CN105925572A - 一种dna编码微球及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA编码微球及其合成方法，编码微球由微球、通用引物、细胞编码、分子编码和捕获探针五部分组成，其合成包括如下步骤：(1)通用引物与微球的偶联；(2)将偶联有通用引物的微球与PCR反应溶液混合均匀，将单个微球包裹在油包水液滴中，继而将细胞编码DNA扩增到微球上；(3)分选出带有荧光的微球，去除不带荧光的微球，所得到的微球用变性试剂处理将微球上的双链DNA产物变成单链DNA；(4)将扩增有细胞编码DNA的微球与混合有分子编码DNA文库的反应溶液混合进行混合，将分子编码DNA反应到微球上；(5)经过PBS洗涤的微球，用变性试剂处理将双链DNA产物变成单链DNA完成DNA编码微球的合成。该方法具有设计简单、价格低廉、操作方便等优点。

Description

一种DNA编码微球及其合成方法
技术领域
本发明涉及一种DNA编码微球的合成方法，属于单细胞分析方法技术领域。
背景技术
细胞是生命体的组成以及生命活动的最基本单位。传统方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊人们对大脑、血液系统、免疫系统，及其组成这些系统的细胞之间异质性(heterogeneity)的认识。随着高通量测序技术的发展，单细胞测序技术已经成为单细胞分析的最重要的手段，它极大的提高了单细胞分析的效率和准确性。对单细胞基因水平的分析可以揭示细胞(特别是癌细胞)基因组中发生的突变以及结构变异，了解细胞之间对于药物的响应的差异性，需找到与这些病变细胞相关的特异性分子，这对现代的个性化治疗提供了一个重要的手段，可以更好的指导医学工作者对疾病的诊断和治疗，实现真正的疾病个性化治疗。
单细胞分析包括单细胞分离、单细胞裂解、基因组扩增以及测序和数据分析四个步骤。其中单细胞分离、基因组或转录组扩增，以及数据解读存在着各种各样的挑战。而传统的单细胞分离手段主要由有限稀释法、细胞流式分选以及显微操作三种方法，这些方法都不能保证能够非常准确的从血液、组织等实际样品中分离得到目的细胞。分离得到的单细胞中的极少量的基因组或者转录组(1pg-3pg)无法直接应用于检测分析，必须经过信号放大或者扩增，但是这种扩增通常都会因为起始原料太少产生明显的偏差性而不能代表单细胞中原始的信号。
传统的方法一次只能分析几个或者十几个细胞样品，当细胞数量增加到几十甚至成百上千个细胞时，传统的手段需要消耗相当多的时间以及人力物力，无法实现细胞的高通量快速分析，这需要相当大的财力以及自动化设备的投入。为了实现高通量单细胞基因组或者转录组分析，必须对单个细胞中的转录组进行标记，早期的方法是采用混合裂分法进行DNA合成编码微球(Brenner et al.(2000)Proc.Acad.Set USA 97:1665)，这种方法的缺陷在于在DNA编码的化学合成的效率不够高，每一轮碱基的合成都会有1％的序列没有偶联成功，以50-60个碱基长度的核酸序列为例，这种问题会导致微球上只有不到40％的序列是正确的全长序列。
发明内容
本发明针对现有DNA编码微球合成复杂、昂贵等问题，提出一种简单、便宜、高效的DNA编码微球合成方法。
本发明的技术方案为：
一种DNA编码微球，其特征在于：所述的编码微球包括微球、通用引物、细胞编码、分子编码和捕获探针五部分，其中通用引物用于PCR扩增测序使用，其一端和微球连接，另一端和细胞编码连接；细胞编码在单个微球是唯一的，不同微球上的细胞编码不同，细胞编码一端和通用引物连接，另一端和分子编码连接；分子编码在单个微球上是不同的，其一端和细胞编码连接，另一端和捕获探针连接；捕获探针用于捕获目标核酸分子。
在本发明中，所使用的微球优选为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)微球、羧基微球，T型或十字交叉型微流控芯片生成的琼脂糖微球、聚丙烯酰胺微球、聚乙二醇微球中的一种。
在本发明中，所述的通用引物为人工合成的一段寡核苷酸序列，其与一条DNA模板链的一端互补，其长度范围为18-30个碱基，由脱氧核糖核苷酸组成，通过酰胺键与微球连接。所述的DNA模板为任意。
在本发明中，所述的细胞编码为对细胞进行编码的随机DNA序列，在单个微球是唯一的，不同微球上的细胞编码不同，长度从6到16个碱基，其与通用引物通过亚磷酰胺键连接。
在本发明中，所述的分子编码为对单个细胞中的mRNA分子进行标记的随机DNA序列，在单个微球上的序列均不相同，长度从6到12个碱基，其与细胞编码序列通过亚磷酰胺键连接。
在本发明中，所述的捕获探针为一段重复的T碱基序列，用于捕获带有重复A碱基序列的mRNA，产度从18到30个碱基，与分子编码通过亚磷酰胺键连接。
一种DNA编码微球及其合成方法，包括如下步骤：
(1)通用引物与微球的偶联；
(2)将偶联有通用引物的微球与PCR反应溶液混合均匀，采用震荡或者微流控芯片的方法将单个微球包裹在油包水液滴中，继而进行数字PCR将细胞编码DNA扩增到微球上；
(3)萃取和洗涤除去油相，用流式细胞仪分选出带有荧光的微球，去除不带荧光的微球，所得到的微球用8M尿素处理将微球上的双链DNA产物变成单链DNA；
(4)将扩增有细胞编码DNA的微球与混合有分子编码DNA文库的反应溶液混合进行混合，将分子编码DNA反应到微球上；
(5)经过PBS洗涤的微球，用8M尿素处理将双链DNA产物变成单链DNA完成DNA编码微球的合成。
在本发明的较佳实施例中，步骤(1)中，所用的引物偶联方法可以为化学偶联、聚合等方式。
在本发明的较佳实施例中，步骤(2)中，所用的PCR反应液包括缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶、引物以及细胞编码DNA模板，单个油包水液滴中细胞编码DNA模板不超过一个。
在本发明的较佳实施例中，步骤(3)中，所用的萃取洗涤方式为加入环己烷和PBS缓冲液混匀后离心去掉上清，三次重复后得到所需微球。
在本发明的较佳实施例中，步骤(3)中，细胞编码微球采用流失细胞分选的方法筛选，去除不含有荧光的微球。
在本发明的较佳实施例中，步骤(3)中，所用DNA单链化方式为加入8M尿素孵育15min，然后用超纯水洗涤多次去掉尿素。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)中，将分子编码DNA文库反应到微球上的方法可以为连接酶反应、PCR反应等。
在本发明的较佳实施例中，步骤(5)中，所用DNA单链化方式为加入8M尿素孵育15min，然后用超纯水洗涤多次去掉尿素，三次重复后得到所需微球。
在本发明的较佳实施例中，一种DNA编码微球的合成方法，引物偶联的方式可以采用氨基DNA与琼脂糖的希夫碱反应，其具体步骤如下：(1)将琼脂糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠活化1min；(2)加入氨基修饰的DNA与活化的琼脂糖室温反应2h后，将琼脂糖置于4℃冷冻1h；(3)将冷凝成固态的琼脂糖置于电泳槽中，100V电泳1h去除自由未反应的引物，然后对DNA进行定量完成DNA的偶联固定。
在本发明的较佳实施例中，引物偶联连接的方式可以采用acrydite-DNA与丙烯酰胺的共聚反应，其具体步骤如下：(1)将丙烯酰胺、acryidte-DNA、过硫酸铵混合后，抽真空除氧气5min；(2)再加入引发剂四甲基乙二胺，混匀后，抽真空聚合30min即可。
在本发明的较佳实施例中，可以采用N-羟基琥珀酰亚胺微球与氨基DNA的偶联方式，步骤(1)中，将10-500μM氨基DNA与NHS琼脂糖微球在碳酸氢钠缓冲溶液(pH 7-9)中反应过夜即可。
在本发明的较佳实施例中，可以采用羧基微球与氨基DNA的偶联方式，步骤(1)中，将10-500μM氨基DNA、0.5M EDC与羧基微球在0.1M MES缓冲溶液(pH 4.7-6)中反应过夜即可。
在本发明的较佳实施例中，使用的微流控芯片可以为T型、十字交叉型微流控芯片。
在本发明的较佳实施例中，步骤(1)中，所用的微球的材料可以为丙烯酰胺、乙二醇双丙烯酸酯、琼脂糖等。
在本发明的较佳实施例中，采用低熔点的琼脂糖作为水凝胶微球制备原料，包括如下步骤：(1)将琼脂糖与共价连接在聚合物上的正向引物混匀作为水相溶液；(2)将道康宁硅油5225C、道康宁硅油749、硅油Ar20以4:3:3的比例混匀作为油相；(3)利用十字形玻璃芯片生成均匀的油包琼脂糖液滴；(4)生成的油包琼脂糖液滴放入4℃孵育1h，然后取出后加入五倍体积的环己烷和三倍体积的超纯水洗涤三次，即可得到偶联有引物的琼脂糖微球。
在本发明的较佳实施例中，采用丙烯酰胺、乙二醇双丙烯酸酯作为水凝胶微球制备原料，包括如下步骤：(1)将丙烯酰胺或者乙二醇双丙烯酸酯、过硫酸铵以及acydite-修饰的引物混匀作为水相溶液；(2)将道康宁硅油5225C、道康宁硅油749、硅油Ar20以4:3:3的比例混匀作为油相；(3)利用十字形玻璃芯片生成均匀的油包丙烯酰胺液滴，生成的液滴通入含有10％四甲基乙二胺的油相中引发丙烯酰胺聚合形成微球；(4)在生成的油包聚丙烯酰胺微球加入五倍体积的环己烷和三倍体积的超纯水洗涤三次，即可得到偶联有引物的丙烯酰胺微球。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)中，连接酶反应的混合溶液包括T4连接反应缓冲溶液、T4DNA连接酶、互补cDNA以及分子编码DNA文库，反应条件可以为室温2h、16℃8h。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)中，PCR反应的混合溶液包括缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶以及分子编码DNA模板，反应条件为56℃2h。
优选方法如下：
(1)合成丙烯酸亚磷酰胺单体
(2)甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化
以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1；合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水＝1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清；向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min；酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清；将得到的粗产物纯化；定量后真空浓缩；
(3)微球上引物的偶联
将一定浓度的丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、acrydite修饰的通用引物以及过硫酸铵混匀组成水相，将四甲基乙二胺与道康宁硅油混合液混合组成油相，通过十字形的微流控芯片生成均匀粒径的油包水液滴，液滴中的各种单体聚合形成聚合物，通用引物共价偶联在聚合物上。
(4)液滴数字PCR
将修饰有通用引物的水凝胶微球与PCR反应溶液混合均匀，采用震荡或者微流控芯片的方法将单个微球包裹在油包水液滴中进行数字PCR将细胞编码DNA扩增到微球上。
(5)DNA单链化
在上一步得到的微球溶液中加入三倍体积的环己烷和PBS，混匀后离心去除上清，如此循环三次后，加入三倍体积的8M尿素溶液处理15分钟，将双链DNA产物变成单链DNA，最后用PBS缓冲溶液洗去8M尿素溶液。
(6)微球上分子编码的连接
将扩增有细胞编码DNA的微球与T4连接反应缓冲溶液、T4DNA连接酶、互补cDNA以及分子编码DNA的连接反应溶液混合进行连接反应，将分子编码DNA连接到微球上
(7)DNA单链化
在上一步得到的微球溶液中加入三倍体积的8M尿素溶液处理15分钟，将双链DNA变成单链DNA，最后用PBS缓冲溶液洗去8M尿素溶液。
本发明的优点在于：首先，该方法在设计上简单可靠；其次，使用的核酸序列数目少，大大减少了制备编码微球的成本；最后，所使用的基质材料范围广泛，并且非常便宜。
本发明方法成本低廉，设计简单。
附图说明
图1为编码微球的组成过程示意图，编码微球由通用引物(universal primer)、细胞编码(cell label)、分子编码(UMI)、捕获探针(capture probe)四部分组成。
图2为实施例2生成共聚引物到聚丙烯酰胺微球所使用的玻璃微流控芯片及其形貌实物图(A:全貌；B:十字交叉部分)。，微通道尺寸如下：十字交叉处220μm×140μm(水相×油相)，垂直通道(油相)270μm，水平通道(水相)360μm，通道深度70μm。
图3为编码微球合成的流程图
图4为实施例3合成的单分散聚丙烯酰胺微球的尺寸表征，可以看到微球尺寸均一，都在60μm左右。(左图为合成的单分散聚丙烯酰胺微球显微镜图像，右图为统计的单分散聚丙烯酰胺微球的粒径分布图)
图5为实施例4液滴数字PCR扩增细胞编码。圆圈所代表的为含有单个细胞编码模板扩增后的微球，其他微球则由于处于无细胞编码模板的液滴中，没有进行细胞编码的扩增。(左上为细胞编码浓度为1fM时液滴数字PCR扩增的显微图像明场图，左下为该浓度下的荧光图像；右上为细胞编码浓度为10fM时液滴数字PCR扩增的显微图像明场图，左下为该浓度下的荧光图像)。
图6为实施例6微球上分子编码的连接。用荧光标记的DNA(A21)与微球杂交，偶联有分子编码的微球发出荧光，其他微球则没有荧光。(左上和右上图均为显微镜的明场图像，左下和右下为显微镜的荧光图像)。
具体实施方式
材料：
表1试剂和材料
在以下实施例中，所用的通用引物序列、细胞编码、分子编码、捕获探针以及其他DNA序列如表2所示：
表2实施例1中所用DNA序列
其中，N和J分别代表碱基ATCG中的任意一种。
实施例1核酸分子的合成与纯化
以普通可控微孔玻璃珠(CPG)作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成表1所示的DNA序列。合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水＝1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥，溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。
实施例2十字形玻璃微流控芯片的制作
使用AutoCAD软件画出芯片的二维结构，并制作掩膜版。利用软光刻技术将图形转移到铬板玻璃上，显影坚膜去铬层后，将芯片置于腐蚀液(HF:HNO3:H2O＝1:2:17)中腐蚀100min，即可获得芯片结构，并去除剩余的光刻胶和铬层。采用打孔机用1.8mm的钻头进行打孔。之后将芯片放入食人鱼洗液(浓硫酸/H2O2，v:v＝3:1)中加热40min以保证芯片的洁净。用超纯水、丙酮、超纯水、硫酸、超纯水依次超声清洗，保证芯片的清洁。将刻蚀有结构的玻璃芯片与同样材料的平面玻璃用铁夹子固定在一起，放入马弗炉中程序控温将两块玻璃键合在一起。控温程序如下：以10℃/min从室温升到100℃，保持1h；以10/min从100℃升到600℃，保持3h；以10℃/min从100℃降到室温，结束。在制作好的玻璃芯片的通道中依次通入超纯水、丙酮、超纯水、硫酸、超纯水清洗，用氮气吹干后通入1％十八烷基三氯硅烷的甲苯溶液对通道进行疏水化处理，再用甲苯清洗通道后氮气吹干待用。
图2为生成共聚引物到聚丙烯酰胺微球所使用的玻璃微流控芯片及其形貌图，微通道尺寸如下：十字交叉处220μm×140μm(水相×油相)，垂直通道(油相)270μm，水平通道(水相)360μm，通道深度70μm。
实施例3聚丙烯酰胺微球的生成
事先配制好油相和分散相，其中油相中各成分的配比为：40％(w/w)道康宁5225C，30％(w/w)道康宁749，30％(w/w)硅油Ar20，分散相为20％(w/v)丙烯酰胺，0.1％N,N’-甲叉丙烯酰胺，0.14％(w/v)过硫酸铵，16μM acrydite修饰的引物水溶液。实施例2制备的十字流聚焦芯片上生成大小均匀的丙烯酰胺液滴的过程：利用哈佛超高压精密注射泵分别将注射器中作为分散相的丙烯酰胺溶液和作为连续相的混合硅油分别从芯片的水平通道和两侧垂直通道注入。油相的流速为1mL/h，水相的流速为0.1mL/h，生成的丙烯酰胺液滴收集到含有10％四甲基乙二胺的油相溶液中进行聚合反应，得到聚丙烯酰胺微球。在该体系中加入3倍体积的环己烷，洗涤离心后去除有机相上清，重复2次后加入3倍体积的PBS缓冲溶液和3倍体积的环己烷，此时微球会分散在水相溶液中，离心去除上清后，重复该操作2次。最后用PBS清洗3次，放置于4℃保存。
实施例4微球数字PCR
按照表3所示配方配制各组的PCR反应液，Blank，A，B，C各组反应液中细胞编码DNA的最终浓度分别为每液滴含0，0.15，1，1.5个拷贝。将PCR反应液混合均匀后分别与100μL油相震荡产生油包水液滴，在热循环扩增仪上按照如下步骤扩增：(1)94℃，3min；(2)94℃-56℃-72℃，各30sec，循环40次；(3)72℃，5min；(4)4℃，3min。
表3.PCR反应溶液配方(微升)
实施例5单链化
在经过数字PCR的微球溶液中加入三倍体积的环己烷和PBS，混匀后离心去除上清，如此循环三次后，加入三倍体积的8M尿素溶液处理15分钟，将双链DNA产物变成单链DNA，最后用PBS缓冲溶液洗去8M尿素溶液。
实施例6分子编码的连接反应
将扩增有细胞编码DNA的微球与T4连接反应缓冲溶液、T4DNA连接酶、连接cDNA以及分子编码DNA的连接反应溶液混合进行连接反应，将分子编码DNA连接到微球上。
实施例7单链化
在上一步得到的微球溶液中加入三倍体积的8M尿素溶液处理15分钟，将双链DNA变成单链DNA，最后用PBS缓冲溶液洗去8M尿素溶液。

Claims (10)

1.一种DNA编码微球，其特征在于：所述的编码微球包括微球、通用引物、细胞编码、分子编码和捕获探针五部分，其中通用引物用于PCR扩增测序使用，其一端和微球连接，另一端和细胞编码连接；细胞编码在单个微球是唯一的，不同微球上的细胞编码不同，细胞编码一端和通用引物连接，另一端和分子编码连接；分子编码在单个微球上是不同的，其一端和细胞编码连接，另一端和捕获探针连接；捕获探针用于捕获目标核酸分子。
2.一种DNA编码微球的合成方法，包括如下步骤：
(1)通用引物与微球偶联；
(2)将偶联有通用引物的微球与PCR反应溶液混合均匀，将单个微球包裹在油包水液滴中，继而进行数字PCR将细胞编码DNA扩增到微球上；
(3)萃取和洗涤除去油相，分选出带有荧光的微球，去除不带荧光的微球，所得到的微球用变性试剂处理将微球上的双链DNA产物变成单链DNA；
(4)将扩增有细胞编码DNA的微球与混合有分子编码DNA文库的反应溶液混合进行混合，将分子编码DNA反应到微球上；
(5)经过PBS洗涤的微球，用变性试剂处理将双链DNA产物变成单链DNA完成DNA编码微球的合成。
3.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(1)中使用的微球为N-羟基琥珀酰亚胺微球、羧基微球，T型或十字交叉型微流控芯片生成的琼脂糖微球、聚丙烯酰胺微球，聚乙二醇微球中的至少一种。
4.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，具体步骤如下：1)将琼脂糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠活化1min；2)加入氨基修饰的通用引物与活化的琼脂糖室温反应2h后，将琼脂糖置于4℃冷冻1h；3)将冷凝成固态的琼脂糖置于电泳槽中，100V电泳1h去除自由未反应的引物，然后对DNA进行定量完成DNA的偶联固定；或
步骤(1)采用步骤如下：1)将丙烯酰胺、acryidte修饰的通用引物、过硫酸铵混合后，抽真空除氧气5min；2)再加入引发剂四甲基乙二胺，混匀后，抽真空聚合30min即可。
5.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，所用的PCR反应液包括缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶、引物以及细胞编码DNA模板，单个油包水液滴中细胞编码DNA模板不超过一个。
6.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，细胞编码微球的筛选方法为流失细胞分选和磁珠筛选，去除不含有荧光的微球；所用DNA单链化方式为加入8M尿素或者0.1M氢氧化钠溶液孵育15min，然后用超纯水洗涤多次去掉变性试剂。
7.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，将分子编码DNA文库反应到微球上的方法为连接酶反应或PCR反应。
8.如权利要求7所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：低熔点的琼脂糖水凝胶微球的制备步骤如下：(1)将琼脂糖与共价连接在聚合物上的通用引物混匀作为水相溶液；(2)将道康宁硅油5225C、道康宁硅油749、硅油Ar20以4:3:3的比例混匀作为油相；(3)利用十字形玻璃芯片生成均匀的油包琼脂糖液滴；(4)生成的油包琼脂糖液滴放入4℃孵育1h，然后取出后加入五倍体积的环己烷和三倍体积的超纯水洗涤三次，即可得到偶联有引物的琼脂糖微球。
9.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：聚丙烯酰胺水凝胶微球、聚乙二醇水凝胶微球的制备步骤如下：(1)将丙烯酰胺或者乙二醇双丙烯酸酯、过硫酸铵以及acydite-修饰的引物混匀作为水相溶液；(2)将道康宁硅油5225C、道康宁硅油749、硅油Ar20以4:3:3的比例混匀作为油相；(3)利用十字形玻璃芯片生成均匀的油包丙烯酰胺液滴，生成的液滴通入含有10％四甲基乙二胺的油相中引发丙烯酰胺聚合形成微球；(4)在生成的油包聚丙烯酰胺微球加入五倍体积的环己烷和三倍体积的超纯水洗涤三次，即可得到偶联有引物的丙烯酰胺微球。
10.如权利要求2所述的一种DNA编码微球的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，连接酶反应的混合溶液包括T4连接反应缓冲溶液、T4DNA连接酶、互补cDNA以及分子编码DNA文库，反应条件为室温2h、16℃、8h；PCR反应的混合溶液包括缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶以及分子编码DNA模板，反应条件为56℃，2h。
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