CN103858668B - 一种绵毛蘑菇菌株及菌种制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种绵毛蘑菇菌株及菌种制备方法，属于微生物技术领域。本发明的菌株<i>Agaricus？vaporarius</i>？KXJ（蘑-8）已于2013年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？NO.8119。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于绵毛蘑菇的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。

Description

一种绵毛蘑菇菌株及菌种制备方法
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种绵毛蘑菇菌株及菌种制备方法。
背景技术
绵毛蘑菇（Agaricusvaporarius），属于伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，主要分布于新疆、内蒙古等地，夏末至秋季在阔叶或混交林地上大量群生。绵毛蘑菇营养丰富，富含人体必需氨基酸、矿物质、维生素和多糖等营养成分，是一种高蛋白、低脂肪的营养保健食品。
在绵毛蘑菇栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。绵毛蘑菇菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于绵毛蘑菇的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了绵毛蘑菇商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为绵毛蘑菇纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行绵毛蘑菇资源的保护应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用新疆原产地绵毛蘑菇子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备绵毛蘑菇液体及固体优良菌种，为绵毛蘑菇资源保护提供优良菌种。
本发明采用的真菌是绵毛蘑菇AgaricusvaporariusKXJ(蘑-8)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年8月26日；保藏登记入册的编号CGMCCNO.8119。
绵毛蘑菇的子实体由菌盖、菌褶、菌柄三部分组成，单生、散生或簇生，其子实体中型至大型。菌盖直径7~20cm，新鲜时污白色、蛋壳黄色，初期半球形，后渐平展，边缘内卷；菌肉肥厚，白色至浅红褐色，如遇铁器伤害迅速变为红色；菌褶离生，致密而不等长，初浅粉色后变黑褐色至黑色；菌柄长3~10cm，粗3-5cm，上部柱形、基部近梭形，菌柄颜色近盖色，菌柄上部表面布有银灰色光泽的纤维质，双层菌幕，外菌幕在菌柄基部形成托状；孢子印褐红色至咖啡色；担子四孢子梗，具棒状囊体；孢子棕色，内含油滴，短椭圆形，4.988~7.254×5.429~8.426μm。
本发明的技术方案：
①采集野生绵毛蘑菇子实体；
②组织分离或孢子分离；
③纯化菌株及菌株鉴定；
④生物学特性比较及生产性状比较；
⑤确定优良菌株；
⑥菌种生产及菌种应用；
经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的绵毛蘑菇液体菌种专用菌株KXJ（蘑-8）。
本发明真菌AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）培养方法(以下为重量百分比):
菌种分离纯化培养基：2%绵毛蘑菇下脚料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%琼脂；
绵毛蘑菇菌株分离及鉴定方法：
1、将绵毛蘑菇子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得绵毛蘑菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得绵毛蘑菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的绵毛蘑菇(Agaricusvaporarius)Identities=539/544(99%)，Gaps=4/544(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为绵毛蘑菇菌丝体。
本发明绵毛蘑菇菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种。
液体菌种制备方法：
液体培养基配方为：糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%，KH2PO40.25%，余下为水，pH自然.
1、将绵毛蘑菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min)；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为20-26℃；通气培养72-96小时，获得绵毛蘑菇液体菌种。
固体菌种制备方法：
固体培养基配方为：棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。
1、将绵毛蘑菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。
具体实施方式
实施例一：
1、将绵毛蘑菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得绵毛蘑菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7天，获得绵毛蘑菇纯化试管种.
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的绵毛蘑菇(Agaricusvaporarius)Identities=539/544(99%)，Gaps=4/544(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为绵毛蘑菇菌丝体。
4、将AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18℃下培养7天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%，KH2PO40.25%，余下为水，pH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min)；搅拌转速为120r/min；接种量为5%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为20℃；通气培养96小时，获得绵毛蘑菇液体菌种。
实施例二：
菌种制备的步骤与实施例一相同。
1、将绵毛蘑菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于20℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得绵毛蘑菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于20℃下培养6天，获得绵毛蘑菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的绵毛蘑菇(Agaricusvaporarius)Identities=539/544(99%)，Gaps=4/544(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为绵毛蘑菇菌丝体。
4、将AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，20℃下培养6天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%，KH2PO40.25%，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min)；搅拌转速为140r/min；接种量为8%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为22℃；通气培养84小时，获得绵毛蘑菇液体菌种。
实施例三：
1、将绵毛蘑菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得绵毛蘑菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养5天，获得绵毛蘑菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的绵毛蘑菇Agaricusvaporarius)Identities=539/544(99%)，Gaps=4/544(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为绵毛蘑菇菌丝体。
4、将AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%，KH2PO40.25%，余下为水，pH自然。于24℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于24℃培养15天，获得绵毛蘑菇固体菌种。
实施例四：
1、将绵毛蘑菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得绵毛蘑菇分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得绵毛蘑菇纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的绵毛蘑菇(Agaricusvaporarius)Identities=539/544(99%)，Gaps=4/544(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为绵毛蘑菇菌丝体。
4、将AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%，KH2PO40.25%，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养20天，获得绵毛蘑菇固体菌种。

Claims (2)

1.一种绵毛蘑菇菌株，其特征在于所述绵毛蘑菇菌株为AgaricusvaporariusKXJ蘑-8，该菌株的保藏号为CGMCCNO.8119。
2.一种权利要求1所述绵毛蘑菇菌株制备菌种的方法，其特征在于：
A、将AgaricusvaporariusKXJ蘑-8菌株的菌丝体接种到试管PDA培养基斜面上，于18~24℃下培养5~7天，获得试管菌种；
B、将液体培养基置于500ml三角瓶中，每瓶装200ml；将试管种接种到液体培养基中，于20~26℃下摇床培养，转速为120~160rpm，培养时间5~7天，获得一级液体菌种；液体培养基为糊精3%、酵母粉0.2%、MgSO4·7H2O0.5%、KH2PO40.25%，余下为水，pH自然；
C、将固体培养基装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，固体培养基为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然；压紧封口后在120℃灭菌60分钟后，将一级液体菌种接种到固体培养基上，接种后置于20~26℃培养15~20天，直到菌丝长满，获得绵毛蘑菇固体菌种。
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