CN110423694A - 一株人工驯化的黑牛肝菌菌株hz18006及其ssr标记指纹图谱 - Google Patents

一株人工驯化的黑牛肝菌菌株hz18006及其ssr标记指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株人工驯化黑牛肝菌菌株HZ18006及其SSR标记指纹图谱。该菌株具有明显提高子实体产量的能力，已于2019年3月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.17080。实验室和生产实践证实，本发明菌株活力强，遗传特性稳定，后期出菇速度快且出菇整齐，生长速度快，满足大面积工厂化栽培需要，在最佳收获期可以一次完成采收，极大地简化了采收程序和劳动力；还具有子实体栽培方法简便，管理粗放，出菇快，产量高等优良的生物学生长特性。HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱由10对SSR标记组成，结合准确定量的毛细管电泳荧光检测方法，可用于HZ18006菌株的快速鉴别。

Description

一株人工驯化的黑牛肝菌菌株HZ18006及其SSR标记指纹图谱
技术领域
本发明属于食用菌人工育种和菌种品系鉴定技术领域，具体是涉及一株经人工驯化获得，具有优良生物学特性、适应工厂化栽培条件的黑牛肝菌新菌株。同时，本发明还涉及一种能够准确鉴别所述黑牛肝菌新菌株的特异性SSR标记指纹图谱。
背景技术
黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)是牛肝菌目Boletales小牛肝菌科Boletinellaceae脉柄牛肝菌属Phlebopus暗褐网柄牛肝菌的俗称。在云南西双版纳傣族自治州，红河哈尼族彝族自治州，德宏傣族景颇族自治州，临沧，普洱等地区以及泰国深受消费者喜爱，是名贵食用菌。黑牛肝菌营养方式复杂，兼有腐生、弱寄生和粉蚧共同寄生于植物的生活方式，是目前唯一可以用栽培腐生菌的方法培养出成熟子实体，实现人工栽培的牛肝菌种类，但因黑牛肝菌自身没有木质素酶、纤维素酶、漆酶，不能分解利用大分子的木质素、纤维素，因此腐生能力很弱。
人工栽培黑牛肝菌首先需要有优良的菌种。人们通常采用直接分离野生子实体获得菌种，以及通过杂交育种的方式获得菌种。虽然杂交育种可以进行优良性状组合，遗传稳定，但前提条件是首先要获得具有优良性状的亲本，再利用具有不同优良性状的亲本进行杂交，得到非常大的样本量(1000个以上的杂合个体)后，再经逐级进行出菇验证、生产验证，但却不一定就能选出符合栽培要求的优良菌株，不仅时间长、工作量大，能否得到符合栽培要求的菌种也不能预估。理论上，直接分离野生子实体得到菌种是最为快捷的方法，先收集、分离100-500个以上的野生黑牛肝菌子实体作为基础菌株，再进行逐级的出菇验证、生产验证后，获得符合生产要求的优良菌株。但因野生子实体个体间存在不同的遗传背景，导致个体之间差异很大，我们长期的菌株筛选实践证明，野生子实体直接分离得到的菌株，往往只有5％的菌株其出菇率能达到50％--75％，而出菇率达95％以上的菌株只有0.5％-1％。因此，以单纯的筛选方法，实际上很难得到符合生产要求的菌株。
同时，在获得经过实验验证的理想菌株后还需要对其品种进行精准的界定，以方便区分不同的菌株品系，以便及时发现此菌株在生产过程中是否产生了遗传变异，为栽培应用提供种源指导。SSR分子标记，又称指纹图谱，可对同种类不同品种品系之间的变异进行高精度识别，且结果可靠，符合品种鉴别的基本准则；利用其SSR分子标记引物可以随时对目标菌株进行识别。为了快速、准确界定本发明的黑牛肝菌新菌株，本发明公开了10对独特的微卫星位点(SSR)，结合其他品系的黑牛肝菌菌株指纹图谱分析，能对该新菌株进行快速、准确界定。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一株具有优良生物学特性的黑牛肝菌菌株HZ18006，该菌株具有遗传稳定，活力强，后期出菇速度快且出菇整齐，生长速度快的优点，可实现黑牛肝菌工厂化栽培。
本发明的目的还在于提供一种准确鉴别所述黑牛肝菌菌株HZ18006的特异性SSR标记指纹图谱。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
Ⅰ、一株黑牛肝菌新菌株，分类命名为：黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006，其具有明显提高子实体产量的能力；该菌株通过对野生黑牛肝菌子实体分离、驯化后获得，已于2019年3月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.17080。
所述的野生黑牛肝菌子实体采集自中国云南省西双版纳傣族自治州景洪市大勐龙镇曼掌宰村凤凰木树下的林地中。
所述的对野生黑牛肝菌子实体的分离、驯化，具体过程包括：野生子实体采集及菌株分离，出菇能力验证，腐生能力驯化，生长环境条件驯化和生产验证；其中在腐生能力驯化时，以50％红壤和50％木屑的混合物作为基质培养基。
黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株的基本生物学特性：
1、黑牛肝菌HZ18006菌株在形态学方面具有如下的特征,见表1；
表1菌株HZ18006的形态学特征
2、黑牛肝菌HZ18006菌株在生物学及产量方面具有许多优良性状，明显优于目前应用于生产的其他野生驯化菌株(见表2)；
表2黑牛肝菌HZ18006菌株与其他野生驯化菌株的生物学及产量性状差异比较
3、本发明的黑牛肝菌HZ18006菌株的rDNA-ITS序列在美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI)中比对，HZ18006菌株与菌种CY_336(GenBank:KJ439035)相似性最高达99％，结合菌落、显微形态特征及rDNA-ITS序列信息，该菌株鉴定为暗褐网柄牛肝菌，即俗称的黑牛肝菌。
Ⅱ、本发明还涉及黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由10对SSR标记组成，是基于牛肝菌基因组简单重复序列片段开发的SSR引物，通过分析其等位基因数目、片段长度及其与其他菌种的亲缘关系，发现黑牛肝菌HZ18006菌株与其他菌种均存在遗传差异，结合其形态学特征，产业栽培特性及微卫星指纹图谱可以界定HZ18006菌株是一株新的黑牛肝菌菌株品种。
黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱，其特征在于：基于牛肝菌基因组简单重复序列片段开发的SSR引物，由10对SSR标记组成，标记的具体序列见表3：
表3 10对SSR指纹图谱引物信息
鉴别时，采用10对SSR引物对待测菌株的串联重复碱基的长度和重复数进行比较，获得等位基因的数目和片段长度，通过TFPGA分析软件计算相似性系数，用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，分析其遗传差异，即可确定待测菌株是否为黑牛肝菌HZ18006菌株。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的菌株通过对野生黑牛肝菌子实体分离菌株进行人工驯化后获得，微卫星片段多态性显示其区别于其他黑牛肝菌菌株，是一株独特的黑牛肝菌菌株品种。
2、实验室和生产实践证实，该菌株活力强，遗传特性稳定，后期出菇速度快且出菇整齐，生长速度快，满足大面积工厂化栽培需要，在最佳收获期可以一次完成采收，极大地简化了采收程序和劳动力。
3、本发明还具有子实体栽培方法简便，管理粗放，出菇快，产量高等优良的生物学生长特性。在人工条件下进行营养生长培养和子实体人工栽培，结果显示菌丝灰褐浓密、绒毛状，气生菌丝较旺，有黑色分泌液；最适培养生长温度为25-30℃，25-28d长满90mm培养皿；出菇条件宽泛，易于管理：培养基质要求相对粗放，pH＝4-7范围内，粗细木屑、甘蔗渣、草炭、谷粒等基质，经二次发酵栽培均可；出菇温度25-29℃即可，无需精细控温；湿度>95％时出菇相对容易。而且，此菌种出菇速度快，覆土后第7天进入催蕾期，第11天子实体原基开始形成，出菇率高达98％-100％，出菇整齐；单瓶平均产鲜牛肝菌130g，同等条件下较其他菌种产量提高约30g，个大均匀，品像佳；采收后可保存于4℃-10℃，口感脆嫩；也可制作蘑菇干片，香气浓郁，外形似片状牛肝。
4、本发明基于牛肝菌基因组简单重复序列片段开发SSR引物，获得HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由10对SSR标记组成，结合准确定量的毛细管电泳荧光检测方法，可用于HZ18006菌株的快速鉴别。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2019年3月18日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株分类命名为黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006，保藏号CGMCCNo.17080。
附图说明
图1黑牛肝菌HZ18006菌株的10对SSR引物扩增产物毛细管电泳的荧光检测峰值图(横坐标为电泳条带长度值，纵坐标为荧光信号值，带数字的峰为扩增产物，数字表示条带大小，其余峰为内标)。
图2基于HZ18006菌株和其他20个牛肝菌菌种的SSR扩增产物数据构建的UPGMA聚类树。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的等同替换或变化，均应该属于本发明的保护范围。
实施例1：
通过对野生黑牛肝菌子实体分离菌株进行人工驯化后获得本发明黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株：
1.人工驯化的具体方法：
1.1野生子实体采集及菌株获得：于云南省西双版纳傣族自治州的景洪、勐腊、勐海以及普洱地区的思茅、景谷等地(宿主树有凤凰木树、柚子树和菠萝蜜树)采集野生黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)子实体100个，以PDA培养基分离子实体的组织块，待菌丝长满培养基后获得100个野生菌株。
1.2出菇能力验证：将获得的100个野生菌株进行工厂化栽培环境下的栽培出菇，选取出菇率达50％-75％的菌株进行腐生能力驯化。
1.3腐生能力驯化：将菌株的菌丝体转接于50％红壤、50％木屑的基质培养基中，培养20天，菌丝长满培养基质后，再连续转接、培养3次，驯化黑牛肝菌腐生能力(即分解木质纤维素的能力)，然后再次进行出菇验证，选取出菇能力达95％的菌株进行200瓶、2000瓶、4000瓶逐级扩大栽培，最后选取出菇率稳定在95％以上的菌株进行生长环境条件的驯化。
1.4生长环境条件驯化：将步骤1.3所得出菇率稳定在95％以上的菌株，在工厂化的栽培环境中栽培，每次栽培4000瓶、重复3次，结果表明：该菌株出菇率稳定在98％--100％，每瓶平均产鲜牛肝菌110g。
1.5生产验证：将步骤1.4所得菌株进行生产性栽培，每批次接种16000瓶，重复5批次，结果表明：该菌株出菇率稳定在98％--100％，单瓶平均产鲜牛肝菌110g，菇房产量1750kg/16000瓶,可大面积用于生产。将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006，保藏号为CGMCCNo.17080。
2.黑牛肝菌HZ18006菌株的形态特征及与目前应用于生产的野生驯化菌株的生物学及产量性状对比。
2.1黑牛肝菌HZ18006菌株的形态特征见表1。
由表1可见：HZ18006菌株，高80cm-115cm；菌盖半球形，暗褐色，直径45cm-75cm，厚7cm-15cm；菌柄近圆柱形，上部直径35cm-55cm，下部直径45cm-60cm；孢子暗褐色，椭圆形，大小7.1x7.5um～8.5x10.1um；菌孔暗褐色，成熟度75％采收时平均菇重110g，土腥味淡。
2.2黑牛肝菌HZ18006菌株在生物学及产量方面具有许多优良性状，优于目前应用于生产的野生驯化菌株(17056、15029、16017)，见表2。
由表2可见，HZ18006菌株具有以下优点：菌丝生长快，菌丝日生长量(50mm)，快于HZ17056(43mm)、HZ15029(45mm)，HZ16017(40mm)；养菌期短，接种至菌丝长满培养基质32天，快于HZ17056(35天)、HZ15029(39天)，HZ16017(34天)；覆土层菌丝培养7天，均少于HZ17056(8天)、HZ15029(8天)，HZ16017(8天)3个菌株1天；覆土至出菇11天，快于HZ17056(13天)、HZ15029(12天)，HZ16017(13天)；出菇整齐，出菇率高99.8％，高于HZ17056(95％)、HZ15029(94％)，HZ16017(96％)；出菇期污染率3％，低于HZ17056(6％)、HZ15029(7％)，HZ16017(5％)；产量高，平均单瓶产鲜牛肝菌重110g，产量较菌株HZ17056(93g)提高18％、HZ15029(96g)提高14.5％、HZ16017(92g)1提高19.5％；外观品相好，菌柄圆柱形，菌柄上部及基部直径基本等粗，菌盖半球形；耐贮存，4-10℃的低温条件保鲜8d-10d；泥腥味淡，而HZ17056、HZ15029、HZ16017菌株泥腥味浓；烹饪后褐变浅，而HZ17056、HZ15029、HZ16017菌株烹饪后褐变严重。
实施例2：
菌株HZ18006在食用菌产业栽培方面的应用：菌种HZ18006可以在人工基质上比较容易地完成从菌种到形成担子果的生活史周期，即人工条件下可以通过菌种进行子实体人工栽培，以达到收获黑牛肝菌子实体的目的。与其他栽培菌种相比，具有子实体栽培方法简便，管理粗放，出菇快，产量高等优良的生物学生长特性，具体产业栽培应用条件如下：
1、制作HZ18006菌株最适培养基M1固体培养基：马铃薯20.0g、葡萄糖20.0g、酵母膏2.0g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 1.0g培养基，琼脂16.0g，蒸馏水1000mL。M1液体培养基不加琼脂，其余成份与M1固体培养基相同。在M1培养基上，HZ18006菌丝灰褐浓密、绒毛状，气生菌丝较旺，有黑色分泌液。25-30℃条件下培养菌丝生长最快，25-28d长满直径为90mm的培养皿。
2、利用M1固体培养基对菌种进行活化
常规方法用M1固体培养基制作培养皿。将保存于4℃条件下的HZ18006菌株接种于含M1固体培养基的培养皿在25-30℃条件下进行活化和培养，25-28d后菌落长满培养皿，作为液体放大培养的培养材料。
3、将活化后的菌种接入液体M1培养基进行放大培养
将含有活化菌株HZ18006的M1固体培养基用打孔器打成直径0.2-1.0cm的菌饼，将5块菌饼接入摇瓶，放入转速为150r/min的摇床26-30℃条件下培养7-14天获得液体菌种。
4、放大的液体菌种接种栽培基质进行子实体出菇培养
按照3：3：2：1.5：0.5的比例混匀木屑，甘蔗渣，草炭，树皮和谷粒制作人工基质；按照每公斤基质加1.0g的标准加入适量MgSO4，KH2PO4，和水搅拌，使基质含水量在48％-55％；调节pH值在4.0至7.0之间(优选6.0)；将混好的基质分装入蘑菇栽培瓶后放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌(121℃，60min)，待栽培基质冷却后将液体菌种倒入基质中，每100ml液体菌种分别接种于5瓶蘑菇培养瓶；然后放置于温度为26-30℃黑暗条件下避光培养30-45天，菌丝体长满栽培基质培养瓶即得栽培菌种。
5、覆土出菇
取田园土后，用孔径20mm的筛子将土壤去杂草、碎石后加适量水使土壤含水量保持在60％左右。将基质菌种覆3-5cm厚度田园土后敞口放置于25-29℃、普通白炽灯照度，照度2000lx强度，每天照射12小时，湿度80％-100％的菇房进行培养，期间注意保持土壤湿润直至出菇。覆土第7天菌丝体进入催蕾期，第11天原基开始形成，此后陆续出菇，2天出齐，出菇率高达98-100％；且产量更高，单瓶产鲜菇平均重110g。
6、子实体形态特征，储存和产品开发
菌盖黑色，蕾期至中菇期半球形，成熟后平展，直径7.5cm，厚1.5cm，表面光滑；菌柄褐色，长5.5cm，近圆柱形，颜色较菌盖浅，由上至下渐粗，上部直径2.5cm，下部直径5cm，基部微膨大；菌柄实心，菌肉淡黄，受伤后变蓝。担孢子3.8-4.0×4.7-5.1um，近椭圆形。
与菌株HZ17056、HZ15029、HZ16017相比，本发明HZ18006菌株具有如下优良性状：产量显著提高，栽培后单瓶平均收获鲜牛肝菌重110g，较菌株HZ17056(93g)提高18％、HZ15029(96g)提高14.5％、HZ16017(92g)1提高19.5％；品相好，菌柄圆柱形(菌柄上部及柄基部差异平均为10mm),菌盖半球形，菌肉厚；耐贮存，鲜菇在4-10℃的低温条件保鲜8d-10d,口感脆、嫩，泥腥味淡，烹饪后稍褐变。45℃-60℃条件下烘干12h，干片香气浓郁，似片状牛肝，卖相佳,具有极高的市场应用价值。
实施例3：构建黑牛肝菌HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱：
通过开发微卫星指纹图谱准确快速对HZ18006菌株与其他黑牛肝菌菌种进行遗传学关系分析和品种界定：
1、黑牛肝菌HZ18006菌株基因组DNA的提取和检测：采用Omega磁珠DNA小量提取试剂盒Omega mag-bind DNA kit提取HZ18006菌株的总DNA，操作方法按试剂盒提供的说明书步骤进行。将提取的DNA样品与10X LoadingBuffer按10:1混合上样于1％的琼脂糖凝胶中电泳，使用凝胶成像仪检测提取的总DNA的质量。使用微量紫外分光光度计Nanodrop测量总DNA的浓度，调整样品DNA的浓度为50-100ng/μL，用来进行PCR扩增反应。
2、荧光SSR引物的合成：选取具有多态性的10对SSR引物。在SSR引物的正引物的5'端加上荧光标记(荧光标记分别为蓝色荧光FAM和绿色荧光HEX)，荧光引物的合成在上海桑尼生物科技有限公司完成。10对SSR引物信息见表3。
3、荧光引物PCR扩增：使用PCR扩增仪进行扩增反应。PCR反应体系为10μL。组份比例为：DNA(50ng/μL)1μL，正向荧光引物(10μM)0.2μL，反向普通引物(10μM)0.6μL,2X TaqMaster Mix 5μL，ddH2O 3.2μL。扩增条件为：94℃5min，后以94℃30s，60-57℃30s，72℃为条件进行35个循环，最后72℃延伸7min。
4、ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳：将PCR扩增产物点样放入96孔板中，并加入70％乙醇进行纯化处理，处理之后的样品，加入内标LIZ500和HiDi，放入PCR仪95℃变性4min，放入ABI3730XL进行毛细管电泳，进行基因分型。
5、Gene Mapper 3.2数据分析：电泳结果出来后的数据，导入至软件Gene Mapper进行分析，得到相应位点的片段大小和荧光信号值，并对图标片段长度进行分析。如图1所示，毛细管电泳的荧光检测峰值图的横坐标表示片段大小，纵坐标表示荧光信号强度，带数字的峰为扩增产物，数字表示条带大小，其余峰为内标。
6、菌种鉴定：采用10对SSR引物对菌株HZ18006及其他20个黑牛肝菌菌株进行对比鉴别，通过SSR荧光引物扩增产物的比较，HZ18006具有特定的等位基因数目及片段长度(表4和图1)，可以与其他20个牛肝菌菌株区别(其他20个牛肝菌菌株10对引物信息见表5)，可作为鉴定该种的可靠分子标记。
表4 HZ18006菌株SSR引物扩增的等位基因片段信息汇总表
引物编号 荧光标记 退火温度(℃) 等位基因数目 扩增产物长度
HZ1 5’-FAM 59 1 309
HZ2 5’-FAM 59 1 259
HZ3 5’-FAM 60 1 275
HZ4 5’-FAM 60 2 164，167
HZ5 5’-FAM 60 1 201
HZ6 5’-HEX 57 1 338
HZ7 5’-HEX 59 1 359
HZ8 5’-HEX 57 1 367
HZ9 5’-FAM 58 1 432
HZ10 5’-FAM 60 2 233，239
7、基于HZ18006和其他20个牛肝菌菌种的SSR扩增产物数据，采用TFPGA分析软件计算相似性系数，用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。根据UPGMA聚类树(图2)显示，HZ18006菌株与菌株H1713和H1726的亲缘关系相对较近，与其他菌种的亲缘关系较远。HZ18006与其他菌种均存在遗传差异，是一株遗传背景独特的黑牛肝菌优良菌株。
因此，采用这10对SSR引物对某一菌株的串联重复碱基的长度和重复数进行比较，获得等位基因的数目和片段长度，通过TFPGA分析软件计算相似性系数，用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，分析其遗传差异，即可确定该菌株是否为黑牛肝菌HZ18006菌株。
黑牛肝菌实现人工栽培是食用菌领域的一项重要突破。但是，规模生产，扩大产业和开拓市场仍然需要不断研发筛选优良菌种，改善培养条件，提高口感品质。其中，优良菌种筛选是最有效手段也是最关键一环。本发明通过对野生黑牛肝菌种的驯化改良，可以缩短菌种培养时间，简化培养条件以降低人工成本的投入。通过人工驯化获得的黑牛肝菌HZ18006菌株，子实体产出时间早，产量稳定，出菇整齐，子实体活力强，收获后容易保鲜，无明显口感变化。微卫星片段多态性显示其区别于其他黑牛肝菌菌株，是一株独特的黑牛肝菌菌株品种。
上述实验和生产实践已经证实，该菌株活力强，生长速度快，后期出菇速度也快而且出菇整齐，在最佳收获期可以一次完成采收，简化了采收程序和劳动力。此菌株获得的单个子实体平均鲜重达到110g，比普通菌种产量高20g。这些优良的生物学特性和储存品质可以显著降低生产成本，增加企业效益，具有很高的应用推广价值，十分有必要该菌株进行品种界定和专利保护。

Claims (3)

1.一株黑牛肝菌新菌株，分类命名为：黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006，其具有明显提高子实体产量的能力；该菌株通过对野生黑牛肝菌子实体分离、驯化后获得，已于2019年3月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.17080。
2.根据权利要求1所述的黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株，其特征在于：所述的对野生黑牛肝菌子实体的分离、驯化，具体过程包括：野生子实体采集及菌株分离，出菇能力验证，腐生能力驯化，生长环境条件驯化和生产验证；其中在腐生能力驯化时，以50％红壤和50％木屑的混合物作为基质培养基。
3.权利要求1所述黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)HZ18006菌株的SSR标记指纹图谱，其特征在于：基于牛肝菌基因组简单重复序列片段开发的SSR引物，由10对SSR标记组成，标记的具体序列见下表：
表.10对SSR指纹图谱引物信息
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