，获得杏鲍菇纯化试管种。

3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的杏鲍菇（Pleurotuseryngii）Identities=531/535（99%），Gaps=2/535（0%），分析确定分离得到的纯培养物为杏鲍菇菌丝体

4、将PleurotuseryngiiKQH-1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18℃下培养7天，获得试管种。

5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为5%麸皮、0.5%黄豆粉、0.5%麦芽糖、1%玉米粉，余下为水，pH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。

将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/（v·min）；搅拌转速为120r/min；接种量为5%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为22℃；通气培养96小时，获得杏鲍菇液体菌种。

实施例二：

菌种制备的步骤与实施例一相同。

1、将杏鲍菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得杏鲍菇分离试管种。

2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养6天，获得杏鲍菇纯化试管种。

3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的杏鲍菇（Pleurotuseryngii）Identities=531/535（99%），Gaps=2/535（0%），分析确定分离得到的纯培养物为杏鲍菇菌丝体。

4、将PleurotuseryngiiKQH-1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养6天，获得试管种。

5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为6%麸皮、0.6%黄豆粉、0.6%麦芽糖、1.2%玉米粉，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种。

将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/（v·min）；搅拌转速为140r/min；接种量为8%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为24℃；通气培养84小时，获得杏鲍菇液体菌种。

实施例三：

1、将杏鲍菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得杏鲍菇分离试管种。

2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得杏鲍菇纯化试管种。

4、将PleurotuseryngiiKQH-1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。

5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为10%麸皮、0.5%黄豆粉、0.5%麦芽糖、1%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。

将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑75%、麸皮20%、磷肥1%、石膏1%、杏鲍菇生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养15天，获得杏鲍菇固体菌种。

实施例四：

5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为8%麸皮、0.5%黄豆粉、1%麦芽糖、1%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。

将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑90%、麸皮5%、磷肥1%、石膏1%、杏鲍菇生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于20℃培养20天，获得杏鲍菇固体菌种。

Claims

1.一种杏鲍菇菌株，其特征在于所述杏鲍菇Pleurotuseryngii的菌株为KQH-1，该菌株的保藏号为CGMCCNO.6701。

2.一种权利要求1所述杏鲍菇菌株制备菌种的方法，其特征在于：

A、将杏鲍菇Pleurotuseryngii菌株KQH-1的菌丝体接种到试管PDA培养基斜面上，18~24℃下培养5~7天，获得试管菌种；

B、将液体培养基置于500ml三角瓶中，每瓶装200ml；将试管菌种接种到液体培养基中，于20~26℃下摇床培养，转速为120~160rpm，培养时间5~7天，获得一级液体菌种；液体培养基为5~10%麸皮、0.5~1%黄豆粉、0.5~1%麦芽糖、1~3%玉米粉，余下为水，pH自然；

C、将固体培养基装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，固体培养基为木屑75~90%、麸皮5~20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然；120℃灭菌60分钟后，将一级液体菌种接种到固体培养基上，接种后置于20~26℃培养15~20天，直到菌丝长满，获得杏鲍菇固体菌种。