CN115927016A

CN115927016A - 玫红脉柄牛肝菌菌株及其用途

Info

Publication number: CN115927016A
Application number: CN202310026066.7A
Authority: CN
Inventors: 杨梅; 柳成益; 黄中华; 孔令加; 唐平; 肖玉军; 李华兵; 陈太萍
Original assignee: PANZHIHUA INSTITUTE OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCE
Current assignee: PANZHIHUA INSTITUTE OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCE
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及玫红脉柄牛肝菌菌株及其用途。为了解决现有种质资源保护利用和栽培技术的不足，本发明在四川省攀枝花市米易县采集并分离出一株玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)菌株，保藏编号为GDMCC No.62564。该菌株适合制备液体菌种、固体菌种和袋料栽培，其特点在于菌丝生长快、整齐，分泌物少不宜老化，在栽培料上菌丝萌发快，生长周期短、出菇早。本发明还公开了该菌株的分子标记，该分子标记为菌株的知识产权保护提供了分子数据。

Description

玫红脉柄牛肝菌菌株及其用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及玫红脉柄牛肝菌菌株及其用途。

背景技术

玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)隶属于真菌界(Fungi)，担子菌(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，牛肝菌目(Boletales)、小牛肝菌科(Boletinellaceae)、脉柄牛肝菌属(Phlebopus)。小牛肝菌菌科是牛肝菌目中比较独特的，由脉柄牛肝菌属(Phlebopus)和褶孔牛肝菌属(Boletinellus Murrill)两个个属组成。

目前，褶孔牛肝菌属中仅3个种被描述，然而，脉柄牛肝菌属中超过12个种群被报道。只有一个种，暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)最先在中国被报道，暗褐网柄牛肝菌分布在中国的云南、四川、海南、广西，国外分布于泰国、斯里兰卡，同时在越南、老挝、印度尼西亚、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等热带地区。与其他牛肝菌不同的是玫红脉柄牛肝菌仅与暗褐网柄牛肝菌混生在一块废弃的枇杷园内，其分布范围及其狭窄，仅中国四川攀枝花有报道分布，产量小，属于珍稀濒临物种。

牛肝菌种类繁多，分布广泛，全世界报道的就有800多个种，我国牛肝菌资源非常丰富，已发现的具菌管或菌褶的牛肝菌种类多达390种以上，其中199种可食用。牛肝菌由于营养丰富美味，受到世界各地消费者的喜爱，由于大多数牛肝菌为共生菌，与宿主植物共生才能完成其生活史，因此人工栽培难度大，目前，除暗褐网柄牛肝菌外还未见其他牛肝菌人工种植成功的报道。暗褐网柄牛肝菌是目前唯一能够采用腐生栽培方法在菇房条件下出菇的牛肝菌目食用菌，可进行周年规模化生产。而玫红脉柄牛肝菌含有丰富的蛋白质、粗脂肪、总糖、粗纤维、多种矿质元素和氨基酸，是一种营养价值较高的食用菌，深受消费者喜爱的美味食用菌，但其人工栽培难度大，研究报道很少。

发明内容

为了解决现有种质资源保护利用和栽培技术的不足，本发明的玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047是在四川省攀枝花市米易县采集并分离的新菌株，经研究，未见其他分布地以及该菌种的研究报道。

本发明提供的玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)菌株为适合制备液体菌种、固体菌种和袋料栽培的玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047，其特点在于菌丝生长快、整齐，分泌物少不宜老化，在栽培料上菌丝萌发快，生长周期短、出菇早。

本发明的玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)菌株，保藏编号为GDMCCNo.62564。保藏时间为2022年06月28日，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为510070。

其中，上述玫红脉柄牛肝菌的形态学特征为：菌盖常呈红褐色，黄色，菌盖的角质层下呈微红色的，菌肉较暗，黄色，伤变蓝色，菌孔管呈亮黄色，伤变蓝色，孔多边型，五边形或六角形，菌孔内覆小菌孔，菌柄为棒状，基部球茎，干燥、粗糙，有沟槽，绒毛状，玫瑰至红褐色，末端通常为淡黄色；肉味，略有土味；

孢子沉积为深棕色；担孢子呈光滑的蜜黄色，宽椭圆形或倒卵形，薄壁，顶端无孔隙；担子透明，纺锤状，4个长孢子；侧囊状体棒状或多晶的；子实体层菌髓双侧，透明。

综合培养基上菌丝呈灰褐色，有较强的菌索，菌丝有锁状联合，菌丝上有淡黄色至褐色的分泌物，在栽培基质上有大量的菌索和菌核产生。

其中，上述玫红脉柄牛肝菌的生长条件为：玫红脉柄牛肝菌菌丝生长温度为23～26℃，pH值范围为6～9。培养皿(90mm*15mm)的平均生长时间为20天。

上述玫红脉柄牛肝菌在食品或保健品中的用途。

本发明还提供一种食品或保健品，其含有上述玫红脉柄牛肝菌的提取物。

其中，上述玫红脉柄牛肝菌的必需氨基酸与总氨基酸质量比EAA/TAA为38.08％，必需氨基酸与非必需氨基酸质量比EAA/NEAA为61％。

本发明还提供了用于鉴定上述玫红脉柄牛肝菌的分子标记，所述的分子标记为ITS、nrLSU、tef1-α和rpb2，其序列分别如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。

其中，上述分子标记在玫红脉柄牛肝菌真实性或侵权鉴定上的用途。

上述玫红脉柄牛肝菌在制备液体菌种、固体菌种和/或袋料栽培上的用途。

有益效果：

本发明通过对四川省米易县采集的灵芝样品进行形态学鉴定及分子生物学的研究，结合ITS+nrLSU+TEF1-α+RPB2四个基因序列进行系统发育分析，拓扑结构最大似然法计算，得出分支节点支持率0.70，鉴定分离出一株玫红脉柄牛肝菌2019KLR047，确定了该牛肝菌样品的分类学地位。同时，通过基因比对分析，确定了识别该菌株的分子标记，为菌株的知识产权保护提供了分子数据。另外，本发明还对子实体组织分离培养获得纯菌株并进行选择育种研究，为牛肝菌种质资源鉴定评价与开发利用提供理论依据和技术支撑。

本发明通过选择育种获得了利用该菌株制备的液体菌种，其发菌快、菌球大小均匀整齐，污染少。固体菌种萌发快、菌丝生长速度快、菌丝生长边缘整齐、污染少；用于袋料栽培，菌丝占料时间快，菌丝生长快、培养时间短、出菇整齐、子实体产量高，菌盖肥厚。本发明的玫红脉柄牛肝菌2019KLR047菌株在四川亚热带至温带区域正常出菇，分子标记可以准确的识别该菌株，为特色种质资源的保护和合理开发利用提供了可靠的数据支持和品种资源，且易于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047形态学鉴定结果图；图A为玫红脉柄牛肝菌子实体；B为玫红脉柄牛肝菌菌管；C担孢子；D电镜孢子；E菌丝锁状联合；F联络菌丝；G-H担子和担孢子；

图2为本发明实施例1玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047形态学鉴定结果图；I-J：囊状体；

图3为基于ITS+nrLSU+TEF1-α+RPB2序列分析构建的玫红脉柄牛肝菌系统发育树。

本发明的玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)菌株，保藏编号为GDMCCNo.62564。保藏时间为2022年06月28日，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为510070。分类命名为：Phlebopus roseus。

具体实施方式

本发明以四川省攀枝花市米易县为收集地，收集时间为2019年8月26日。对采集样品开展形态学和多基因联合分析研究，确定了该菌株的分类学地位。并开展选择育种和分子标记研究，为特色种质资源保护和利用提供了可靠的依据。

上述玫红脉柄牛肝菌在食品或保健品中的用途。

ITS：SEQ ID NO:9

ATCATTATCGAATGACAAACATCGAAGGGAAGAAGAGAGGCGAGGCATGGCGAAATGGGGGGAACTGTCGCTGGCTTGATTTGCATGTGCACGTCCCTCTTCGCTTTTTTACAAGTGGCTCGTCTTTCCATTCCTTTTTGGTGAAAACCTTACTACACCTGTGCACCCCTTGTAGGTTCCCGAAAGGGAGTCTATGTCTTTCTACCATCACACCGAATGTTCATAGAATGTACTATCGTTCGACTTTGACGTCGAATGAAAATATCAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATTTTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATCGAATTCTCAACCTCGTGTTTCTTTATGAAATGCAAGGCTTGGACATTGGGAGCTTGCTGGTGTCCTCGTGGACGTCGGCTCTCCTTAAATGCATTAGCAAAGGCATGCCTCGCATGTACGGCTCTTGGACGTGATAATGATCATCGTCGCAAGGGGGTCGGAAAGTGTCGAGGTCGGTCGCTGTTTGCTTCTAATATCTCGAAAGGGAGAC。

nrLSU：SEQ ID NO:10

ACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTTAAATCTGGCGGTCTTGTGGCCGTCCGAGTTGTAATCTAGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGGACCGTGTATAAGTCTCCTGGAAGGGAGCTGTCGTAGAGGGTGATAATCCCGTCTTTGACACGGACTACCAGGGCTATGTGATGCGCTCTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATAGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATAGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGAACTTTGGAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGCTGAAAGGGAAACGCTTGAGGTCAGTCGCGTCGGCCGGGGATCAGCCTTGCTCTTTTGCTTGGCGTACTTTCTGGTCGATGGGTCAGCATCAATTTCGGTCGTCGTACAAGGATAGAGGAAATGTGGCATTCTTCGGAGTGTGTTTATAGTCCTTTGTCGGATGCGATGGCTGGGATTGAGGAACTCAGCACGGACCCCTTCGAGGGTTTTCGGGACTTTTGTCCACGATCGCGTGCTTAGGATGCTGGCATAATGGCCTTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATGCCTGCGAGTGTTTGGGTGGCAAACCCGAGCGCGTAATGAAAGTGAAAGTCGAGACCTCTGTCATGGAGGGCACCGACGCCCGGACCTTAGCCTTTTGGCGACGGATCTGCGGTAGAGCATGTATGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGT。

TEF 1-α：SEQ ID NO:11

ATCAAGAACATGATCACCGGTACCTCCCAGGCTGACTGYGCCATTCTTATCATCGCTGGTGGTACTGGTGAATTCGAGGCTGGTATCTCTAAAGATGGTCAGACCCGTGAGCACGCCCTTTTGGCGTTCACTCTCGGTGTACGTCAGCTTATCGTCGCCGTCAACAAGATGGACACCACCAAGGTCTGCATATCTGCACGATAATAGGGTTAAGTTGAACTAACACCGCAAAATAGTGGAGCGAGGACCGTTTCAACGAAATCGTTAAGGAAACTTCCACCTTCATCAAGAAAGTCGGCTACAACCCTAAGGCTGTTGCTTTCGTCCCCATCTCTGGCTGGCACGGTGACAACATGTTGGAGGAGTCGAGCAAGTAAGTATGACATCATGGCGAAACGGGTAGGCGAGCTGACAAAGTTGATTAGCATGACATGGTACAAGGGCTGGACCAAGGAGACCAAGGGTGGTGTCGTCAAGGGCAAGACGCTTCTTGATGCCATCGATGCCATCGAGCCTCCCGTTCGTCCTTCCGACAAGCCTCTCCGCCTTCCCCTGCAGGATGTCTACAAGATCGGTGG。

RPB2：SEQ ID NO:12

TTGTAGTGTGTTGAGTCTCACAAAGAGTTCAACCTCTCATTGGCGGTCAAACACCAGACAATCACGAATGGCCTGAAGTACTCCTTAGCCACAGGTAACTGGGGAGACCAAAAGAAGTCCATGGCTTCCAAGGCGGGTGTATCACAGGTACTTAATCGGTACACCTACGCGTCCACCCTTTCGCACTTGCGTCGTTGCAACACGCCTCTAGGACGTGAAGGGAAGATAGCCAAACCCCGTCAATTACACAATACACACTGGGGAATGGTGTGTCCTGCTGAGACACCCGAAGGACAGGCTTGCGGTCTGGTGAAGAACCTCGCGCTTATGTCCTGCATCTCTGTGGGTTCCTACTCCGCACCCGTGATCGAGTTCCTGGAGGAGTGGGGTCTGGAATCCTTGGAGGAGAATGCGCATTCGTCGACTCCSTGCACGAAAGTCTTTGTCAACGGTGTCTGGATGGGCGTGCATCGTGATCCTGCAAACCTTGTCAAAACTATTAAGAAACTACGTCGAAAGGATGATATCAGCCCTGAAGTGTCCGTGGTCCGCGACATTCGTGAGAGAGAGCTTCGGCTATACACGGATGCAGGTCGTGTTTGCAGACCTCTCTTCATCGTCGAGAACCAGCAACTCGCTCTCCAAAAGAAGCACATCAAATGGCTCAATCAGGGCTACCGCGATGACGATGGTGAGGAGTTCAAATGGGAACAACTGGTGAAGAATGGAATTGTCGAGCTGTTGGATGCAGAGGAAGAGGAGACCGTTATGATCTCTATGACACCAGAGGATCTGGAGAATTCCAGATTGCAGTCTGCAGGCATCAATCCCCATGAGAACGACGGAGAGTACGACCCAGCGGCACGTCTCAAAGCAGGGATAAATGCGCATACATGGACGCACTGTGAGATCCATCCCAGTATGATTTTGGGTGTCTGTGCAAGTATCATT。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

试验材料与方法

1、样品来源

采摘于四川省攀枝花市米易县野生牛肝菌标本，收集时间为2019年8月26日，通过组织分离法，分离获得菌株保存，标本和菌株编号：2019KLR047。

1.1组织分离

1.1.1PDA综合培养基配方为：土豆200g，牛肉浸膏2g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 1.5g,葡萄糖20g，琼脂粉20g，自来水1L，pH自然，将配好的培养基装入500ml的三角瓶中在高压灭菌锅中121℃，高压灭菌30min，将灭菌好的培养基用灭菌好的容量瓶每个培养皿倒入30ml培养基冷却凝固待用。

1.1.2将采集的子实体灭菌处理去除子实体表面的泥土，用75％的酒精对子实体表面进行擦拭处理；

1.1.3将采取的新鲜野生玫红脉柄牛肝菌带回实验室进行拍照编号，在超净工作台上将灭菌处理的子实体切开，在菌盖与菌柄交界处挑取长宽分别为2cm的组织块放入PDA综合培养基平板上，在24℃恒温箱中恒温培养，待菌丝长满后低温保藏待用。

2、仪器与试剂

2.1主要仪器设备

主要的仪器设备：尺子，比色卡，解剖镜，移液枪，离心机，磁力粉碎机，水浴锅，电子天平，微波炉，硅胶板，电泳池，凝胶成像分析仪。

2.2主要试剂材料

主要的试剂：FG1，FG2，RNA酶，FG3，Wash Buffer，E Buffer，ITS4，ITS5，去离子水，MIX，DNA，琼脂糖，TBE，核酸染料(具体参照北京擎科新业生物技术有限公司试剂盒)。

实施例1形态学鉴定

通过宏观形态鉴定与微观形态鉴定对2019KLR047菌株进行形态学初步鉴定。

1.1宏观形态鉴定

用尺子、比色卡与解剖镜观察灵芝宏观形态。宏观形态主要包括：菌盖的形状、大小(菌盖长度、宽度、厚度)，菌盖上表面、下表面的颜色，菌柄着生方式、厚度、长度、颜色、质地；菌肉颜色、质地、厚度；菌管密集程度。

1.2微观形态学鉴定

微观形态观察主要采用徒手切片法，获取少量组织，分别置于滴有棉蓝试剂和碘试剂的玻片上，压片加以观察。先将玻片放置10倍镜下，找到需要观察的部位后，逐渐扩大放大倍数，后用100倍油镜观察。需要观察的微观形态主要包括：孢子的形态、颜色、大小以及是否有脐状突起和平截现象；皮壳细胞形态、颜色与大小；担子和拟担子的形态与大小；菌肉和菌管菌丝的种类、形态与粗度。记录所观察到的数据，担孢子大小数据至少要测量30个，本发明所测得的孢子大小均包括外壁。

通过形态学鉴定，如图1所示，发现编号2019KLR047玫红脉柄牛肝菌：菌盖凸起和平凸，直径120mm，表面干燥，绒毛状，常呈红褐色；菌盖皮层毛状体，稀疏直立，末端细胞3-6×28-30μm，圆柱形和圆形的顶端，有锁状联合棕色色素；组织厚，亮黄色，菌盖的角质层下呈微红色的，伤变蓝色；5％的氢氧化钾滴在组织和菌盖上阴性。子实层体管，管较细，呈放射状从菌柄处延伸，轻微附着；亮黄色；孔与管的颜色一致、伤时变成蓝色；孔多边型，五边形或六角形，1-2×3-4mm，通常一个大的单孔内部有2-5个小孔。柄：长达11.7cm，基部球茎，从顶端到基部菌病直径3.8-6.5cm。基部，干燥、粗糙，有沟槽，绒毛状，玫瑰至红褐色，末端通常为淡黄色；菌柄皮层由交织的菌丝组成，致密，直立，末端细胞，直径2-5μm，长90μm，有锁状联合的薄壁，细胞内色素褐色；菌肉颜色较暗，黄色，伤变成蓝色，没有特别的香味，肉味，略有土味。

孢子沉积为深棕色。担孢子6.5-8×5-6μm，呈光滑的蜜黄色，宽椭圆形或倒卵形，薄壁，顶端无孔隙。担子15-25×10-12μm，透明，纺锤状，4个长孢子。侧囊状体棒状或多晶的，20-50×7-15μm。子实体层菌髓双侧，透明，菌丝直径11μm，形态学初步鉴定该牛肝菌为玫红脉柄牛肝菌。

实施例2分子生物学鉴定

2.1DNA提取

a、处理样品，将牛肝菌子实体撕开，用消过毒的手术刀在撕开部位取一小块子实体放在2mL离心管中，加600μL的FG1并加入3颗直径0.3mm的小钢珠，用磁力粉碎机进行粉碎。

b、加5μL的RNA酶→振荡均匀→水浴10分钟(水浴温度65℃)。

c、加FG2 140μL→冰浴5min→离心10min(转数r为10000r/min)。

d、移液枪吸取上清液650-700μL注入2mL离心管中，加入340μL FG3→加900μL无水乙醇(99.9％)，充分颠倒混匀，吸取800μL注入有膜的1.5mL离心管中→离心1min(转数r为10000r/min)。DNA吸附在膜上，除去滤液，多次重复，直到滤液滤完。

e、加Wash Buffer 600μL进行洗脱，洗脱2次，离心1min(转数r为12000r/min)。再离心5min(空离)，将离心管打开，室温放置几分钟，晾干残留的Wash Buffer。

f、加入E Buffer 50μL，离心3min(1.5mL离心管，转数r为12000r/min)，收集DNA溶液。放-20℃冰箱中保存。

2.2PCR扩增

PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件。高温变性：加热使模板DNA在高温下(94℃左右)双链间的氢键断裂而形成两条单链；低温退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合；中温延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5'-3'方向复制出互补DNA。选择的四个基因片段：ITS、nrLSU、TEF1-α和RPB2，具体引物的碱基组成如下：

ITS：

ITS1-F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'(SEQ ID NO:1)

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO:2)；

nrLSU：

LR0R：5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'(SEQ ID NO:3)

LR5：5'-TCCTGAGGGAAACTTCG-3'(SEQ ID NO:4)；

TEF1-α：

983F：5'-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3'(SEQ ID NO:5)

1567R：5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'(SEQ ID NO:6)；

RPB2：

fRrbp2-6F：5'-TGGGGYATGGTNTGYCCYGC-3'(SEQ ID NO:7)

fRrbp2-7cR：5'-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3'(SEQ ID NO:8)。

用于扩增的PCR反应体系为：去离子水9.5uL、Mix 12.5uL、反向引物1uL、正向引物1uL、DNA 1uL，总计25uL；PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min、(95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min)35cycles、72℃延伸5min。扩增结果4℃冰箱保存。

2.3琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖1g/100mL，0.5×TBE(10×TBE用蒸馏水稀释)。用量筒量取50ml的TBE放入烧杯，用万分之一的电子天平称取0.5g琼脂糖放入盛有TBE的烧杯中，用玻璃杯搅拌溶解，微波炉中火加热2.5分钟，溶液澄清透明时取出；冷却到65℃左右，加入1μL核酸染料，摇荡混匀，倒入硅胶板制模；冷却后取出放入电泳池，用容量为10μL移液枪点样，点样量为4μL，电压160v，电流80毫安，跑25分钟。使用凝胶成像分析仪中紫外检测是否有DNA条带以及看条带大小和明亮程度，进行图像采集记录结果，阳性产物送样检测，检测所提取的DNA浓度。

2.4产物测序

将PCR扩增产物送样双向测序(生工生物工程上海股份有限公司)。

2.5系统发育数据分析

将测序所获得的DNA序列在CNBI数据库中进行BLAST相似性检索，从全部的同源性序列对比中筛选出同源性较高的序列。

2.6分子生物学鉴定结果为：

1、凝胶电泳结果

将灵芝菌丝体提取DNA后，通过PCR扩增和凝胶电泳的检测，在其紫外投影中看到了目的条带，并将扩增产物送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序。

2、基于ITS+nrLSU+TEF1-α+RPB2系统发育树分析

基于ITS+nrLSU+TEF1-α+RPB2构建玫红脉柄牛肝菌系统发育树，编号：2019KLR047即GDMCC 62564的牛肝菌与玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus MY2017274 Phlebopusroseus MY2017275)聚在一支(如图3)，因此，结合形态学特征，确定2019KLR047菌株为玫红脉柄牛肝菌。2019KLR047菌株的分子标记序列如下：

ITS：SEQ ID NO:9

ATCATTATCGAATGACAAACATCGAAGGGAAGAAGAGAGGCGAGGCATGGCGAAA

TGGGGGGAACTGTCGCTGGCTTGATTTGCATGTGCACGTCCCTCTTCGCTTTTTTACAAG

TGGCTCGTCTTTCCATTCCTTTTTGGTGAAAACCTTACTACACCTGTGCACCCCTTGTAG

GTTCCCGAAAGGGAGTCTATGTCTTTCTACCATCACACCGAATGTTCATAGAATGTACTAT

CGTTCGACTTTGACGTCGAATGAAAATATCAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGC

TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATTTTCAG

TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGT

TTGAGTGTCATCGAATTCTCAACCTCGTGTTTCTTTATGAAATGCAAGGCTTGGACATTG

GGAGCTTGCTGGTGTCCTCGTGGACGTCGGCTCTCCTTAAATGCATTAGCAAAGGCATG

CCTCGCATGTACGGCTCTTGGACGTGATAATGATCATCGTCGCAAGGGGGTCGGAAAGT

GTCGAGGTCGGTCGCTGTTTGCTTCTAATATCTCGAAAGGGAGAC。

nrLSU：SEQ ID NO:10

TEF 1-α：SEQ ID NO:11

RPB2：SEQ ID NO:12

本发明通过对四川省攀枝花市米易县采集的玫红脉柄牛肝菌样品进行形态学鉴定和分子生物学研究，确定了牛肝菌样品的分类学地位，确定了玫红脉柄牛肝菌2019KLR047菌株的分子标记。为菌种知识产权保护提供了可靠依据。

实施例3玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047制备液体菌种

3.1在PDA综合培养基上活化菌种，PDA综合培养基配方：土豆200g，牛肉浸膏2g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 1.5g,葡萄糖20g，琼脂粉20g，自来水1L，pH自然。

3.2制备液体培养基：土豆200g，牛肉浸膏2g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 1.5g,葡萄糖20g，自来水1L，pH自然，将配好的液体培养基分装入250ml的三角瓶中，每个三角瓶装入100ml液体培养基，装入高压锅中121℃高压灭菌20min。

3.3.将活化后的菌种用直径为2cm的打孔器在培养基边缘菌丝长势一致的菌株块打孔接种到经过高压灭菌冷却的液体培养基中，先静止培养，待菌丝开始萌发后120r/min，24℃摇瓶培养，培养25天后用真空泵抽滤，在干燥箱中50℃烘干，测量菌丝干重，每个菌株重复处理5组。观察菌丝萌发时间、液体培养基颜色、菌丝球大小、均匀度，比较菌株的优越性。本实验选择了通过分离筛选后表现较好的3个菌株。

通过观察，本菌株在接种后第3天萌发，液体培养基颜色清亮，菌丝球在1cm左右，菌丝球均匀。

表1不同菌株在液体培养上的生长情况

实施例4玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047制备固体菌种

4.1.在PDA综合培养基上活化菌种，PDA综合培养基配方为：土豆200g，牛肉浸膏2g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 1.5g,葡萄糖20g，琼脂粉20g，自来水1L，pH自然。

4.2.制备固体培养基：土豆200g，牛肉浸膏2g，MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 1.5g,葡萄糖20g，琼脂粉20g，自来水1L，pH自然，将配好的培养基装入500ml的三角瓶中在高压灭菌锅中121℃，1.2pa灭菌30min，将灭菌好的培养基用灭菌好的容量瓶每个培养皿倒入30ml培养基冷却凝固待用。

4.3.将活化后的菌种用直径为2cm的打孔器在培养基边缘菌丝长势一致的菌株块打孔接种到固体培养基上，封口放入24℃培养箱中恒温培养。观察菌丝的萌发时间、每7天测量一次菌丝的生长速度，记录菌丝的长势、菌索形成情况，边缘是否整齐，菌丝的密度以及菌丝分泌物。比较菌丝的生长情况。本实验选择了通过分离筛选后表现较好的3个菌株。

表2不同菌株在固体培养上的生长情况

注“+”代表分泌物的多少，“+”越多分泌物越多

实施例5玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047袋料栽培

袋料配方：谷粒45％，土壤30％，木屑20％，草炭土4％，石膏粉1％；

A、将新鲜木屑室温下加水充分预湿后盖膜，堆24小时后加入草炭土预湿；

B、将新鲜谷粒于室温下浸泡45-50h后捞出沥干，然后与土壤、步骤A中预湿好木屑和草炭土，控制水分含量为60-65％，得到混合物，盖膜堆放一夜；

C、将步骤B中得到的混合物中加入石膏粉，装入规格(15cm×30cm×5c)的聚丙烯菌袋中，在120-125℃下高压灭菌120min后取出，放入到无菌接种室中冷却至室温，得到玫红脉柄牛肝菌栽培基质；

D、选择培养皿中菌种在平皿边缘菌丝长势较整齐的部位，用2cm直径的打孔器打孔后接入到步骤C中玫红脉柄牛肝菌栽培基质中，于25℃下培养，待菌丝长至菌袋的1/3时，将温度降至23℃培养至满袋覆土出菇。

表3不同菌株在袋料栽培中的生长情况

由此可知，本发明玫红脉柄牛肝菌菌株2019KLR047适合制备液体菌种、固体菌种和袋料栽培，其特点在于菌丝生长快、整齐，分泌物少不宜老化，在栽培料上菌丝萌发快，生长周期短、出菇早。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims

1.玫红脉柄牛肝菌(Phlebopus roseus)菌株，其特征在于：保藏编号为GDMCCNo.62564。

2.根据权利要求1所述的玫红脉柄牛肝菌，其特征在于：其必需氨基酸与总氨基酸质量比EAA/TAA为38.08％，必需氨基酸与非必需氨基酸质量比EAA/NEAA为61％。

3.权利要求1所述的玫红脉柄牛肝菌在食品或保健品中的用途。

4.一种食品或保健品，其含有权利要求1所述的玫红脉柄牛肝菌的提取物。

5.用于鉴定权利要求1所述的玫红脉柄牛肝菌的分子标记，其特征在于：所述的分子标记为ITS、nrLSU、tef1-α和rpb2，其序列分别如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。

6.权利要求5所述的分子标记在玫红脉柄牛肝菌真实性或侵权鉴定上的用途。

7.权利要求1所述的玫红脉柄牛肝菌在制备液体菌种、固体菌种和/或袋料栽培上的用途。