CN114316302A - 一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方 - Google Patents

一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，硅油配方包括：DOWSILTM RSN‑0749 Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基‑甲基硅氧烷)；所述的DOWSILTM RSN‑0749 Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基‑甲基硅氧烷)的体积配比比例会影响生成液滴的尺寸，在1:1至1:3之间可用于10‑20微米直径比液滴制作；在1:4至1:10配比适用于20‑40微米直径液滴的制作。本发明用本试剂配方制作出来的液滴稳定性好，数量多，硅油及水溶液试剂成分简单，生物兼容性好，取材方便，成本低，适用范围广泛。

Description

一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方
技术领域
本发明属于生物标志物灵敏检测技术领域、乳化技术领域，具体涉及一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方。
背景技术
液滴技术(油包水型)是生物标志物超灵敏检测中的常用技术，几十微升的待测溶液被分割成成千上万乃至数十万个液滴，包含目标分子的液滴会有显色反应，进而实现超灵敏的数字化检测。液滴技术可用于核酸检测，基于液滴的数字化PCR技术可用于病毒数量的检测应用。液滴具有样品间无扩散、可避免样品间的交叉污染、反应条件稳定、适当操控下可实现迅速混合等优点，是一种十分理想的微反应器。应用液滴进行检测，呈色反应是在pL级液滴中进行，液滴体积很小，显色产物(荧光产物)浓度较高，液滴将呈现为强亮斑，易于检测，灵敏度高。液滴还可用于包裹单细胞，进行单细胞分析(single cell analysis)等。使用液滴进行检测，灵敏度高，上样量少，成本较低，且液滴生成方式多样设计灵活，可塑性强，方便高效。
传统的液滴生成技术有高速搅拌法、超声破碎法、膜乳化法等。2003年日本科学家Michihiko Nakano等用机械搅拌的方法生成液滴，成功地实现核酸的数字化PCR检测。此方法是液滴用于数字化超灵敏检测的较早应用，所使用的液滴尺寸并不均一，此方法证实尺寸不均一液滴虽然使用限制较多，但是可进行生物标志物超灵敏检测应用。MichihikoNakano的方法中只使用了一种硅油(粘度20mPa.s)作为油相，以0.1％的Triton X-100作为表面活性剂，由磁力搅拌的方式生成液滴。由于方法原理及材料简单，高速搅拌法生成液滴在灵敏检测中仍有使用，如果在液滴制取的重要影响因素油相及水溶液相成分上进行升级改进，将能大大提高液滴品质。超声法是用超声波将油水混合液的水溶液打碎成为液滴，生成液滴尺寸普遍偏小。Marcel Margulies等人(Nature，2005)使用研磨珠震动研磨法大量制取小液滴，用于数字化PCR超灵敏检测，其使用的硅油配方为40％(w/w)DC 5225CFormulation Aid(Dow corning)，30％(w/w)DC 749Fluid(Dow corning)，与30％(w/w)Ar20 Silicone Oil。这一经典配方被广泛使用，这里DC 5225C Formulation Aid主要起乳化作用，在三种物质中只有此物质密度小于水，这一配方刚好使油相密度与水相同，可使制取液滴悬浮在油相中，利于液滴稳定。传统的液滴生成方法技术简单、成本低、产量大、速度快、可以规模化，至今仍在广泛应用，但是生成液滴尺寸均一性较差，使用范围有一定限制。
最近二十年微流控芯片技术发展迅速，微流控芯片技术在微纳流体操控方面有独特优势，基于微流控芯片的液滴生成技术发展迅速。较为经典的是“T”型通道法、流动聚焦液滴生成法，主要应用流体剪切作用生成液滴。2013年，Zeng等开发的微流控芯片装置可以精确控制液滴的尺寸和生成速度，液滴间的直径尺寸偏差不超过5％。基于微流控芯片的液滴生成技术其液滴产生方式均为单个产生，即一次只产生一个液滴，便于实现对液滴尺寸的精确控制，液滴品质较好。Bio-rad公司已经商业化生产基于微流控芯片技术的液滴制取装置及检测试剂。但是其设备、耗材昂贵，其用于液滴生成的油相为氟化油，成本较高，这也是基于微流控法的液滴发生技术的不足之处。
与液滴发生直接相关的油相与水相配方较为重要，除了要满足液滴发生需求，如便于液滴发生、液滴稳定性好外，还应该尽量实现成分简单、取材方便、成本低、生物兼容性好、应用范围广等要求。另外，微流控液滴制取中用于液滴发生的作用力与传统使用的高速搅拌法、超声破碎法相比普遍较小，力度温和，目前，其使用的油相不可用于高速搅拌法、超声破碎法。一套广泛适用的万能油相配方有待于开发。制作油包水型液滴，提高水相粘度可以降低水相的分散性，能有效减少细碎微滴及超大液滴的生成，可提高液滴尺寸均一性及稳定性。Richard Novak与Zeng等人于2011年提出使用向水溶液中添加琼脂糖的方法提高水相粘度，提升液滴稳定性，降低液滴生成后的相互融合作用。BSA(牛血清清蛋白)是生物大分子高聚物，溶液中添加BSA可以提高粘度和稳定性。BSA作为广大酶试剂的稳定剂及广泛在酶联免疫检测中充当降低非特异性吸附的Block(封闭)试剂，非常适用于生物检测。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方。本发明为液滴制作的成分简易而有效硅油及水溶液试剂配方，用于数字化PCR检测、低丰度蛋白检测等，解决检测中液滴融合的难题及试剂昂贵的问题，避免了使用表面活性剂给生物反应带来的负作用。开发适用于各种液滴制取方法的万能油相水相配方。
技术方案：一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，硅油配方包括：DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)；
所述的DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)的体积配比比例会影响生成液滴的尺寸，在1:1至1:3之间可用于10-20微米直径比液滴制作；在1:4至1:10配比适用于20-40微米直径液滴的制作；
水溶液中添加0.1％BSA试剂，提高水溶液粘度及液滴稳定性；
表面活性剂可能会影响生物试剂的活性，用于液滴包裹的硅油一般不需要添加表面活性剂，在微流控芯片液滴制取中可选择性添加0.1％的阴离子表面活性剂Triton X-100。
作为优化：所述的硅油配方可用于油包水型液滴中小液滴的制作。
作为优化：所述的小液滴直径尺寸为5-40微米，不超过50微米。
作为优化：适于基于液滴的数字化超灵敏检测应用。
有益效果：本发明用本试剂配方制作出来的液滴稳定性好，数量多，硅油及水溶液试剂成分简单，生物兼容性好，取材方便，成本低，适用范围广泛。
附图说明
图1是本发明的PCR反应后的液滴实物图；200倍放大。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，此硅油配方可用于油包水型液滴中小液滴的制作，小液滴直径尺寸为5-40微米，不超过50微米。本发明的液滴体积小，稳定性更高，耐高温，不需要表面活性剂维持稳定性，且液滴总数量更大，适于基于液滴的数字化超灵敏检测应用。
本发明用于液滴包裹的硅油成分为DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)。所述的DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)的体积配比比例影响生成液滴的尺寸，在1:1至1:3之间可用于10-20微米直径比液滴制作，1:4至1:10配比适用于20-40微米直径液滴的制作。
本发明中的水溶液中添加0.1％BSA试剂，提高水溶液粘度及液滴稳定性。
本发明中的表面活性剂可能会影响生物试剂的活性，本方法中用于液滴包裹的硅油一般不需要添加表面活性剂，在微流控芯片液滴制取中可选择性添加0.1％的阴离子表面活性剂Triton X-100。
使用此硅油配方用高速搅拌法生成液滴，可大量制取油包水型小液滴。经过长时间高温及快速变温的PCR反应后液滴依然稳定，没有发生融合，如图1所示。如此便达克服了PCR反应中液滴融合难题，液滴更为稳定，也降低了使用成本。
本发明用本试剂配方制作出来的液滴稳定性好，数量多，硅油及水溶液试剂成分简单，生物兼容性好，取材方便，成本低，适用范围广泛。

Claims (4)

1.一种用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，其特征在于：硅油配方包括：DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)；
所述的DOWSILTMRSN-0749Fluid(Dow Corning)和硅油AR 20(聚苯基-甲基硅氧烷)的体积配比比例会影响生成液滴的尺寸，在1:1至1:3之间可用于10-20微米直径比液滴制作；在1:4至1:10配比适用于20-40微米直径液滴的制作；
水溶液中添加0.1％BSA试剂，提高水溶液粘度及液滴稳定性；
表面活性剂可能会影响生物试剂的活性，用于液滴包裹的硅油一般不需要添加表面活性剂，在微流控芯片液滴制取中可选择性添加0.1％的阴离子表面活性剂Triton X-100。
2.根据权利要求1所述的用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，其特征在于：所述的硅油配方可用于油包水型液滴中小液滴的制作。
3.根据权利要求2所述的用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，其特征在于：所述的小液滴直径尺寸为5-40微米，不超过50微米。
4.根据权利要求1所述的用于油包水型小液滴制备的硅油及水溶液配方，其特征在于：适于基于液滴的数字化超灵敏检测应用。
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