CN102078027B - 纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法，属于应用微生物技术领域。其技术方案是将充分浸泡(3d-5d)的废弃烟叶液，按5％-15％的量(V/V)与琼脂(2.5g/100mL)混合，不另添加任何附加成分和调节pH值，在0.11-0.13MPa下25-35分钟高压灭菌后(15磅/英吋230分钟灭菌后)，倒双层平皿，制备成纯烟叶浸提液固体平板。按常规将烟叶样品梯度稀释后，取0.2mL于纯烟叶浸提液固体平板中，涂布均匀后置50℃-60℃恒温箱培养至菌落出现。较真实地反映能够在烟叶表面生长的高温微生物的数量和种类，该方法分离的微生物适合于应用在烟叶烘烤时改良烟叶品质之用。
Description
技术领域
本发明提供一种纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法，属于应用微生物技术领域。
背景技术
微生物分离方法是获得纯培养微生物的重要技术。微生物的分离方法通常包括培养基组成和分离培养温度。按凝固剂含量的多少将培养基分为固体、半固体和液体培养基。分离温度也按培养温度的高低分为低温、中温和高温。随着烟草工业的发展，微生物技术在烟草行业的应用已十分广泛。微生物应用技术渗透到烟草农业栽培过程、烟叶醇化增香等卷烟工业的前期工艺过程。
据不完全统计，迄今从烟叶中分离到的可培养，能改善烟叶品质的微生物有：奇异产碱菌(Alcaligenes paradoxus Uchida&Maeda，1976)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformilsUchida&Maeda，1976)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae Giovannozzi，1959)、噬烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans R.Brandsch，2001)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans Izquierdo T.A.，1982；Caponigro V.，1979)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium王革，2003)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides王革，2003)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus王革，2003)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis王革，2003专利)、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.Lawrence E.Gravely，1978)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.Giovannozzi，1957；Izquierdo T.A.，1982)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Gutierrez R.，1983)、烟草微球菌(Micrococcus nicotianaeGiovannozzi，1947)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.Wada E.，1958；Izquierdo T.A.，1982)、烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae孙君社，2004)、恶臭假单胞杆菌(Pseudomonasputida Edwards W.B.，1983；Civilini，Metal，1997)、烟草德巴利菌(Debaryomycesnicotianae Giovannozzi，1947)、刺孢小克汗霉菌(Cunninghamella echinulata Uchida S.et al，1983)、丝核薄膜草菌(Pellicularia filamentosa Uchida S.et al，1983)、酵母(Yeast C.Enders，1947)、黄色闫氏菌(Yania flava Dino Parente et al，2007)。前人虽然已应用不同培养基和培养分离技术从烟叶表面分离到大量微生物类群。但在烟叶表面微生物的分离方法中，培养基成分通常是由牛肉膏、蛋白胨等营养物质和氯化钠等无机盐和水组成，使用烟叶浸提液只是作为附加成分之一，培养温度通常是28℃左右。
虽然实验表明使用酶制剂能够获得改善烘烤烟叶品质的结果，并且具有作用点单一、作用浓度容易控制的优点，但是在烘烤阶段使用酶制剂也存在一些问题。首先，目前市面上的商品酶多半是常温酶，温度耐受较差，不适合在烘烤条件下应用。其次，一般高温酶市场价格比较昂贵，应用成本太高，经济上不合算。再者，从本质上看，酶也是一种蛋白质，对于蛋白质含量本来就高的上部烟叶再添加蛋白质，没有道理。从实际情况看，鲜烟叶是一个微生物生存竞争十分激烈的环境，酶的加入可能充其量也是作为某些微生物的营养成分被利用。
烟草调制是烟叶采收后的一个重要加工环节，其可控性非常强，对利用微生物改进提高烟叶品质非常有利。醇化烟叶中微生物资源丰富，代谢功能复杂多样，而且易于培养再生，因此，使用不同分离方法，筛选开发利用对烟草品质有利的微生物具有很大的应用前景。
发明内容
本发明目的在于发明一种不添加任何附加成分，直接用纯烟叶浸提液(10％±5％，W/W)的固体培养基，在50℃-60℃培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带的、具有活性的高温菌株——YN114、YN105、YN91，YN114等菌株，使用这些菌株可生产微生物制剂。
本发明纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法，是将充分浸泡3-5天废弃烟叶液作为烟叶浸提原液，以体积比计，烟叶浸提原液/自来水按5％-15％的量(V/V)与琼脂(2.5g/100mL)混合，不另添加任何附加成分和调节pH值，在0.11-0.13MPa下25-35分钟高压灭菌后(15磅/英吋2相当于121.3℃，25-35分钟高压灭菌后)，倒双层平皿，制得纯烟叶浸提液固体平板；
按常规将烟叶样品梯度稀释后，取0.2mL放入纯烟叶浸提液固体平板中，涂布均匀后置50℃-60℃恒温箱培养至菌落出现，分离筛选后得到在高温50℃-60℃还具有生理活性的烟叶表面微生物菌株——YN113、YN105、YN104、YN91，YN114菌株。
所述纯烟叶浸提液原液是指废弃烟叶充分浸泡2-3天的浸提液，其用量为与自来水的体积比为5％-15％。
所述的高温为涂布待分离样品平皿的培养温度是50℃-60℃。
产淀粉酶菌株YN91的优化培养基为：小麦麸皮1.5％，尿素0.5％，NaCl 0.5％，工艺参数为发酵温度50℃，时间18h，搅拌速度125rpm。
产蛋白酶菌株YN114的优化培养基为：可溶性淀粉0.5％，牛肉膏1.0％，CaCO30.3％，工艺参数为发酵温度43℃，时间36h，搅拌速度125rpm。
适合于真实反映烟叶表面生长高温微生物的分离培养，应用于烟叶烘烤用微生物的分离。
本发明基本原理是：在自然界中烟叶微生物的生存和生长环境就是烟叶，不存在普通培养基中的营养成分和无机盐成分，其生存的pH值范围应该与烟叶的pH值范围相当。烟叶烘烤时的温度最高约为67℃，而一些烟叶高温菌的生长温度可达70℃。所以用本发明方法分离的微生物绝大多数是芽孢杆菌属的细菌，菌落形态类型比较单一，并且以枯草芽孢杆菌(B。subtilis)的菌落形态特征为主。
本发明菌株YN91和菌株YN114进行发酵工艺参数优化实验。产淀粉酶菌株YN91的优化培养基为：小麦麸皮1.5％，尿素0.5％，NaCl 0.5％。工艺参数为发酵温度50℃，时间18h，搅拌速度125rpm。酶活水平从2960U/mL提高到6960U/mL。产蛋白酶菌株YN114的优化培养基为：可溶性淀粉0.5％，牛肉膏1.0％，CaCO30.3％。工艺参数为发酵温度43℃，时间36h，搅拌速度125rpm。酶活水平从7.57(U/mL)提高到28.25(U/mL)。
经检测，采用本发明方法筛选出的菌株YN114、YN113、YN105、YN91，YN104进行了形态学、生理生化特性和分子生物学特性研究，结果表明：菌株YN91为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株，YN114、YN105和YN104均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。
菌株YN114、YN113、YN105和YN104属于枯草芽孢杆菌。菌体呈单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。菌株通常以孢子形式存在，有耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化等特点；能产生多种酶类(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)及营养物质(如多种氨基酸和维生素类物质)；菌体生长过程中产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；菌体自身可合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，也能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素。
枯草芽孢杆菌呈单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌通常以孢子形式存在，有耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化等特点；能产生多种酶类(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)及营养物质(如多种氨基酸和维生素类物质)；枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素大量研究表明在打叶复烤后长达1-2年的烟叶醇化期，微生物起着非常重要的作用。
为什么要使用枯草芽孢杆菌？因为微生物主要代谢途径基本上是相似的，所以大多数微生物对烟叶品质的改善都有一定效果。而微生物的生产能力是靠菌株来实现，每个菌株有其特殊的品质能力，所以改善烟叶品质菌株的筛选工作是一个长期复杂的工作，并非简单重复的劳作，需要长期坚持进行下去。从安全有效的角度出发，在将来实际的生产应用中，本项目组极力推荐使用属于枯草芽孢杆菌的菌株(strain)。
培养基是人工配制提供微生物生长繁殖的基质，培养温度是选择菌株生物学特异性的重要条件。为了获得实际能够在烟叶上生存和繁衍生息，并能在高温烘烤条件下具有代谢活力的微生物，本发明在分离筛选生产菌株时使用纯烟叶浸提液固体培养基和高温(大于40℃)培养条件控制，有效的摒弃了大多数不能在此条件下生长的微生物，迅速筛选到了所需要的生产菌株。虽然在纯烟叶浸提液固体培养基上，微生物的数量比在其他营养培养基上要低数百倍，但它可能更真实地反映了烟叶上微生物存在的实际数量，可以作为烟叶微生物数量分布的参考值。使用纯烟叶浸提液固体培养基和高温培养条件是分离烘烤条件下具有改善烟叶特异品质能力的有效筛子，推荐给烟草微生物同行使用。
本发明使用10％±5％，的纯烟叶浸提液固体培养基分离筛选产生淀粉酶和蛋白酶的高温型菌株，试验菌株的最适生长和产酶温度均大于40℃，可保证在烘烤高温条件下微生物还具有足够高的生物活性，能利用和分解烟叶中的淀粉和蛋白质等干物质，并通过生理代谢活动产生特色香醇味。
大量研究表明枯草芽孢杆菌(B.subitilis)菌株已广泛应用于食品、酿造、医药、饲料、肥料等生产中，具有较好的安全性，对筛选菌株的生理生化特征进行的研究表明，这些菌株对降低TSNA有一定作用。微生物菌剂生产工艺简便易行，产品使用方法合理安全，具有多种改善烟草品质的生理活性。
本发明采用细菌培养基、马丁氏培养基、高氏培养基及不同浓度的纯烟叶浸提液培养基，在37℃、50℃、60℃温度条件下，从醇化2年的K326品种C3F等级(中部烟叶等级)和B2F等级(上部烟叶等级)的烟叶获得菌落形态特征差异明显的菌株386株。在25-55℃温度筛选到蛋白酶产生菌72株，淀粉酶产生菌42株。对活性较高的蛋白酶产生菌株和淀粉酶产生菌株进行了拮抗实验，获得6组产蛋白酶和产淀粉酶无拮抗作用的菌株组合。
本发明淀粉酶产生菌中菌株YN105酶活为12800U/mL，菌株YN91的酶活为2960U/mL，菌株YN104的酶活为800U/mL。蛋白酶产生菌中菌株YN114酶活为7.57(U/mL)，菌株YN113酶活为6.10(U/mL)，菌株YN109酶活为3.96(U/mL)，菌株YN104酶活为0.46(U/mL)。
本发明重点对复筛到的YN114、YN104、YN105和YN91菌株进行了生物学特性研究，结果表明除YN91属恶臭假单胞菌外，其余3株菌均为枯草芽孢杆菌。菌株的适宜生长温度均大于40℃，可在烘烤过程中新陈代谢改善烟叶品质。
本发明直接从纯烟叶浸提液使用固体平板分离出高温烟叶表面的微生物，分离到烟叶烘烤条件下具有生理活性的高温烟叶表面微生物菌种，能够在烘烤时改善烟叶工业可用性品质。
本发明分离到的枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种已被广泛应用于食品、酿造、饲料、医药、微生物肥料等领域的工业生产用菌种，其安全性非常可靠。
附图说明
以下结合实例对本发明作进一步详述。
图1采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN114的电镜照片。
图2采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN91的电镜扫描照片。
图3采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN105扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1：本发明菌株YN91和菌株YN114、YN113、YN104的发酵工艺参数。菌株YN91的发酵培养基为：小麦麸皮1.5％，尿素0.5％，NaCl 0.5％。发酵工艺参数：温度50℃，时间18h，搅拌速度125rpm。酶活水平在6960U/mL左右。菌株YN114的发酵培养基为：可溶性淀粉0.5％，牛肉膏1.0％，CaCO30.3％。发酵工艺参数：温度43℃，时间36h，搅拌速度125rpm。酶活水平在28(U/mL)左右。菌株YN113和YN104的发酵工艺参数与YN114相同。
具体方法如下：培养基配制，取浸泡2-3天的废弃烟叶浸提原液5-15mL于500mL三角瓶中，添加自来水95-85mL，加2.5g琼脂粉，pH自然，摇匀后，用15磅高压灭菌30分钟。培养基灭菌结束后，冷至60℃时，趁热分别倒双层皿，制成固体培养基备用。按微生物分离常规方法将不同稀释度的烟叶样品0.2mL涂布平皿后，置50℃恒温箱培养48h，检查菌落出现情况。用本方法分离到50℃-60℃还具有生理活性的微生物菌株，则得到本发明所菌株YN91和菌株YN114、YN113、YN104、YN105。
使用菌株YN114和菌株YN91，在瑞士比欧50L全自动发酵罐上，进行工艺参数优化实验。
使用本发明制备的纯烟叶浸提液培养基与细菌培养基、马丁氏培养基考察了醇化期K326品种的C3F等级(中部烟叶等级)和B2F等级(上部烟叶等级)烟叶中微生物的数量及主要类群。结果表明：①纯烟叶浸提液培养基100％为细菌，平均数量为37cfu×103/g。②细菌培养基：细菌占95.43％，真菌占1.42％，放线菌占3.15％。平均数量分别为细菌94cfu×104/g，真菌14cfu×103/g，放线菌31cfu×103/g。③马丁氏培养基：细菌占96.95％，真菌占0.83％，放线菌占2.22％。平均数量分别为细菌17.5cfu×105/g，真菌15cfu×103/g，放线菌40cfu×103/g。
从陈化烟叶获得的微生物数量情况看，三类微生物在醇化烟叶中的数量分布状况是：细菌(97.5％)＞放线菌(1.79％)＞真菌(0.75％)，与国内外研究报道的结果近似。所不同的是用纯烟叶浸提液培养基分离培养仅有细菌生长，且数量比其它培养基低1-2个数量级，较真实地反映了烟叶表面微生物的存在状况。
实施例2：使用本发明方法分离的高温菌菌株YN114在固体培养基上形成乳白色菌落，不透明，边缘不整齐，中央微隆，质地褶皱，通常比较干。菌体长平均约为3.3μm，宽平均约为1.4μm，电镜照片如图1。最适生长温度50℃，产生蛋白酶，发酵液的蛋白酶活力达到28.25U/mL。
实施例3：使用本发明方法分离的菌株YN91在固体培养基上形成乳白色菌落，不规则，不透明，质地褶皱，边缘呈波浪状。菌落形态随培养基的干湿度变化较大，潮湿时，菌落易扩散呈粘质，表面呈奶油状，但大多数情况下，菌落粗糙有皱褶，中央突出，边缘不规则。菌体生长迅速，在油镜下观察，YN91透明发亮，呈短杆状，不产芽孢，2.6μm-1.1μm，电镜照片见图2。菌株YN91属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas pridus)。产生淀粉酶，最适生长温度55℃培养30小时，发酵液的酶活为7840U/mL。
本发明在发酵结束前向发酵液中添加0.1％-0.5％的MnSO4搅拌15分钟后立即放罐、用桶分装后密封即成微生物制剂成品。由于此工艺中发酵液全部被制成制剂，所以该发酵工艺不产生任何污染物。成品使用时，用清水稀释1倍后喷施。使用量：10000mL/亩。
从总体上看，就祥云县云烟87品种采烤前1天喷施处理的试验样品而论，菌2和菌4制剂处理烟叶样品的整体质量稍好于对照样品，其它处理烟叶样品整体质量差于对照样品。
表1：生物技术改善烟叶品质研究样品的感官质量评吸结果
本发明对实验室标准烘烤设备处理样品进行感官评吸结果如表2。表2表明3种菌剂对改善烟叶吃味有明显的改善作用，特别是回味改变明显。
表2：生物技术改善烟叶品质研究样品的感官评吸结果
在实验室对优化的3种酶制剂及3种菌剂菌种进行纯化、复壮及发酵改进后，在大理州宾川县平川镇和大营镇进行了20亩规模的大田实验。实验分不同品种(红大、K326)重复试验及验证工作，随机抽取14个烟叶样品进行内在化学成分测定和感官评吸。结果如表3。由表3可看出：3种菌剂对改善烟叶吃味有明显的作用，主要是回味改变明显，与上年度的实验室试验结果相吻合。特别是菌2、菌3处理烟叶在改变回味的同时，综合感官质量有明显提升。
表3：生物技术改善烟叶品质研究样品的感官评吸结果
2.5.3内在化学成分分析结果
本发明项目组送烟叶样品共65个给红塔集团技术中心检测。其中祥云县云87品种采烤前10天喷施制剂样品27个，采烤前1天喷施制剂样品27个；巍山县K326品种采烤前1天喷施制剂样品8个；宾川县红大品种采烤前1天喷施制剂样品3个。所有样品都进行烟叶常规化学成分分析。表2.5.3-1是祥云县10天喷施处理样品烘烤后的化学成分分析结果。
表2.5.3-1：生物技术改善烟叶品质研究样品的内在化学成分分析结果(10d)
从表2.5.3-1可以看出，与对照相比，各菌制剂处理组的烟碱含量均有所降低，菌2组最低为2.32％。总糖也均低于对照，最小的是菌6组，为33.69％。还原糖含量均高于对照，最大为菌3组的32.40％。总氮含量多数试验组低于对照，最低是菌3组为1.94％。钾含量与对照相当，最高是菌5、菌6组为1.15％，最低是菌1组的1.03％。氯含量均高于对照。糖/碱比值多数试验组都高于对照，最高的是菌2组，为14.98。最低是菌5组为13.09。氯/碱比值多数略高于对照，最高为菌2组的0.90，最低为菌3组的0.79。钾/氯比值除菌6的5.59略高于对照外均比对照低。
表2.5.3-2：生物技术改善烟叶品质研究样品的内在化学成分分析结果(1d)
表2.5.3-2是采收烘烤前1天微生物制剂处理后烘烤烟叶的常规化学成分分析结果。从表中可看出，烟碱含量除菌6组3.38略高于对照外外，其余均低于对照，最低是菌1，为3.03％。总糖含量除菌1组36.60％高于对照外，其它处理组均低于对照，最低为菌1处理组的3.03％。还原糖含量除菌5处理组34.93％高于对照外，其余均低于对照。总氮含量多数高于对照，最高是菌3组2.04％，最低是菌1组1.87％。钾含量均高于对照。氯含量均低于对照，最低是菌1处理组，为0.31％。糖/碱比值最高是菌1处理为12.18，最低的菌6处理组是9.86。氯/碱比值均高于对照，最高为菌2处理组的0.65。钾/氯比值远高于对照。化学成分分析结果表明各处理组对烟叶的内在成分均有一定作用，采收前1天处理似乎更好。
用云南农业大学烟田上部烟处理后，用实验室标准烘烤设备烘烤的烟叶样品内在化学成分分析结果如表2.5.3-3。从表2.5.3-3可看出，实验室选择基础上得到的3种菌剂均对烟叶的烟碱、总糖、总氮有较大幅度的改变，初步表明微生物制剂对烟叶烘烤的内在化学成分的改变总体上是向好的方向转变，变化比较协调。
表2.5.3-3生物技术改善烟叶品质研究样品的内在化学成分分析结果
由表2.5.3-4可以看出：3种微生物菌剂处理对烟叶的总糖及还原糖有较大的降低作用，菌2、菌3的降解作用较为明显。
通观三年的实验结果，假设这些变化(无论正负)都看作是微生物制剂的作用结果，那么可以认为：总体上微生物制剂对烘烤烟叶的内在化学品质有较大的向更协调方向转化的正相关作用。
表2.5.3-4：生物技术改善烟叶品质研究样品的内在化学成分测定结果
实验结果表明该培养分离方法分离得到的烟叶醇化菌株具有在40℃以上高温生长的特征。该培养方法用试验证明自然界中的烟叶上确实存在能够在烘烤烟叶温度条件下繁衍生息的微生物，这些微生物绝大多数是芽孢杆菌属的细菌，菌落形态类型比较单一，并且以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌落形态特征为主。表明使用纯烟叶浸提液固体平板法分离高温型烟叶醇化菌的方法切实可行。
本发明使用烟叶浸提液培养基、细菌培养基和马丁氏培养基考察了K326C3F和B2F烟叶中微生物的数量及主要类群。结果表明：①烟叶浸提液培养基100％为细菌，平均数量为37cfu×103/g。②细菌培养基：细菌占95.43％，真菌占1.42％，放线菌占3.15％。平均数量分别为细菌94cfu×104/g，真菌14cfu×103/g，放线菌31cfu×103/g。③马丁氏培养基：细菌占96.95％，真菌占0.83％，放线菌占2.22％。平均数量分别为细菌17.5cfu×105/g，真菌15cfu×103/g ，放线菌40cfu×103/g。从陈化烟叶获得的微生物数量情况看，三类微生物在醇化烟叶中的数量分布状况是：细菌(97.5％)＞放线菌(1.79％)＞真菌(0.75％)，与国内外研究报道的结果近似。所不同的是用纯烟叶浸提液培养基分离培养仅有细菌生长，且数量比其它培养基低2个数量级。从中分离到淀粉酶和蛋白酶产生菌株YN114、YN105、YN91，YN104，YN113等。
1.菌株YN91鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida(HM446003)
表3.12菌株YN91的生理生化特征
菌株YN9116SrDNA核苷酸碱基序列：
CGAATATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCT
CCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTCC
GAAAGGAGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATC
AGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTG
GTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
GGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGA
TTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA
GAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA
TTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGG
GAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGA
AACGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAG
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACT
AGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACG
GCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT
CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCC
TTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT
CCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGC
CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACA
CACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGA
TCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAG
AATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCA
CCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTG
2.菌株YN105鉴定为Bcillus subtilis
菌株YN105的16SrDNA核苷酸碱基序列：
TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGGGAGTAAC
ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTT
TGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT
AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC
CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGT
TAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC
TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAA
GGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGA
AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG
ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGC
GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAG
GGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA
GACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC
AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGG
GGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGC
AACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGA
CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTG
CTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCA
GTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC
CGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCG
AAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG
3.菌株YN114鉴定为Bcillus subtilis(HM214542)
菌株YN114的生理生化特征
菌株YN11416SrDNA核苷酸序列：
TTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA
AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTC
ACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAA
CCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA
GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTA
GAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA
CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCG
AAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGC
GTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA
GTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTA
AGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTAT
CTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCG
CCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCAC
TCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGG
CTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAA
CGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTA
GGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTT
TACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGC
GGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTATTAGTGTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGG
CCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAAC
TAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTAATGTTTGAA
CCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTA
CAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCC
CATCTGTCCGCTCGACTTGCA
Claims (1)
1.一种纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法，其特征在于：将充分浸泡3-5天废弃烟叶液作为烟叶浸提原液，以体积比计，烟叶浸提原液/自来水按5%—15%的量配制为混合液，将100ml混合液与2.5g琼脂混合，不另添加任何附加成分和调节pH值，在0.11-0.13MPa下25-35分钟高压灭菌后，倒双层平皿，制得纯烟叶浸提液固体平板；
按微生物分离常规方法将不同稀释度的烟叶样品0.2mL涂布平皿后，涂布均匀后置50℃—60℃恒温箱培养至菌落出现，分离筛选后得到在高温50℃—60℃还具有生理活性的烟叶表面微生物菌株——YN113、YN105、YN104、YN91，YN114菌株；
所述的高温为涂布待分离样品平皿的培养温度是50℃—60℃；
所述的产淀粉酶菌株YN91的优化培养基为：小麦麸皮1.5%，尿素0.5%，NaCl 0.5%，工艺参数为发酵温度50℃，时间18h，搅拌速度125rpm，
所述产蛋白酶菌株YN114的优化培养基为：可溶性淀粉0.5%，牛肉膏1.0%，CaCO30.3%，工艺参数为发酵温度43℃，时间36h，搅拌速度125rpm，
所述菌株YN91为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株；所述菌株YN113、YN114、YN105和YN104均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
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