CN105647990A - 一种微生物胞外多糖及其制备方法 - Google Patents

一种微生物胞外多糖及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物胞外多糖及其制备方法，利用假单胞菌(Pseudomonas？sp.)SFEP-01进行胞外多糖的制备，发酵胞外多糖产率可达8-12g/L，所产胞外多糖具有极强的凝胶活性、抗氧化活性、还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力，该菌株所产胞外多糖主要含有两种成分：EPS？Ⅰ和EPS？Ⅱ，EPS？Ⅰ为杂多糖，单糖残基为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPS？Ⅱ为均一多糖，单糖残基为葡萄糖；所述菌株已于2016年1月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？No:M2016035。所述菌株和多糖均具有良好研究开发前景。

Description

一种微生物胞外多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物多糖领域，涉及一种微生物胞外多糖及其制备方法，具体涉及一种假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵制备的胞外多糖及其制备纯化方法。
背景技术
微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式:①黏附在细胞表面上,即胞壁多糖；②分泌到培养基中,即胞外多糖；③构成微生物细胞的成分,即胞内多糖；而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。
微生物胞外多糖(Extracellularpolysaccharides，EPS)是微生物在生长过程中为适应周围环境的变化产生的一种对自身具有保护作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和植物多糖相比较具有以下优势:①生产周期短,不受季节、地域、病虫害等条件的限制；②具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景；③应用广泛。目前已有多种微生物胞外多糖已经发展成为一类新型的发酵产品，作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、保湿剂、胶凝剂、悬浮剂等广泛应用于石油、化工、食品和制药等多个领域。近年来有关海洋微生物和乳酸菌微生物胞外多糖研究活跃，不断有新型多糖结构被鉴定。微生物多糖作为天然活性大分子，在生物医药领域的潜在应用价值也日益受到人们的广泛关注。
新菌种的进一步探索成为新型胞外多糖的一个重要来源。CN102816724B公开了一株放射形根瘤菌，其产生主要由半乳糖和葡萄糖组成的胞外多糖，其胞外多糖水溶性好，且在低浓度下具有良好的粘度、表面活性、蛋白质可混性以及良好的稳定性和乳化性。CN102965318B公开了一种产胞外多糖的嗜热链球菌，该菌株在42℃条件下用M17培养液发酵30小时产胞外多糖148mg/L,胞外多糖可明显提高发酵乳的粘度和凝胶强度。CN104232548A公开了一株假单胞菌，其合成的凝胶多糖为胞外多糖，将发酵条件优化，凝胶多糖产量可达5.94g/L。
此外，不同的微生物菌株往往产生不同类型的胞外多糖，不同的胞外多糖也具有不同的结构和/性能。到目前为止,已大量投产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellangum)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多糖(Curdlan)等。
如何开发生产胞外多糖的新菌种、开发新型的胞外多糖以及提高胞外多糖的产量，是微生物多糖领域技术人员面临的问题。
发明内容
在现有技术已有开发微生物多糖的基础上，本发明提供一株高产细菌胞外多糖的假单胞菌，并利用该菌株发酵制备胞外多糖及进行多糖纯化。该菌株能够转化甘油、葡萄糖、淀粉、柠檬酸钠等产生凝胶型胞外多糖。
发明人从海洋真菌发酵生产DHA的发酵培养污染物中采用常规方法分离筛选得到一株高产胞外多糖的假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2016年1月14日，保藏编号为CCTCCNo:M2016035，保藏地址：中国武汉武汉大学,其具有如下生物学特征：
菌株SFEP-01菌落及形态特征：固体培养菌落圆形，凸起，边缘整齐，表面光滑，淡黄色、半透明状；30℃培养24小时，菌落直径约1mm，培养48小时，菌落直径约3-5mm(菌落形态见附图1，附图2)；菌株SFEP-01为杆菌，不形成芽胞，菌体形态直或稍弯、两端形状不规则，大小0.5～0.8μm×1.5～3.0μm(菌体形态见附图3)，液体培养12小时染色可见菌体外多糖物质(见附图4)。
菌株SFEP-01生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度28-30℃，在25℃生长良好；利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，接触酶阳性；生理生化实验结果详见表1。
表1菌株SFEP-01的部分生理生化特征
注：“+”生长良好或呈阳性；“-”不生长或呈阴性。
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述用于菌落形态观察的固体培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂15-20，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
以本发明的菌株SFEP-01的全基因组DNA为模板，采用细菌16SrDNA通用引物PCR扩增该菌株16SrRNA基因序列，扩增产物测序得到长度为1399bp的序列(如序列表SEQIDNO:1所示)，使用美国生物工程信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的菌株SFEP-0116SrRNA的基因序列与NCBI注册的多株浅黄色假单胞杆菌(Pseudomonasluteola)和一些未被完全鉴定的假单胞菌的16SrRNA的基因序列具有99％的同源性，生理生化试验结果与《常见细菌系统鉴定鉴定手册》中浅黄色假单胞杆菌的特征符合度较高(参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》科学出版社，2001，第一版，p172)，系统发育树表明该菌株与已知浅黄色假单胞杆菌亲缘关系与其他未鉴定假单胞杆菌菌株(Pseudomonassp.)没有显著区别，因此，将该菌株初步鉴定为假单胞菌菌种(Pseudomonassp.)。
发明人在发酵过程中发现，利用菌株SFEP-01发酵生产多糖，摇瓶发酵最终发酵液因为多糖的产生呈固体凝胶状，说明本发明所述假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵产生多糖具有极强凝胶活性。
本发明的一个目的在于提供一种微生物胞外多糖的制备方法，包括：
1)利用假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液；
2)将步骤1)得到的胞外多糖发酵液加水稀释，离心，收集上清液，真空浓缩至原体积，加乙醇进行醇沉，收集沉淀干燥后即得胞外多糖粗品。
其中，具体的，上述步骤1)中利用假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵的方法包括步骤如下：
①将假单胞菌SFEP-01接种于新鲜斜面菌种培养基上，25-30℃培养1-2天得活化菌体；
②将步骤①制得的活化菌体接种于液体种子培养基中，25-30℃培养8-24小时，得种子液；
③将步骤②制得的种子液接种至发酵培养基，25-30℃发酵48－72小时至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01斜面菌种培养基为(g/L)：葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5,琼脂粉15-20,pH值调至7.0-7.2。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01液体种子培养基为(g/L)：碳源10-60，酵母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5,硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵培养基为(g/L)：碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01液体种子培养基和产胞外多糖发酵培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01产胞外多糖发酵的培养温度优选为28±2℃。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01液体种子培养时间优选为12-14小时。
上述假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01产胞外多糖发酵培养时间优选为60-70小时。
优选的，上述步骤2)中，发酵液(呈凝胶状)加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离心10-20min，收集上清液然后再40-60℃真空浓缩至原发酵液体积，加入1-3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。
进一步的，本发明所述胞外多糖的制备方法，还包括：
步骤3)取按上述方法制取的SFEP-01菌株胞外多糖粗品，加缓冲液溶解分散，经DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离，收集洗脱液，经检测得到两个分离组分EPSⅠ和EPSⅡ，分别收集EPSⅠ和EPSⅡ，适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，获得SFEP-01菌株胞外多糖组分EPSⅠ和EPSⅡ。
优选的，胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶解分散形成胶体溶液。
DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-SepharoseFastFlow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡，将粗多糖样品用0.05mol/L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离。
葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为：将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-SepharoseFastFlow分离的单一组分浓缩上样，用相同的缓冲液洗脱，洗脱流速1-2BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥得到EPSⅠ和EPSⅡ纯品。
分别对EPSⅠ和EPSⅡ进行酸水解，水解产物通过纸层析和HPLC分析显示，EPSⅠ水解产物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三种成分(见附图6)，EPSⅡ水解产物中只有葡萄糖(见附图7)。
经检测SFEP-01菌株胞外多糖具有抗氧化活性，还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力与维生素C相当。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明利用分离获得的假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01进行胞外多糖的制备，利用甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉等可发酵产生凝胶型胞外多糖,经发酵条件适当优化后，SFEP-01菌株发酵胞外多糖产率可达8-12g/L；
(2)本发明进一步分离纯化了假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01胞外多糖的组分，该菌株所产细菌胞外多糖经鉴定主要含有两种成分：EPSⅠ和EPSⅡ，EPSⅠ为杂多糖，单糖残基为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPSⅡ为均一多糖，单糖残基为葡萄糖；
(3)本发明利用获得的假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01生产的胞外多糖具有抗氧化活性，还原能力(见图8)和清除超氧阴离子自由基的能力(见图9)与维生素C相当。
附图说明
图1假单胞杆菌SFEP-01菌株在平板上的培养24小时的菌落特征。
图2假单胞杆菌SFEP-01菌株在平板上的培养48小时的菌落特征。
图3假单胞杆菌SFEP-01菌株在液体培养基中培养12小时的菌体特征。
图4假单胞杆菌SFEP-01菌株在液体培养基中培养24小时的菌体特征。
图5假单胞杆菌SFEP-01菌株产胞外多糖经DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离洗脱曲线。
图6假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖EPSⅠ水解后HPLC谱图。
图7假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖EPSⅡ水解后HPLC谱图。
图8假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖粗品及EPSⅠ、EPSⅡ还原能力的测定
图9假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖粗品及EPSⅠ、EPSⅡ清除超氧阴离子自由基的能力的测定
具体实施方式
实施例1菌株的分离
发明人在进行海洋真菌发酵生产DHA的过程中发现染菌现象，逐进行污染菌种分离，获得SFEP-01菌株，进一步研究发现该菌株可以利用常见碳源产生大量胞外多糖，经生理生化鉴定和16SrDNA测序分析，鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)。
实施例2碳源对假单胞菌SFEP-01菌株产细菌胞外多糖的影响
将28℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，28℃培养14小时，按体积比5％的接种量接入到添加不同碳源的摇瓶发酵培养基中，28℃培养68小时，结束发酵。称取1g发酵产物，加水稀释150倍，稀释液采用苯酚硫酸法测定的胞外多糖产率。SFEP-01菌株利用不同碳源胞外多糖的产量见表2.
表2碳源对SFEP-01菌株产胞外多糖的影响
斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖2，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
发酵用液体种子培养基组成(g/L)葡萄糖20，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉6，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
发酵培养基组成(g·L-1)：碳源60，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉3，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。。
实施例3假单胞菌SFEP-01发酵胞外多糖的分离纯化及定性鉴定
利用SFEP-01菌株发酵生产细菌胞外多糖的方法：
取25-30℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基，25-30℃培养8-24小时，接种摇瓶发酵培养基，25-30℃摇瓶发酵48－72小时至发酵液呈凝胶状。适量称取发酵产物(因为发酵结束时，发酵液呈凝胶状，因此取样采用称重方式)，采用苯酚硫酸法测定其多糖含量。
SFEP-01菌株产细菌胞外多糖的粗多糖的制取：
发酵结束后，发酵液(呈凝胶状)加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离心10min，收集上清液然后再浓缩至原发酵液体积，加入3倍无水的乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。
假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01斜面菌种培养基为(g/L)：葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5,琼脂粉15-20。pH值调至7.0-7.2。
假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01液体种子培养基为(g/L)：碳源10-60，酵母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5,硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01产胞外多糖发酵培养基为(g/L)：碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01液体种子培养基和产胞外多糖发酵培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。
假单胞杆菌(Pseudomonassp.)SFEP-01所产细菌胞外多糖分离纯化及定性鉴定：
取按上述方法制取的SFEP-01菌株所产细菌胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶解溶解分散形成胶体溶液，经DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离，得到两个组分EPSⅠ和EPSⅡ(见附图5)，分别收集EPSⅠ和EPSⅡ适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，结果仍为单一组分。将收集的EPSⅠ和EPSⅡ，分别进行酸水解，水解产物通过纸层析和HPLC分析显示，EPSⅠ水解产物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三种成分(见附图6)，EPSⅡ水解产物中只有葡萄糖(见附图7)。
DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-SepharoseFastFlow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡。将粗多糖样品用0.05mol/L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离。
葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为：将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-SepharoseFastFlow分离的单一组分浓缩上样，用相同的缓冲液洗脱，洗脱流速1-2BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥，用于多糖水解定性分析。
SFEP-01菌株发酵液中多糖含量以及柱层析收集液中的多糖含量的采用苯酚硫酸法测定，具体操作方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)p6。
EPSⅠ和EPSⅡ酸水解方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)p157
水解产物纸层析分析方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)p10
水解产物HPLC分析方法：进样浓度110-50g/L。色谱柱：HypersilAPS-2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈:水＝80:20(V/V)；流速：0.5mL/min；进样量：10uL；柱温：30℃。
实施例4假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01产胞外多糖的制备
将28℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，28℃培养14小时，按体积比5％的接种量接入到添加不同碳源的摇瓶发酵培养基中，28℃培养68小时，结束发酵。收集发酵液(凝胶状)约1L，苯酚硫酸法测多糖含量为10.85g/L，加水稀释50倍，6000r/min离心10min，收集上清液然后再浓缩至原发酵液体积约1L，加入3倍95％的乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心，收集沉淀，冷冻干燥，得胞外多糖粗品8.32g。
取上述制取的细菌胞外多糖粗品，加300倍缓冲液溶解分散，分次(每次上样量20ml)上样过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离(3.5×40)，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1.5BV/hr，5ml收集1管，检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，得到EPSⅠ和EPSⅡ两个洗脱峰，，分别收集，将收集液浓缩至多糖含量大约1g/L，再用葡聚糖凝胶G-100柱层析，将收集液浓缩至多糖含量10-20g/L，再加3倍无水乙醇沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，共得到EPSⅠ5.42g，EPSⅡ1.86g。
斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
发酵用液体种子培养基组成(g/L)甘油20，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉6，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
发酵用培养基组成(g·L-1)：甘油60，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉3，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
实施例5假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01产胞外的抗氧化活性
收集菌株SFEP-01发酵液加水稀释30倍，8000r/min离心10min，收集上清液然后再浓缩至原发酵液体积，加入3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再离心收集沉淀，冷冻干燥，得胞外多糖粗品。
取上述制取的细菌胞外多糖粗品，加缓冲液溶解分散，过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离，得到EPSⅠ和EPSⅡ两个洗脱峰，再用葡聚糖凝胶G-100柱层析，将收集液浓缩至多糖含量10-20g/L，再加3倍无水乙醇沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，共得到EPSⅠ、EPSⅡ纯品。
将上述制取的细菌胞外多糖粗品和EPSⅠ、EPSⅡ，分别配制成溶液，以维生素C为对照测定多糖的还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力，结果显示多糖粗品和EPSⅠ的还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力与维生素C相当(见图8、图9)。
上述多糖还原能力的测定方法：配制不同浓度的样品溶液，取25mL比色管，加入样品溶液1.0mL,加入0.2M、pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL，加入1％的铁氰化钾溶液2.5ml，混合均匀，50℃恒温水浴20min，取出冷水冷却，再加入10％的三氯乙酸溶液2.5mL终止反应，4000rpm离心取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和0.1％的三氯化铁溶液0.5mL，混合均匀，静置10min，以去离子水做对照，在700nm处测吸光度，吸光度值越大表示还原力越强。以相同浓度的的维生素C作为阳性对照。
上述清除超氧阴离子自由基的能力的测定方法：配制不同浓度的样品溶液，取25mL比色管，加入pH8.0的50mMTris缓冲液4.5mL，加入样品溶液2mL，37℃恒温水浴10min，再加入预温的7mM邻苯三酚0.2mL，混合均匀，继续在37℃的恒温水浴4min，加入两滴浓盐酸(10M)终止反应，在320nm处测吸光度。
清除率计算：
清除率(％)＝[1-(Ab-Ac)/Aa]×100％
Aa为不加样品，加入邻苯三酚时的吸光度；
Ab为加入样品和邻苯三酚的吸光度；
Ac为加入样品不加邻苯三酚的吸光度。
实施例5假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵产胞外多糖
将28℃培养1天的菌种斜面接种液体种子培养基，25℃培养16小时，按体积比10％的接种量接入到摇瓶发酵培养基中，30℃培养68小时，结束发酵。称取1g发酵产物，加水稀释150倍，苯酚硫酸法测定的胞外多糖含量为11g/L。
斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
发酵用液体种子培养基组成(g/L)甘油20，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉6，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
发酵用培养基组成(g·L-1)：甘油60，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉3，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
实施例6假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵产胞外多糖
将28℃培养1.5天的菌种斜面接种液体种子培养基，28℃培养10小时，按体积比10％的接种量接入到摇瓶发酵培养基中，28℃培养72小时，结束发酵。称取1g发酵产物，加水稀释150倍，苯酚硫酸法测定的胞外多糖产率为11.85g/L。
发酵用液体种子培养基组成(g/L)甘油20，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉6，硫酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
发酵用培养基组成(g·L-1)：甘油80，酵母浸粉5，氯化钠3，玉米浆粉5，硫酸铵1，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (8)

1.一种微生物胞外多糖的制备方法，包括：
1)利用保藏编号为CCTCCNo:M2016035的假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液；
2)将步骤1)得到的胞外多糖发酵液加水稀释，离心，收集上清液，真空浓缩至原体积，加乙醇进行醇沉，收集沉淀干燥后即获得胞外多糖粗品。
2.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)中假单胞菌(Pseudomonassp.)SFEP-01发酵的方法包括步骤如下：
①将假单胞菌SFEP-01接种于新鲜斜面菌种培养基上，25-30℃培养1-2天得活化菌体；
②将步骤①制得的活化菌体接种于液体种子培养基中，25-30℃培养8-24小时，得种子液；
③将步骤②制得的种子液接种至发酵培养基，25-30℃发酵48－72小时至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液。
3.根据权利要求2所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，斜面菌种培养基为(g/L)：葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5,琼脂粉15-20,pH值调至7.0-7.2；
液体种子培养基为(g/L)：碳源10-60，酵母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5,硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2；
发酵培养基为(g/L)：碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
4.根据权利要求2所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，液体种子培养基和产胞外多糖发酵培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。
5.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中，发酵液加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离心10-20min，收集上清液然后再40-60℃浓缩至原发酵液体积，加入1-3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。
6.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，还包括：
步骤3)取步骤2)制取的胞外多糖粗品，加缓冲液分散，经DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离，得到EPSⅠ和EPSⅡ两个组分，分别收集EPSⅠ和EPSⅡ适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，获得SFEP-01菌株胞外多糖组分EPSⅠ和EPSⅡ纯品。
7.根据权利要求6所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶解分散形成胶体溶液；
DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-SepharoseFastFlow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡，将粗多糖样品用0.05mol/L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离；
葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为：将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-SepharoseFastFlow分离的单一组分浓缩上样，用相同的缓冲液洗脱，洗脱流速1-2BV/hr，每管收集5mL,检测收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥。
8.根据权利要求1-7任一项制备方法制备得到的胞外多糖。
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