CN117025415A - 一种暗褐脉柄牛肝菌菌株v239.04及其应用 - Google Patents

一种暗褐脉柄牛肝菌菌株v239.04及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04及其应用,所述菌株V239.04于2023年05月10日保藏在广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,保藏编号GDMCC NO.63447。

Description

一种暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04及其应用
技术领域
本发明涉及食用菌技术领域,具体而言,涉及一种暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04及其应用。
背景技术
暗褐脉柄牛肝菌(Phlebopus portentosus),又名暗褐网柄牛肝菌,俗名黑牛肝菌,隶属于牛肝菌目(Boletales),小牛肝菌科(Boletinellaceae),脉柄牛肝菌属(Phlebopus)。暗褐脉柄牛肝菌目前已成功实现了人工栽培,并能够进行工厂化的大规模量产。
从暗褐脉柄牛肝菌的生物学和生态学特性来看,该物种在野外主要分布于热带地区,且《暗褐网柄牛肝菌人工驯化研究的回顾与前瞻》(曹旸等人,菌物学报,2021年12期,第3064-3080页)、云南省地方标准《DB53T746-2016暗褐网柄牛肝菌人工栽培技术规程》以及专利CN101524035B和CN103766137B多篇现有技术中报道其最适生长温度为30℃,一般不低于26℃,属于高温菇类。从大规模量产的生产成本出发,若能获得适应较低温度生长出菇的菌株,将大大降低生产过程中用于加温的能源成本,为暗褐脉柄牛肝菌在全国范围内的种植奠定基础。
因此,本领域中存在对适宜于工厂化栽培,能够适应较低温度出菇的暗褐脉柄牛肝菌菌株的需要。
发明内容
为了解决上述问题,在第一个方面,本发明的目的在于提供一种暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04,所述菌株V239.04于2023年05月10日保藏在广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,保藏编号GDMCC NO.63447。
在第二个方面,本发明的目的在于提供如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04产生的原生质体、孢子、子实体或菌丝体。
在第三个方面,本发明的目的在于提供包含如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如第二个方面所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体的菌棒。
在第四个方面,本发明的目的在于提供包含如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如第二个方面所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体的食品制品。在任选的实施方案中,所述食品制品可以是营养品、调味品或添加剂。在可选的实施方案中,所述食品制品可以是菌菇制品。
在第五个方面,本发明的目的在于提供一种栽培暗褐脉柄牛肝菌的方法,所述方法包括使用如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如第二个方面所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体栽培暗褐脉柄牛肝菌。
在第六个方面,本发明的目的在于提供如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04在牛肝菌育种中的应用。在优选的实施方案中,所述育种可以为自交育种或杂交育种。
在第七个方面,本发明的目的在于提供如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如第二个方面所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体在生产食品制品中的应用。在任选的实施方案中,所述食品制品可以是营养品、调味品或添加剂。在可选的实施方案中,所述食品制品可以是菌菇制品。
在具体的实施方案中,如第一个方面所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如第二个方面所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体可以包括在所述食品制品的原料和/或成品中。
与现有技术相比,本发明的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04具有以下优点:
(1)本发明菌株遗传稳定,活力强,生长速度快,菌盖深褐色,菌柄黄色,在出菇管理过程中温度可低至21~26℃等特点。
(2)由于该菌株在出菇管理过程中能适应较低的温度,可有效降低生产成本,属于优良菌株,具有较高的商业价值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
除暗褐脉柄牛肝菌菌株外,实施例中所用的试剂和设备等均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1:菌株V239.04的选育
菌株V239.04的选育过程,包括以下步骤:
(1)采集自中国云南省西双版纳傣族自治州景洪市勐养镇的多株牛肝菌的子实体;
(2)对上述子实体进行表面消毒,在超净工作台上,以无菌手术刀挑取子实体中心位置,菌柄菌盖交界处组织块;
(3)将上述组织块置于固体培养基进行培养(配方:马铃薯200g(水煮浸出液)、葡萄糖20.0g、牛肉浸膏2.0g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 1.0g,加蒸馏水定容至1000mL,琼脂16.0g,pH值自然),获得多株菌丝体;
(4)将上述菌丝体作为母种,进行比较栽培试验,并在其菌种培养、出菇管理的各个阶段进行降温试验,最终选育获得在出菇管理过程中能适应低至21~26℃温度的菌株V239.04。
实施例2菌株V239.04的物种分类学分子鉴定
(1)基因组DNA制备:取上述菌丝体置于1.5ml的离心管中,采用改进过的CTAB法提取基因组DNA,具体包括以下步骤:
a.向上述加入标本的离心管中加入少许石英砂,再加入250μL的2×CTAB裂解液,用研磨棒进行充分研磨,直至呈匀浆状,再加入600μL的2×CTAB裂解液,颠倒混匀;
b.将装有研磨充分标本液的离心管置于65℃水浴1小时(其间每10分钟翻转离心管1次);
c.加入苯酚和氯仿各300μL,翻转离心管几次,13000rpm离心10分钟;
d.收集上层水相,转至新的1.5mL离心管中;
e.重复c–d步2至3次,直至两相界面上无沉淀为止;
f.加入等体积的氯仿抽提一次,收集上层水相;
g.加入0.5–1倍体积预冷的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇),4℃下13000rpm离心10分钟;
h.小心倒去上清液,将离心管扣压在干净的面巾纸上,吸干残留的上清液;
i.加入1mL预冷的75%乙醇,翻转离心管几次,13000rpm离心10分钟,弃除上清液,重复两次;
j.置于室温或真空系统中干燥;
k.加入50μL无菌水室温溶解,于-20℃保存备用。
(2)PCR扩增及测序:使用真菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)通用引物(ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对上述DNA样品进行PCR扩增。
50μL的PCR扩增反应体系为,50ng/μL的模板1μL,25mM的MgCl2 5μL,10mM的dNTPs1μL,6μM的引物各1μL,5U/μL的DNA Taq酶0.2μL,10×PCR反应缓冲液5μL,去离子水35.8μL。
PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min,接下来94℃变性1min,退火1min,72℃延伸1min,一共进行35个循环,最后72℃延伸10min。
上述PCR产物送测序公司进行测序,获得DNA序列见SEQ ID NO.1。
(3)序列检索:将获得的DNA序列提交GeneBank,应用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行同源性搜索,与数据库中各菌株序列进行相似性分析,分析发现与数据库中已有的暗褐脉柄牛肝菌菌株序列一致性(Identities)达到99~100%,因此可将该菌株鉴定为暗褐脉柄牛肝菌。
实施例3菌株V239.04的人工栽培
(1)母种制备:将保藏的V239.04菌株转接于固体培养基(配方:马铃薯200g(水煮浸出液)、葡萄糖20.0g、牛肉浸膏2.0g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 1.0g,加蒸馏水定容至1000mL,琼脂16.0g,pH值自然)平板进行活化即得母种。
(2)摇瓶液体种制备:使用液体培养基(配方:马铃薯200g(水煮浸出液)、葡萄糖20.0g、牛肉浸膏2.0g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 1.0g,加蒸馏水定容至1000mL,pH值自然),将配好的培养基装入500ml的三角瓶中,每瓶装300~400ml,进行高压灭菌。然后将母种菌丝体接入液体培养基中,置于恒温回旋式振荡器培养6天~7天,振荡频率150r/min~180r/min,培养温度28±1℃,暗光培养。
(3)发酵罐液体菌种制备:培养基配方包括马铃薯100g/L(水煮浸出液)、蔗糖1.5g/L、豆粕2g/L、维生素B 50mg/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾1g/L、消泡剂0.25g/L,pH4~6。对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。发酵罐内蒸汽压力达到0.105MPa~0.125MPa,温度达到121℃~124℃,保持时间20min~40min。在火焰上打开摇瓶液体种,灼烧瓶口后倒入发酵罐中,接种量为1︰600(v/v),设置一定参数,培养4~6天。亦可选择制作固体菌种进行扩繁。
(4)栽培种制作:将谷粒、木屑、土壤按照一定的比例搅拌均匀,将硫酸镁、磷酸二氢钾按照培养料的0.1%(w/w)比例溶于水中,然后均匀混入料堆中,再充分搅拌,加水使培养料含水量达到50.0%~70%左右,pH 4.0~5.0。将上一级菌种接入灭菌的栽培种中,28±1℃暗光培养。
(5)覆土出菇:选用地表20cm以下的红壤土,与泥炭土等体积比混合,进行覆土出菇,空气相对湿度为75%~85%,分阶段进行出菇管理,温度21~26℃。覆土15天后,即可进行采收。
在上述人工栽培过程中,各环节管理得当的条件下,菌株V239.04表现出遗传稳定,活力强,生长速度快,菌盖深褐色,菌柄黄色,在出菇管理过程中,温度可低至21~26℃等特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解,在本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (12)

1.一种暗褐脉柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)菌株V239.04,其特征在于,所述菌株V239.04于2023年05月10日保藏在广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,保藏编号GDMCCNO.63447。
2.如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04产生的原生质体、孢子、子实体或菌丝体。
3.包含如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如权利要求2所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体的菌棒。
4.包含如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如权利要求2所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体的食品制品。
5.如权利要求4所述的食品制品,其特征在于,所述食品制品是营养品、调味品或添加剂。
6.如权利要求4所述的食品制品,其特征在于,所述食品制品是菌菇制品。
7.一种栽培暗褐脉柄牛肝菌的方法,其特征在于,所述方法包括使用如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如权利要求2所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体栽培暗褐脉柄牛肝菌。
8.如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04在牛肝菌育种中的应用,所述育种为自交育种或杂交育种。
9.如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如权利要求2所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体在生产食品制品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述食品制品是营养品、调味品或添加剂。
11.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述食品制品是菌菇制品。
12.如权利要求9-11所述的应用,其特征在于,其中如权利要求1所述的暗褐脉柄牛肝菌菌株V239.04或如权利要求2所述的原生质体、孢子、子实体或菌丝体包括在所述食品制品的原料和/或成品中。
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罗顺珍等: "适宜黑牛肝菌菌丝生长的合成培养基及主要环境条件", 《中国食用菌》, vol. 36, no. 5, 15 September 2017 (2017-09-15), pages 45 - 48 *

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