CN102851353A - 一种蝉棒束孢菌株的分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本专利涉及分子生物技术领域，公开了一种蝉棒束孢菌株CGMCCNO.3453的分子鉴定方法，包括如下步骤：提取菌株的基因组DNA；采用引物ITS5和ITS4对基因组的内转录间隔区的DNA扩增，对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；将纯化后DNA片段做双向测序；将测得DNA序列与SEQIDNO:3作比对；若比对结果表明，待测菌株ITS序列与SEQIDNO:3的内容和排列顺序一致，则待测菌株就是蝉棒束孢CGMCCNO.3453菌株。本发明的方法可快速，可靠及准确地鉴定蝉棒束孢菌株CGMCCNO.3453，而且该鉴定方法结果不受环境因素影响。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及了建立一种蝉棒束孢菌株(保藏号：CGMCCNO.3453)的分子生物学的鉴定方法。
背景技术
蝉花是蝉棒束孢Isaria cicadae Miquel的通用名(蝉棒束孢Isaria cicadae Miquel＝蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson)，是某些蝉若虫受蝉棒束孢菌寄生后形成的产物，是一种菌虫复合体，由Miquel于1838年定名。
本专利涉及的蝉棒束孢菌株(Isaria cicadae Miquel)已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC NO.3453。
本菌株是从云南三门源头采集野生蝉花标本，经人工培养和反复纯化分离获得本专利所述的蝉棒束孢菌株(CGMCC NO.3453)。他属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢纲Hyphomyceles，束梗孢目Stilbellales，束梗孢科Stilbellaceae，棒束孢属ISaria。其主要形态特征为：
在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，背面浅黄色，直径5～6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。
本菌株经试验证实其培养物易生长和产量高的特点，经药理学实验显示具明显的镇痛、镇惊和解热等功效，且含有丰富生物活性物质和营养素，是一种功效与冬虫夏草近似的珍贵药材，具有广泛开发药品和保健品的前途。
由于地理环境来源不同，寄主不同可造成蝉棒束孢菌株间的次生代谢产物具有较大的差异，而这种差异依靠传统鉴别方法难以区别，因为传统方法对虫生真菌的鉴别和种内变异及菌系特征分析均采用形态特征、生长特性及生物活性物质测定进行区别鉴定，缺乏从菌株的基因水平上确定种的本质所在，往往出现较多鉴定误差，所以迫切需要建立一种较本质、较科学、较先进的鉴别技术。本专利就是克服以上不足，运用分子遗传学技术，并结合生物信息学分析，建立一种以基因组中内转录间隔区(ITS)的DNA序列为基础的的分子标志，为本菌株的种属鉴定提供一种分子水平上、快速、可靠、精确、科学及不受环境影响的鉴别菌株新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种蝉棒束孢菌株(Isaria cicadae Miquel)CGMCC NO.3453的分子生物学的鉴定方法。
本发明的具体方法步骤如下：
1)提取待测菌株的基因组DNA；
2)采用ITS5和ITS4这对引物对步骤1)提取的基因组DNA作PCR扩增；
引物序列如下：
ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3’(SEQ ID NO：1)
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO：2)：
3)扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，观察DNA扩增结果；
4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；
5)将纯化后DNA片段做双向测序；
6)将测得DNA序列与蝉棒束孢菌株CGMCC NO.3453的ITS序列(SEQ ID NO：3)作比对；
7)若比对结果表明，待测菌株ITS序列与SEQ ID NO：3的内容和排列顺序完全一致时，则待测菌株就是蝉棒束孢CGMCC NO.3453菌株。
步骤2)所述PCR扩增体系为：每20ul反应体系，内含1×EX PCR缓冲液、1.5mMdNTP、正反向引物各10pmol、EX Tag酶1u和DNA样本200ng及加ddH20至20ul。
步骤2)所述PCR扩增条件为：94℃3分钟为1个循环；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒为38个循环；最后72℃7分钟延伸。
蝉棒束孢菌株CGMCC NO.3453的ITS nrDNA序列经引物ITS5/ITS4扩增获得的PCR产物序列长度为613bp，包括18S rDNA部分序列，转录间隔区I(ITS1)，5.8S r DNA和转录隔区II(ITS2)的全部序列以及28S r DNA的部分序列。其序列为SEQ ID NO：3，其中，1-116为18S rDNA部分序列；117-238为ITS1(238bp)；239-396为5.8S r DNA(396bp)；397-555为ITS2(554bp)的全部序列；及556-613为28S r DNA部分序列。
研究表明，由ITS5与ITS4引物扩增的蝉棒束孢CGMCC NO.3453的ITS序列具有种系特异性，不仅与种内蝉棒束孢菌株有差别，相似度为99％，而且与属内其他虫生真菌具有更显著差异，相似度为83-98％，尤其与7株蝉棒束孢相比在ITS1和ITS2两个区域中共有10个位点发生变异，不相一致。上述研究结果提示，内转录间隔区DNA碱基序列的特异性可作为本菌株的分子标记，用于菌株的鉴别诊断。因此认为，本发明的鉴定方法可以成为本菌株在分子水平上的种属鉴定依据，并且，本发明的鉴别方法快速可靠，可准确地鉴定蝉棒束孢菌株CGMCCNO.3453，并且检测结果不受环境因素影响。
附图说明
图1蝉捧束孢CGMCC NO 3453与ABO86631比对结果
图2蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AB086630比对结果
图3蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AB085886比对结果
图4蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AB085887比对结果
图5蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AB085888比对结果
图6蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AY624175比对结果
图7蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AF368801比对结果
图8蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AF368807蛹棒束孢比对结果
图9蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AJ786590冬虫夏草比对结果
图10蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AB027380细脚拟青霉比对结果
图11蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AF237664粉棒束孢比对结果
图12蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AF368808细脚棒束孢比对结果
图13蝉捧束孢CGMCC NO 3453与AY624181粉棒束孢比对结果
图中，Query对应蝉捧束孢CGMCC NO 3453的序列，Sbjct对应比对序列
具体实施方式
以下列举具体实施例进一步阐明本发明可性行和科学性，应理解实例并非用于限制本发明的保护范围
实施例1
试验步骤：
1)常规方法培养蝉棒束孢CGMCC NO.3453菌株后，提取该菌株的基因组DNA；
提取基因组DNA方法：
采用氯仿抽提和异丙醇沉淀DNA的常规方法，先将液态培养菌丝体用灭菌水清洗2次，然后悬于含3M异硫氰酸胍的TEN-3(50mM Tris-Hcl，100mM EDTA，50mM Nacl，PH＝8.3)溶液中，在冰浴上匀浆破碎后，加入700ul提取液(50mM Kcl，10mM Tris-Hcl，PH＝8.3，2.5mMMgcl2，0.1mg/ml白明胶，0.45％NP40，0.45％Tween 20)另加入6ul(10mg/m1)蛋白酶K，混匀后置55℃、1小時水浴，结束后用等量氯仿抽提2次，加入等量异丙醇，于-20℃冰箱过夜，然后15000r/min离心15min(4℃)取沉淀，用70％酒精清洗1次，1×TE溶解DNA，保存于-20℃冰箱待用。
2)采用ITS5和ITS4一对引物对上述提取基因组DNA作PCR扩增；
I TS5：5’-GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3’
I TS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
PCR扩增反应体系如下：总反应体系为20ul，内含1×EX PCR缓冲液、1.5mMdNTP、一对各为10pmol引物、EX Tag酶1u(TakaRa产品)和DNA样本200ng及加ddH2O至20ul。PCR扩增反应的顺序如下：94℃3分钟为1个循环；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒为38个循环；最后72℃7分钟延伸。上述扩增反应在美国ABI公司2720型PCR仪上完成。
3)扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，观察DNA扩增结果，获得613bp大小的DNA片段；
4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；
回收和纯化PCR产物，采用Micorocon-30试剂盒(Millipore产品)，按试剂盒提供的操作步骤进行。
5)将纯化后的DNA片段，应用双脱氧测序原理，采用测序引物分别为ITS5和ITS4，在ABI3130XL测序仪上做双向测序。
6)结果为SEQ ID NO：3，应用NCBI中的BLAST软件进行DNA序列相似性检索。
7)与种内各蝉棒束孢ITS序列比较
将本菌株的测序结果与Gen Bank登记的7株种内蝉棒束孢：AB086631，AB086630，AB085886，AB085887，AB085888，AY624175和AF368801的ITS序列作BLAST比对结果表明相似性均达到99％，具体数据见表1。
表1蝉棒束孢rDNA基因ITS5/ITS4间序列比对*
*--表示缺失
由表1可见蝉棒束孢CGMCC NO.3453与种内7个菌株间存在差异，但差异程度甚少。
具体的，由图2可见，蝉棒束孢CGMCC NO.3453的ITS nrDNA序列与7株种内蝉棒束孢菌株比对结果表明，相似性达到99％，并不是100％一致，具体是：
与AB086631(SEQ ID NO：4)比对，在ITS的碱基位置第32位处，A→T、第41位处T→A、第138位处T→C、第461位处A→G、第570位处C→G；
与AB086630(SEQ ID NO：5)比对，在ITS的碱基位置第32位处，A→T、第41位处T→A、第570位处C→G；
与AB085886(SEQ ID NO：6)比对，在ITS的碱基位置第32位处，A→T、第41位处T→A、第570位处C→G；
与AB085887(SEQ ID NO：7)比对，在ITS的碱基位置第32位处，A→T、第41位处T→A、第570位处C→G；
与AB085888(SEQ ID NO：8)比对，在ITS的碱基位置第32位处，A→T、第41位处T→A、第570位处C→G；
与AY624175(SEQ ID NO：9)比对，在ITS的碱基位置第461位处A→G；
与AF368801(SEQ ID NO：10)比对，在ITS的碱基位置第508位处缺失C；
另在蝉棒束孢CGMCC NO.3453菌株的第8、9、26、58、420、432、433、446、447、504位处分别插入T、A、C、C、G、G、A、C、G和C碱基。
但是，5.8S rDNA序列在他们之间均无差异，完全一致。
8)与种外6株虫生真菌属菌株ITS序列比较
由国际基因库(6en Bank)中检索出6株虫生真菌属菌株，与本菌株的ITS序列作比对。这6株菌株为：蛹棒束孢(Isaria militaris＝paecilomyces militaris)，登记号为AF368807，冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，登记号为AJ786590；2株细脚棒束孢(Isaria tenuipes＝paecilomyces tenuipes)，登记号为AB027380和AF368808；2株粉棒束孢(Isaria farinosus＝paecilomyces farinosus)，登记号为AF237664和AY624181。经比对后差异性比种内具更显著差异，结果详见表2。
表2蝉棒束孢CGMCC NO.3453与种外虫生真菌ITS序列比较
具体的，由图3可见，与GenBank中检索出6株属内虫生真菌ITS的DNA序列相比时，相似度为83-98％，差异较显著。具体差异如下：
与蛹棒束孢(AF368807)(SEQ ID NO：11)相比时，在可比对的579碱基中有63个碱基不一致，相似度89％；
与冬虫夏草(AJ786590)(SEQ ID NO：12)相比时，在可比对的176碱基中有31个碱基不一致，相似度83％；
与细脚棒束孢(ABO27380)(SEQ ID NO：13)相比时，在可比对的540碱基中有13个碱基不一致，相似度98％；
与细脚棒束孢(AF368808)(SEQ ID NO：14)相比时，在可比对的543碱基中有15个碱基不一致，相似度98％；
与粉棒束孢(AF237664)(SEQ ID NO：15)相比时，在可比对的543碱基中有15个碱基不一致，相似度98％；
与粉棒束孢(AY624181)(SEQ ID NO：16)相比时，在可比对的533碱基中有19个碱基不一致，相似度97％。
由上述试验可见，ITS序列可成为蝉棒束孢CGMCC NO.3453菌株在分子水平上种属鉴定依据。
Claims (3)
1.一种蝉棒束孢菌株CGMCC NO.3453的分子鉴定方法，包括下列步骤：
1)提取待测菌株的基因组DNA；
2)采用ITS5和ITS4这对引物对步骤1)提取的基因组DNA作PCR扩增；
ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’：
3)扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，观察DNA扩增结果；
4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；
5)将纯化后DNA片段做双向测序；
6)将测得DNA序列与SEQ ID NO：3作比对；
7)若比对结果表明，待测菌株ITS序列与SEQ ID NO：3的内容和排列顺序完全一致，则待测菌株就是蝉棒束孢CGMCC NO.3453菌株。
2.如权利要求1所述蝉棒束孢菌株CGMCC NO.3453的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增体系为：每20ul反应体系，内含1×EX PCR缓冲液、1.5mMdNTP、正反向引物各10pmol、EX Tag酶1u和DNA样本200ng及加ddH2O至20μl。
3.如权利要求1所述蝉棒束孢菌株CGMCC NO.3453的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增条件为：94℃3分钟为1个循环；而后94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒为38个循环；最后72℃7分钟延伸。
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