CN115287196A - 一株出芽短梗霉及其在生产胞外多糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株出芽短梗霉及其在生产胞外多糖中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株出芽短梗霉GC02‑5‑42，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GC02‑5‑42的保藏编号为CCTCC NO:M 2022155；所述出芽短梗霉GC02‑5‑42在代谢过程中产生的胞外多糖能够有效降低脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型中的炎症因子NO，具有一定的抗炎作用，并且，所述出芽短梗霉GC02‑5‑42在代谢过程中产生的胞外多糖无细胞毒性，因此，所述出芽短梗霉GC02‑5‑42在制备具有抗炎作用的产品中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株出芽短梗霉及其在生产胞外多糖中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
微生物多糖(microbial polysaccharides，MPS)是细菌、真菌、藻类等微生物在代谢过程中产生的糖类高聚物，包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、荚膜多糖(capsularpolysaccharide，CPS)、胞外多糖(exopolysaccharides，EPS) 等多种类型。其中，短梗霉属(Aureobasidium spp.)的一些真菌在发酵过程中会产生以普鲁兰多糖为代表的一些成分复杂的胞外多糖复合物。这些短梗霉属真菌来源的胞外多糖复合物常具有优越的理化性质以及特殊的材料学特性和流变学特性，在材料、石油、食品、化工、医药、环保等领域有十分广泛的应用。同时，这些短梗霉属真菌来源的胞外多糖常具有特殊的生理活性。因此，短梗霉属真菌来源的胞外多糖是极具开发价值的一类微生物多糖。
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是短梗霉属家族的一个分支。现阶段，已经找到多株可以在代谢过程中产生具有特殊生理活性胞外多糖的出芽短梗霉。例如，Yoshuiyuki Kimura等人分离出了一株出芽短梗霉GM-NH-1A1，此出芽短梗霉GM-NH-1A1在代谢过程中产生的胞外多糖具有很强的抗肿瘤活性(具体可参见文献：Kimura Y,Sumiyoshi M,Suzuki T,etal.Antitumor and Antimetastatic Activity of a NovelWater-soluble Low Molecular Weight-1, 3-D-Glucan(branch-1,6)Isolated fromAureobasidium pullulans 1A1 Strain Black Yeast[J].Anticancer Research,2006(26):4131-4142.)；Nobuyuki Hayashi等人发现经过水热处理的出芽短梗霉胞外多糖Kururu no
能够抑制炎症因子NO，但是，抑制效果并不佳，在1000μg/mL的剂量下才能够显著抑制炎症因子NO的产生(具体可参见文献：Nobuyuki,Hayashi,Yumi,etal.Hydrothermal processing ofβ-glucan from Aureobasidium pullulans producesa low molecular weight reagent that regulates inflammatory responses inducedby TLR ligands[J]. Biochem Biophys Res Commun,2019(511(2)):318-322.)。
目前，在代谢过程中产生的胞外多糖能够显著抑制炎症因子NO的出芽短梗霉尚未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株出芽短梗霉GC02-5-42，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GC02-5-42的保藏编号为CCTCC NO:M 2022155。
本发明还提供了一种胞外多糖，所述胞外多糖是由上述芽短梗霉产生的。
本发明还提供了一种生产上述胞外多糖的方法，所述方法为：将上述出芽短梗霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液进行提取，得到上述胞外多糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为：于25～30℃、50～220rpm 下培养120～168h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、酵母提取物以及抗坏血酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蔗糖40～60g/L、酵母提取物5～7g/L以及抗坏血酸3～5g/L。
本发明还提供了上述出芽短梗霉或上述方法在制备胞外多糖方面的应用。
本发明还提供了上述出芽短梗霉或上述胞外多糖或上述方法在制备具有抗炎作用的产品中的应用。
本发明还提供了一种具有抗炎作用的产品，所述产品的成分包含上述胞外多糖。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为具有抗炎作用的药品、药品佐剂、日化用品或营养添加剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一株出芽短梗霉GC02-5-42，所述出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)GC02-5-42的保藏编号为CCTCC NO:M 2022155；所述出芽短梗霉GC02-5-42在代谢过程中产生的胞外多糖能够有效降低脂多糖 (LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型中的炎症因子NO，具有一定的抗炎作用，并且，所述出芽短梗霉GC02-5-42在代谢过程中产生的胞外多糖无细胞毒性，因此，所述出芽短梗霉GC02-5-42在制备具有抗炎作用的产品中极具应用前景。
2、本发明提供了一种胞外多糖ap-1，所述胞外多糖ap-1是由出芽短梗霉 GC02-5-42芽短梗霉产生的；所述胞外多糖ap-1能够有效降低脂多糖(LPS) 诱导的RAW264.7细胞炎症模型中的炎症因子NO，具有一定的抗炎作用，并且，所述胞外多糖ap-1无细胞毒性，因此，所述胞外多糖ap-1在制备具有抗炎作用的产品中极具应用前景。
3、本发明提供了使用出芽短梗霉GC02-5-42生产能够显著抑制炎症因子 NO的胞外多糖的方法，所述方法使用由50g/L蔗糖、6g/L酵母提取物以及4g/L 抗坏血酸组成的发酵培养基对出芽短梗霉GC02-5-42进行发酵以获得含有能够显著抑制炎症因子NO的胞外多糖的发酵液；使用所述方法发酵得到的发酵液不含黑色素，有利于发酵液中胞外多糖的后续分离纯化。
生物材料保藏
一株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，分类学命名为出芽短梗霉 GC02-5-42(Aureobasidium pullulans GC02-5-42)，已于2022年02月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022155，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：菌株GC02-5-42的菌体形态特征。
图2：菌株GC02-5-42在全营养马铃薯葡萄糖琼脂培养基上的菌落形态特征(培养3d)。
图3：菌株GC02-5-42在全营养马铃薯葡萄糖琼脂培养基上的菌落形态特征(培养7d)。
图4：菌株GC02-5-42构建的系统进化树。
图5：胞外多糖ap-1对细胞增殖的影响。
图6：不同胞外多糖对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型中炎症因子NO的生成量的影响。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的培养基见表1。表1中，麦芽提取物、蛋白胨、酵母麦芽糖琼脂培养基(YM)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、察氏培养基(CDA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)和酵母胨葡萄糖培养基(YPD)购自OXOID(英国)，葡萄糖购自沪试(上海)，琼脂粉购自solarbio(北京)。为了模拟深海生物圈的低营养条件，除特殊说明外，表1中的各培养基在使用时均以1/5的浓度来模拟(即将表1中的各培养基用无菌水稀释5倍后使用)。并且，为了抑制细菌的生长，除特殊说明外，表1中的各培养基在使用时均额外添加50μg/mL的链霉素和50μg/mL的青霉素。
表1培养基及其成分
实施例1：出芽短梗霉GC02-5-42的分离及鉴定
具体步骤如下：
1、出芽短梗霉GC02-5-42的分离
以取自东太平洋的深海沉积物为样本，将样本用无菌水梯度稀释到10-1、 10-2、10-3；每个梯度取100μL稀释后的样品分别涂布到6个分别由麦芽浸出液琼脂培养基、察氏培养基、玉米粉琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、酵母麦芽糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的平板上后，于22℃下培养 7d；培养结束后，挑取6个平板上的菌落接种于由全营养的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(即未经无菌水稀释马铃薯葡萄糖琼脂培养基)制成的平板上后，继续于22℃下培养7d；重复上述过程，直至平板上只有一个菌落存在，得到菌株GC02-5-42；在显微镜下观察菌株GC02-5-42的菌体形态特征，观察结果见图1；在肉眼和体视镜下观察菌株GC02-5-42在全营养马铃薯葡萄糖琼脂培养基上的菌落形态特征，观察结果见图2～3。
由图1可知，菌株GC02-5-42的菌体呈卵圆形，菌体聚集成团，胞外有粘稠分泌物。
由图2可知，培养3d时，菌株GC02-5-42的菌落呈酵母样：粘稠、淡红色，显微镜下为菌落边缘呈现明显的根状，具有节孢子；由图3可知，培养7d时，菌株GC02-5-42的菌落呈深红色，局部成黑色，直径29mm。
2、出芽短梗霉GC02-5-42的鉴定
提取步骤1所得菌株GC02-5-42的基因组DNA，将菌株GC02-5-42的ITS 序列进行扩增和测序(菌株GC02-5-42的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，菌种鉴定的上游引物ITS4如SEQID NO.2所示，下游引物ITS5如SEQ ID NO.3所示)；将菌株GC02-5-42的ITS序列在NCBI中进行核酸序列比对，以相似度为≥97％的标准，挑选出与菌株GC02-5-42的ITS序列同源性相近的序列构建系统进化树，确定菌株GC02-5-42的种属关系，系统进化树见图4。
将图4的结果结合步骤(1)得到的菌体形态特征和菌落形态特征，确定菌株GC02-5-42为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，将其命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GC02-5-42。
将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GC02-5-42送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为：2022年02月25日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022155，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
实施例2：胞外多糖ap-1的制备
具体步骤如下：
1、发酵
挑取实施例1制得的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GC02-5-42的单菌落接种于100mL全营养的酵母胨葡萄糖培养基(即未经无菌水稀释酵母胨葡萄糖培养基)中后，于22℃下培养至OD600＝0.6，得到种子液；将种子液分别以5％(v/v)的接种量接种至1000mL发酵培养基1～3中后，于28℃、120rpm 下发酵7d，得到发酵液1～3；
其中，发酵培养基1的成分为：蔗糖50g/L、酵母提取物6g/L以及抗坏血酸4g/L；
发酵培养基2的成分为：葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L以及蛋白胨20g/L；
发酵培养基3的成分为：葡萄糖40g/L以及酵母提取物6g/L。
分别于发酵0h、3d、7d取发酵液1～3，将发酵液1～3分别于12000rpm离心1min后，取上清液1～3，分别检测上清液1～3在540nm处的吸光度，检测结果见表2。
由表2的检测结果可知，虽然使用发酵培养基1～3对出芽短梗霉GC02-5-42 进行发酵均可制得胞外多糖ap-1，但只有使用发酵培养基1对出芽短梗霉 GC02-5-42进行发酵制得的发酵液1中几乎没有黑色素生成。
表2发酵0h、72h、168h所得上清液1～3在540nm处的吸光值
2、提取
将步骤1发酵7d所得的发酵液1在85℃下加热30min杀灭出芽短梗霉 GC02-5-42后，于8000rpm下离心15min，收集上清液；向上清液中加入上清液4倍体积的无水乙醇后，于4℃冷冻16h，增加胞外多糖ap-1的析出量，得到冷冻液；将冷冻液于8000rpm下离心15min，收集沉淀；将沉淀溶于蒸馏水后，于-80℃冰冻24h，得到冻结物；将冻结物于-10℃、30pa的条件下进行冷冻干燥，得到胞外多糖ap-1冻干粉。
使用静态平衡法(参见中国药典)对胞外多糖ap-1冻干粉中胞外多糖的溶解度进行检测，检测结果为1％。
实验例1：胞外多糖ap-1对细胞增殖的影响实验
实验采用CCK-8法：CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法。CCK-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在细胞培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。该方法所用试剂为四唑盐--WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4- 硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，购自日本同仁化学研究所)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。具体步骤如下：
将实施例2制得的胞外多糖ap-1冻干粉用无菌超纯水溶解，得到胞外多糖ap-1浓度分别为30、100、300μg/mL的待测样本；将处于对数生长期的RAW264.7 细胞(购自上海细胞库)分别以5×105个/孔的接种量接种于添加有50μL含10％ (v/v)胎牛血清(购自corning，美国)的DMEM培养基(购自corning，美国) 的96孔板中后，于37℃培养24h；培养结束后，将浓度分别为30、100、300μg/mL 的待测样本以50μL/孔的添加量分别添加至96孔板中，于37℃下孵育24h，每个浓度的待测样品设4个复孔作为加样组，在加样组的基础上，另设4个不接种细胞的复孔作为空白组，4个仅添加等量溶媒(即无菌超纯水)的复孔作为对照组(即，加样组为细胞+培养基+待测样本，空白组为培养基+待测样本，对照组为细胞+培养基+溶媒)；孵育24h后，将CCK-8溶液(购自碧云天公司) 以10μL/孔的添加量添加至96孔板中，于37℃下继续孵育2h；继续孵育2h后，将96孔板于酶标仪上测定450nm处的OD值，并根据测得的OD值计算不同浓度的胞外多糖ap-1对RAW264.7细胞的抑制率，计算结果见图5；
其中，抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(1-[(OD加样-OD空白)/(OD对照-OD 空白)])×100％。
由图5可知，浓度分别为30、100、300μg/mL的待测样本对细胞的抑制率分别为100.4±0.42％、97.84±1.72％和95.65±3.02％，此结果说明胞外多糖ap-1 对于细胞的生长没有抑制作用，无细胞毒性。
实验例2：胞外多糖ap-1的抗炎实验
实验采用Griess法检测胞外多糖ap-1对RAW264.7细胞生成一氧化氮(NO) 的影响。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，生成NO进行免疫应答。因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。该实验利用脂多糖(LPS) 诱导细胞炎性反应，评价受试物在细胞水平抑制NO生成的活性，进而反映其抗炎活性。具体步骤如下：
将实施例2制得的胞外多糖ap-1冻干粉用无菌超纯水溶解，得到浓度分别为30、100、300μg/mL的胞外多糖ap-1溶液(XW-1)；将sg90β-葡聚糖(购自安琪酵母，具有增强免疫力的作用)用无菌超纯水溶解，得到浓度分别为30、 100、300μg/mL的sg90β-葡聚糖溶液(XW-2)；将地塞米松(dexamethasone) 用无菌超纯水溶解，得到浓度为100μg/mL的地塞米松溶液；将Raw264.7细胞 (购自上海细胞库)分别以5×105个/孔的接种量接种于添加有含10％(v/v)胎牛血清(购自corning，美国)的DMEM培养基(购自corning，美国)的96 孔板中后，于37℃培养24h；培养结束后，以地塞米松溶液作为阳性对照，将浓度分别为30、100、300μg/mL的胞外多糖ap-1溶液和浓度分别为30、100、 300μg/mL的sg90β-葡聚糖溶液以50μL/孔的添加量分别添加至96孔板中，每个浓度的胞外多糖ap-1溶液和sg90β-葡聚糖溶液设4个复孔作为加样组，在加样组的基础上，另设4个不接种细胞的复孔作为空白组，4个仅添加等量溶媒 (即无菌超纯水)的复孔作为LPS组(即，加样组为细胞+培养基+地塞米松/ 胞外多糖ap-1/sg90β-葡聚糖溶液，空白组为培养基+溶媒，LPS组为细胞+培养基+溶媒)；添加结束后，将脂多糖(LPS，购自solarbio公司)添加至96孔板中至终浓度为1μg/mL，于37℃下孵育24h；孵育24h后，将Griess试剂(购自 solarbio公司)以10μL/孔的添加量添加至96孔板中，于37℃下继续孵育2h；继续孵育2h后，将96孔板于酶标仪上测定548nm处的OD值，并根据测得的 OD值计算不同浓度的胞外多糖ap-1和sg90β-葡聚糖对脂多糖诱导的 RAW264.7细胞炎症模型中NO分泌的抑制率，计算结果见图6；
其中，抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(ODLPS-OD加样)/(ODLPS-OD 空白)×100％。
由图6可知，浓度分别为30、100、300μg/mL的胞外多糖ap-1溶液对NO 的抑制率分别为9.29±3.43％、24.64±2.43％和44.29±2.26％，此结果说明胞外多糖ap-1在大浓度时(300μg/mL)具有显著的抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO分泌的作用，且具有良好的剂量依赖性，即胞外多糖ap-1具有一定的抗炎活性；而浓度分别为30、100、300μg/mL的sg90β-葡聚糖溶液对 NO的抑制率分别为23.21±1.88％、5.00±4.97％、12.14±1.23％，此结果说明sg90 β-葡聚糖对于脂多糖诱导的RWA264.7细胞NO分泌没有显著作用，即sg90β- 葡聚糖不具备抗炎活性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 深圳大学
自然资源部第三海洋研究所
<120> 一株出芽短梗霉及其在生产胞外多糖中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 514
<212> DNA
<213> 出芽短梗霉
<400> 1
tgcctgcgga aggatcatta aagagtaagg gtgctcagcg cccgacctcc aaccctttgt 60
tgttaaaact accttgttgc tttggcggga ccgctcggtc tcgagccgct ggggattcgt 120
cccaggcgag cgcccgccag agttaaacca aactcttgtt attaaaccgg tcgtctgagt 180
taaaattttg aataaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300
tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc ctgttcgagc gtcattacac 360
cactcaagct atgcttggta ttgggtgccg tccttagttg ggcgcgcctt aaagacctcg 420
gcgaggcctc accggcttta ggcgtagtag aatttattcg aacgtctgtc aaaggagagg 480
acttctgccg actgaaacct ttatttttct cggt 514
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctccgctt attgatagc 19
Claims (10)
1.一株出芽短梗霉，其特征在于，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的保藏编号为CCTCC NO:M 2022155。
2.一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖是由权利要求1所述的芽短梗霉产生的。
3.一种生产权利要求2所述胞外多糖的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的出芽短梗霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液进行提取，得到权利要求2所述的胞外多糖。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：于25～30℃、50～220rpm下培养120～168h。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、酵母提取物以及抗坏血酸。
6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含蔗糖40～60g/L、酵母提取物5～7g/L以及抗坏血酸3～5g/L。
7.权利要求1所述的出芽短梗霉或权利要求3～5任一项所述的方法在制备胞外多糖方面的应用。
8.权利要求1所述的出芽短梗霉或权利要求2所述的胞外多糖或权利要求3～5任一项所述的方法在制备具有抗炎作用的产品中的应用。
9.一种具有抗炎作用的产品，其特征在于，所述产品的成分包含权利要求2所述的胞外多糖。
10.如权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品为具有抗炎作用的药品、药品佐剂、日化用品或营养添加剂。
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| Title |
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| HUIWON NO等: "Anti-inflammatory effects of β-1,3-1,6-glucan derived from black yeast Aureobasidium pullulans in RAW264.7 cells", INT J BIOL MACROMOL * |
| NOBUYUKI HAYASHI 等: "Hydrothermal processing of β-glucan from Aureobasidium pullulans produces a low molecular weight reagent that regulates inflammatory responses induced by TLR ligands", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMMUNICATIONS * |
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