CN110295221B - 一种蝉花菌株的rapd分子标记鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蝉花单17‑7‑1菌株的鉴定方法，包括提取待检测菌株的DNA；对待检测菌株DNA采用引物S11进行PCR扩增；获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；将获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果。采用本发明鉴定方法，可快速、准确的鉴定蝉花单17‑7‑1菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种蝉花菌株的鉴定方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉花寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名，如蝉草Cordyceps cicadae，辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii，辛克莱虫草Cordycepssinclairii，辛克莱棒束孢Isaria sinclairii，基生棒束孢Isaria basili，丛生虫壳菌Torrubia caespitosa，哈里棒束孢Isaria hariottii，小蝉茸Cordyceps sobolifera，蒙克苏棒束孢Isaria mokanshawii和多枝棒束孢Isaria arbuscula等等。
常采到的是蝉花及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉花寄生后的虫菌复合体。蝉花属半知菌类真菌，其子实体自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0cm，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。
该蝉花采用如下方法进行培养：从液氮中取出蝉花单17-7-1和其他不同地域蝉花的保藏样品，在超净工作台上将其接到PSA斜面培养基上，22℃-25℃培养10d，然后在超净工作台将PSA斜面培养基中长好的蝉花接到SAAY液体培养基中，22℃-25℃摇菌24h，收集菌丝并液氮速冻，-80℃保存备用。
蝉花单17-7-1的主要形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10d，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，直径5～6cm。菌丝无色，分枝，具有隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。
蝉花单17-7-1经实验验证，其培养物具有易于培养、产量高的特点，具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。
由于地理来源不同、寄主不同的蝉花，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。本专利的目的是利用RAPD分子标记技术鉴定蝉花单17-7-1菌株和其他不同地域蝉花的区别。
发明内容
本发明的目的在于提供蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，提取待检测菌株的DNA；
步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增，S11：GTAGACCCGT(SEQ ID NO：1)；
步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；
步骤4，将步骤3获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果。
进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系如下：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。
进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃40秒，38℃1分钟，72℃2分钟，共循环40次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。
进一步的，所述步骤4中，将步骤3获得的RAPD条带图谱进行分析，如果待检测菌株在3000bp～2000bp之间具有一条条带，则鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株。
本发明涉及的蝉花菌株为浙江泛亚生物医药股份有限公司所有，编号为单17-7-1已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。
本发明有益效果：
本发明通过筛选大量的随机引物最终获得本发明引物，该引物具有非常高的特异性，具有唯一的特异性条带(在3000bp～2000bp之间)，能很好的区分生产菌株单17-7-1和其他不同地域蝉花。
由于目前其他菌株并未进行过全基因组测序，如果要从整个基因组区分不同地域蝉花分子水平的不同，则需要对其他不同地域蝉花进行重测序(每个样至少还需要三次重复)，再进行个体差异性分析，需要消耗大量的金钱，大量的时间。相对于以往的蝉花全基因组测序结果，本发明RAPD分子标记只是一段10nt碱基的引物随机结合到DNA上的，只需通过PCR和电泳就能得到结果，具有耗时短，价格低，操作简便的特点。
附图说明
图1为引物S6对应的RAPD条带图谱；
图2为引物S7对应的RAPD条带图谱；
图3为引物S10对应的RAPD条带图谱；
图4为引物S30对应的RAPD条带图谱；
图5为引物S31对应的RAPD条带图谱；
图6为引物S33对应的RAPD条带图谱；
图7为引物S37对应的RAPD条带图谱；
图8为引物S46对应的RAPD条带图谱；
图9为引物S61对应的RAPD条带图谱；
图10为引物S67对应的RAPD条带图谱；
图11为引物S92对应的RAPD条带图谱；
图12为引物S103对应的RAPD条带图谱；
图13为引物S136对应的RAPD条带图谱；
图14为引物S140对应的RAPD条带图谱；
图15为引物S151对应的RAPD条带图谱；
图16为引物S216对应的RAPD条带图谱；
图17为引物S219对应的RAPD条带图谱；
图18为引物S11对应的RAPD条带图谱；
图19为引物S9对应的RAPD条带图谱；
图20为引物S12对应的RAPD条带图谱；
图21为引物S21对应的RAPD条带图谱；
图22为引物S34对应的RAPD条带图谱；
图23为引物S35对应的RAPD条带图谱；
图24为引物S36对应的RAPD条带图谱；
图25为引物S41对应的RAPD条带图谱；
图26为引物S42对应的RAPD条带图谱；
以上图1-17中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为IC407的PCR结果,泳道3为15LQ4的PCR结果,泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为16JR41的PCR结果，泳道6为Marker，泳道7为16JR42的PCR结果，泳道8为15AX22的PCR结果，泳道9为16AJ26的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为14DBS50的PCR结果；
以上图18中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果；
以上图19-26中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ8的PCR结果,泳道3为15JJ10的PCR结果,泳道4为15JJ14的PCR结果，泳道5为15JJ18的PCR结果，泳道6为15AX27的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15AX30的PCR结果，泳道10为15AX36的PCR结果，泳道11为15AX39的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果；
图27为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
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泳道3为15JJ7的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
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泳道13为15AX30的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
图28为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
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泳道11为15JGS11的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道12为15JGS35的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道13为15JGS38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
图29为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为15LQ4的PCR结果，泳道7为14DBS50的PCR结果，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道2为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道3为15FY8的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；
泳道4为15FY13的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间；
泳道5为15FY14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；
泳道6为15LQ4的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，750bp～500bp之间；
泳道7为14DBS50的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
图30为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道2为15JJ5的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道3为15JJ7的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道4为15JJ8的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道5为15JJ10的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道6为15JJ14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；
泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道9为15JJ17的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道10为15JJ18的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道11为15AX22的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道12为15AX27的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道13为15AX30的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
图31为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道2为15AX33的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道3为15AX34的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道4为15AX36的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道5为15AX38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道6为15AX39的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道9为15JGS2的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道10为15JGS4的RAPD条带大小估算为无；
泳道11为15JGS11的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道12为15JGS35的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；
泳道13为15JGS38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
图32为引物S11对应的RAPD条带图谱
泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为15LQ4的PCR结果，泳道7为14DBS50的PCR结果，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
泳道2为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道3为15FY8的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道4为15FY13的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间；
泳道5为15FY14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；
泳道6为15LQ4的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，750bp～500bp之间；
泳道7为14DBS50的RAPD条带大小估算为5000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。
具体实施方式
以下实施例所用蝉花单17-7-1菌株于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453；其他不同地域蝉花分别采集自安溪(编号分别为：15AX22，15AX27，15AX30，15AX33，15AX34，15AX36，15AX38，15AX39)、九江(编号分别为：15JJ5，15JJ7，15JJ8，15JJ10，15JJ14，15JJ17，15JJ18)、井冈山(编号分别为：15JGS2，15JGS4，15JGS11，15JGS35，15JGS38)、富阳(编号分别为：15FY8，15FY13，15FY14)、大别山(编号为：14DBS50)、乐清(编号为：15LQ4)；编号安徽繁昌(IC407)、江苏句容(16JR41、16JR42)、浙江安吉(16AJ26)，以上菌株均为蝉棒束孢。
实施例1
基于RAPD技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，所述引物序列见表1。
表1引物序列
| 编号 | 引物名称 | 引物序列(5'到3') |
| SEQ ID NO：1 | S11 | GTAGACCCGT |
| SEQ ID NO：2 | S6 | TGCTCTGCCC |
| SEQ ID NO：3 | S7 | GGTGACGCAG |
| SEQ ID NO：4 | S10 | CTGCTGGGAC |
| SEQ ID NO：5 | S30 | GTGATCGCAG |
| SEQ ID NO：6 | S31 | CAATCGCCTG |
| SEQ ID NO：7 | S33 | CAGCACCCAC |
| SEQ ID NO：8 | S37 | GACCGCTTGT |
| SEQ ID NO：9 | S46 | ACCTGAACGG |
| SEQ ID NO：10 | S61 | TTCGAGCCAG |
| SEQ ID NO：11 | S67 | GTCCCGACGA |
| SEQ ID NO：12 | S92 | CAGCTCACGA |
| SEQ ID NO：13 | S103 | AGACGTCCAC |
| SEQ ID NO：14 | S136 | GGAGTACTGG |
| SEQ ID NO：15 | S140 | GGTCTAGAGG |
| SEQ ID NO：16 | S151 | GAGTCTCAGG |
| SEQ ID NO：17 | S216 | GGTGAACGCT |
| SEQ ID NO：18 | S219 | GTCCGTATGG |
| SEQ ID NO：19 | S9 | TGGGGGACTC |
| SEQ ID NO：20 | S12 | CCTTGACGCA |
| SEQ ID NO：21 | S21 | CAGGCCCTTC |
| SEQ ID NO：22 | S34 | TCTGTGCTGG |
| SEQ ID NO：23 | S35 | TTCCGAACCC |
| SEQ ID NO：24 | S36 | AGCCAGCGAA |
| SEQ ID NO：25 | S41 | ACCGCGAAGG |
| SEQ ID NO：26 | S42 | GGACCCAACC |
采用CTAB法提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用上述各引物进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。
其中PCR反应条件如下：
反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。
PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 40sec，38℃ 1min，72℃ 2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。
1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min；凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
检测结果见图1-26。由电泳图可以看出，除引物S11(图18)外，其他引物的电泳图中不同地域蝉花与单17-7-1菌株都具有一条或者多条相同的电泳条带，还有个别引物PCR结果无条带。只有引物S11的电泳图中单17-7-1菌株在3000bp～2000bp之间具有一条独有的条带，而其他不同地域的蝉花并不具有，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花。
实施例2
以实施例1筛选得到的引物S11建立对蝉花单17-7-1的鉴定方法。
RAPD指纹图谱稳定性实验1：
试验操作：
1.采用CTAB法提取同一批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。
2.PCR反应条件如下：
反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。
PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 40sec，38℃ 1min，72℃ 2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。
3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min。
4.凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
实验结果：
以S11为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱分别如图27、图28、图29所示。
从电泳图谱上看，以同一批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段是一致的。
从以上试验结果可以得出，RAPD检测DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。
RAPD指纹图谱稳定性实验2：
试验操作：
1.CTAB法提取不同批次的蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。
2.PCR反应条件如下：
反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。
PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 40sec，38℃ 1min，72℃ 2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。
3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V 40min。
4.凝胶成像仪(Alphamager)拍摄。
实验结果：
以S11为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱如图30、图31、图32所示。
从电泳图谱上看，以不同批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段基本是一致的。
从以上试验结果可以得出，RAPD检测不同样本DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。
从中可见采用引物S11，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花的不同，因此利用RAPD分子标记技术并以引物S11作为鉴定蝉花单17-7-1的方法非常可行。
序列表
<110> 浙江泛亚生物医药股份有限公司
<120> 一种蝉花菌株的RAPD分子标记鉴定方法
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagacccgt 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctctgccc 10
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgacgcag 10
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgctgggac 10
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgatcgcag 10
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatcgcctg 10
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcacccac 10
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaccgcttgt 10
<210> 9
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acctgaacgg 10
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcgagccag 10
<210> 11
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcccgacga 10
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagctcacga 10
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agacgtccac 10
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggagtactgg 10
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtctagagg 10
<210> 16
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagtctcagg 10
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtgaacgct 10
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtccgtatgg 10
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgggggactc 10
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccttgacgca 10
<210> 21
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caggcccttc 10
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tctgtgctgg 10
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttccgaaccc 10
<210> 24
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agccagcgaa 10
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
accgcgaagg 10
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggacccaacc 10
Claims (3)
1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，提取待检测菌株的DNA；
步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用引物进行PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO：1；
步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；
步骤4，将步骤3获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果；
所述步骤4中，将步骤3获得的RAPD条带图谱进行分析，待检测菌株在3000bp ~2000bp之间具有一条条带，鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株；
所述蝉花单17-7-1菌株的保藏号为CGMCC No. 3453。
2. 如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系为：总体积50 μL，DNA样本：50 ng，dNTP：6 nmol，引物：20 pmol，Taq酶：2 U，Buffer：5 μL，加ddH2O至50 μL。
3. 如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃ 40秒，38℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共循环40次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。
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|---|---|---|---|---|
| CN102010909A (zh) * | 2010-11-18 | 2011-04-13 | 东北制药（沈阳）科技发展有限公司 | 鉴定地衣芽孢杆菌bl63516菌株的专用rapd引物、鉴定方法及鉴定用基因序列 |
| CN102643895A (zh) * | 2011-02-22 | 2012-08-22 | 上海泛亚生命科技有限公司 | 一种蝉拟青霉菌株的鉴定方法 |
| CN102851353A (zh) * | 2011-06-28 | 2013-01-02 | 上海泛亚生命科技有限公司 | 一种蝉棒束孢菌株的分子鉴定方法 |
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2018
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Patent Citations (3)
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| CN102010909A (zh) * | 2010-11-18 | 2011-04-13 | 东北制药（沈阳）科技发展有限公司 | 鉴定地衣芽孢杆菌bl63516菌株的专用rapd引物、鉴定方法及鉴定用基因序列 |
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