发明内容
本发明人在这方面进行了大量的有益探索,并取得了诸多喜人的结果。
本发明的一个目的在于提供灯盏花和芍药在治疗和/或预防糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、脑细胞保护、老年痴呆症、视网膜中央静脉阻塞、高脂血症、脂肪肝等疾病中的应用。
以下对本发明作进一步阐述。
糖尿病及其并发症
至于本发明药物组合的有益作用,首先是在治疗合并性病症“糖尿病性无症状性心肌缺血”的过程中发现的。研究证实,本发明药物组合对糖尿病及其相关并发症具有极好的治疗效果。
研究表明,糖尿病性冠心病较非糖尿病性冠心病的发病率和死亡率均高3-4倍,尤其糖尿病可导致心脏微血管病变、大血管病变、心肌病变、糖尿病自主神经紊乱等,使糖尿病性无症状心肌缺血就更严重(
北京医学2003,25(2):84-85)。鉴于糖尿病及其并发症的发生机制非常复杂,学术界和临床对此也存在争议(J Am Coll Cardiol2003,41(1):1-7;Intern Med 2003,42(7):554-9;Exp Clin EndocrinolDiabetes 2002,110(5):212-8;Biol Pharm Bull 2003,26(12):1668-73;
山东医药2003,43(1):14-15),尚无切实可行的治疗方案(尤其是采用天然药物的疗法),且有些降糖药物之间的联用反而加重其心血管病变的发生。遗憾的是,已知技术不足以为本发明的联用方案提供足够的技术甚至理论上的支持。
我们根据以下机制设计了本发明药物联用:①芍药苷的降血糖机制与胰岛素无关,它是通过提高葡萄糖的利用度来发挥作用的,这对改善糖尿病心肌病发展过程中的高血糖及其代谢异常有积极意义;②芍药苷具有醛糖还原酶抑制作用,可抑制糖尿病中多元醇的异常代谢,能保持糖尿病在I/R过程中心肌细胞内较低的NADH/NAD+,维持细胞内较高的ATP,促进K+-Na+交换,从而抑制心肌细胞内钙超载对糖尿病性心肌的损伤;③灯盏花能扩张冠脉血管、增加冠脉血流量;④灯盏花能降低血粘度、抑制血小板聚集,增加缺血心肌侧枝循环供血,从而改善心肌缺血;⑤芍药苷对微循环的影响。
接下来的实验证明了这种有益效果:选择符合WHO冠心病以及WHO糖尿病(II型)诊断标准的患者80例,治疗前后各记录一次24h动态心电图和血糖,结果:本发明组合物组显效36例、有效31例、无效13例、有效率83.75%;芍药苷注射液组有效16例、无效64例、有效率20%;灯盏细辛注射液组有效42例、无效38例、有效率52.5%;硝酸甘油组有效15例、无效65例、有效率18.75%。这表明,本发明药物组合对糖尿病合并冠心病的相关病征有着极好的治疗效果,这是本领域技术人员无法预测的。
本发明组合还适于治疗糖尿病(尤其是II型糖尿病)、及其并发症例如糖尿病性肾病(DN)、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性神经病变、糖尿病合并高血压、高血脂症等。
期望不受任何理论或组方所限,在大量实验的基础上,本发明人推测这是由于芍药苷和野黄芩苷作用于不同靶点,尤其是在不同病理阶段发挥治疗作用,发挥了药物联用的整体治疗优势。尤其值得注意的是,与单独使用的灯盏花或芍药相比,本发明组合物显著降低了受试动物胰岛素抵抗及抗组织炎性反应。
心脑血管疾病、老年痴呆症
二者联用的有益效果并不仅局限于糖尿病及其并发症中。在进一步的研究中,我们惊奇地发现,本发明药物组合在心脑血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年痴呆症的治疗和/或预防中也表现出极好的治疗效果。
所述心脑血管疾病例如包括冠心病、脑卒中(也称脑中风)、心肌梗塞,和所述老年痴呆症包括阿尔茨海默病(简称AD)或脑血管性痴呆(简称VD)。
脑细胞保护
目前学术观点公认,在缺血性脑卒中急性期病程中,脑缺血再灌注损伤是影响预后的重要因素,降低再灌注损伤有助于保护脑细胞,减少细胞受损程度,改善预后。脑缺血再灌注损伤的机理有多种,自由基增多是公认的主要因素之一。目前已经上市的脑细胞保护剂(如依达拉奉等)其作用机制均为游离基清除剂,通过清除病变部位的游离基,阻断脑细胞受损过程,尽可能减少受损脑细胞数量以最大限度保留患者的正常机能,阻止病情的进一步恶化。由于本发明组合具有较强的清除自由基功效,因此本发明人针对此进行了研究,结果表明本发明组合在脑细胞保护方面具有显著效果。
高脂血症、脂肪肝
在针对上述疾病的研究中,还发现本发明组合具有调节血脂的作用。由于高脂血症是非酒精性脂肪肝患者的重要(特征性)表象,所以我们进一步进行了有关高脂血症、脂肪肝方面的研究,结果,我们惊喜的发现本发明组合同样具有良好的治疗效果。
心脑血管疾病复发
本发明的另一个重要发现是本发明组合在防止心脑血管疾病复发方面的有益效果。
心脑血管疾病是危害现代人健康的常见病和多发病,其发病率、病死率和致残率均很高。当前,心脑血管疾病发病后的治疗研究结果尚无法令人满意,但已公认这类疾病是可以预防的疾病(Sacco RL等,Cerebrovasc Dis 1999,(增刊3):37-44)。按照干预措施介入的时间,预防可通常分为两个阶段:“一级预防”,即对健康人群或存在心脑血管疾病危险因素、但尚无心脑血管疾病症状的人群开展预防。“一级预防”通常主要强调生活(行为)方式干预,而不倡导使用药物干预;和“二级预防”,即对已出现心脑血管疾病症状,如短暂性脑缺血发作(TIA)或已有缺血性卒中后痴呆发作史的病人开展预防,防止其再次发生同种疾病而采取的措施。在此,本发明术语“预防复发”是指“二级预防”。
虽然常规化学药物例如阿司匹林等可在一定程度上实现有效预防,但是有相当的局限性,甚至失败的案例也很多(参见王少华等,铁道医学1999年,27(2):136),临床上俗称为“阿司匹林抵抗”。同时,阿司匹林增加机体出血(尤其是上消化道出血)的危险性,相当一部分患者使用受限。并且,最近有报道,美国食品药品监督管理局(FDA)综合现有的研究数据认为,非甾体抗炎药存在增加心血管不良事件的可能性。目前,在临床实践中,还没有任何一种药物可以同时具有下述药理作用(特别是协同作用),临床医生被迫选择多种药物同时使用。而同时使用种类繁多的药物,很可能带来药物副作用的叠加(尽管报道很少,但临床医生实际应用药物时难以决策,往往是顾及药物副作用)。尤为不利的是,在众多复发危险因素中,究竟哪一种危险因素对复发起着主要作用,也没有明确结论,因此目前尚无一种药物是以“一级预防”或“二级预防”作为主要活性/适应症而上市的。
本发明人在此方面做了有益的尝试和探索,而且取得了诱人的成果。动物实验表明,野黄芩苷与芍药的组合在同时控制多个主要的复发危险因素方面表现出了出人意料的协同作用。鉴于时间及医学论理学因素,我们只进行了有限数量的缺血性脑卒中“二级预防”临床观察试验,但是已可以从中预测出本发明组合在心脑血管疾病“一级预防”、尤其是“二级预防”临床上的潜在应用前景。
根据试验结果,并结合目前国际公认的心脑血管疾病“一级预防”、“二级预防”循证医学证据,我们推测,本发明药物组合物之所以能有效地防止了心脑血管疾病的复发,极有可能是在以下作用中表现出的协同作用:
①抗血小板聚集作用(抑制血小板的聚集与分泌,改变血小板和管内皮细胞的前列腺素代谢途径,使血管内环境趋向防止血小板聚集、防止血栓形成及血管内皮破损);
②调节血脂作用(使甘油三酯和总胆固醇降低,高密度脂蛋白稍增加,肝脏合成极低密度脂蛋白减少,这三种变化都能积极防止动脉硬化的发生);
③调节糖代谢作用(将糖尿病患者的血糖水平控制在理想范围内,改善脂肪代谢障碍,控制胆固醇的合成);
④抗氧化作用(激活人体内的SOD,抑制自由基的作用,抑制脂质过氧化物对体内生物膜正常功能的破坏,减少动脉、尤其是小动脉的硬化机会);
⑤调节血压作用(降低血管的被动扩张,减少血管壁所受张力、通透性增加,防止血浆成分外渗;降低血管壁厚,改善其坚固性增加,防止出现平滑肌玻璃样变性和坏死);
⑥血管内皮细胞保护作用,降低血栓形成机会。
同时,鉴于心脑血管疾病二级预防的复杂性,本发明人期望不受任何理论的限制,所取得的有益效果皆由药理药效实验证明。有利的是,动物实验表明,本发明药物组合还表现出显著的抗炎性反应作用:施用本发明药物后,受试动物的动脉粥样硬化斑块形成的受抑制程度,与其体内炎性标志物CRP(或者MCP-1)的降低水平相平行,这明显提示本发明药物组合物通过抑制血管发生炎性反应,从而抑制了脂质沉着引起动脉硬化的机会,降低了脑卒中复发或死亡的重要危险因素。上述发现结合临床试验结果,进一步验证了本发明组合在缺血性脑卒中“二级预防”方面的应用潜力。
因此,本发明的另一个目的在于提供于灯盏花和芍药在制备用于防止心脑血管疾病复发的药物中的应用。在临床应用时,医师可以根据患者的年龄、体制、严重程度等因素,制定个体给药方案,例如给予1/5-1倍治疗/预防有效量的本发明药物组合物。众所周知,长期口服给药比较适于预防复发。
防止血管成形术后再狭窄
在现代临床医学实践中,微创伤的介入治疗已经得到广泛应用。其中,血管内支架置入成形术是介入治疗中重要手段之一,该手段应用在心梗、脑梗、大静脉血栓等疾病的治疗中取得了令人瞩目的短期疗效。但令人遗憾的是,血管内支架成形术后的血管再狭窄及再闭塞率居高不下,一年内的再狭窄率高达20%,三年可达50%。虽然药物涂层支架可以降低血管成形术后再狭窄(RS)的发生率,但其有效率仍然不能令人满意。也有报道使用某些药物(如抗生素、免疫抑制剂)可以降低RS的发生率,但显而易见的是,抗生素或免疫抑制剂的副作用使其并不适宜长期使用。
血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖,是RS的病理特征,抑制VSMCs异常增殖是预防RS的重要手段。我们的研究表明,本发明药物组合具有显著抑制VSMCs的作用,推测其机理是由于本发明组合物具有较强的抗炎及内皮细胞保护作用,可以有效抑制血管内皮细胞受损伤后产生的炎性反应,从而达到抑制VSMCs的作用。同时,由于本发明组合物具有副作用低下的优良特性,更适合长期给药,在防止RS中具有现有技术所不具备的优势。
功能性保健品
本发明的第三个目的在于本发明组合在制备功能性保健品中的应用。
由于本发明组合物具备上述功效,也符合功能性保健品安全性的要求。因此,本发明上述组合也可作为制备功能性保健食品的主要功能成分、或作为增益剂掺加到食品、饮料中,供适应人群长期使用。而且,在本发明试验的基础上,本领域技术人员可以理解的是,含有本发明上述组合的功能性保健品至少具有下述保健功能:辅助降血脂功能、辅助降血糖功能、抗氧化功能、辅助改善记忆功能、缓解视疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、化学性肝损伤辅助保护功能。
同样,功能性保健品制备技术也属于已知技术。相对于可药物而言,本发明组合物用于功能性保健品的来源、条件可以更为广泛和宽松。例如,可以选择灯盏花和芍药提取物,也可以选择含有野黄芩苷和咖啡酸酯的其它植物提取物或使用其化学全合成、半合成物。在功能性保健品的功效成分构成中,可以仅含有本发明组合,也可以是本发明组合加其它辅助或加强功效的成分,如:添加维生素E用以增强抗氧化功效,在此不再赘述。
本发明组合及相应制剂
本发明组合是指:以单独含有灯盏花、芍药的独立制剂形式供联合施用,或者以同时含有二者的组合物/产品形式提供。
因此,本发明的另一个目的在于提供用于含有芍药和灯盏花的药用组合物,其中以灯盏花中的野黄芩苷和芍药中的芍药苷计,二者的重量比例为0.05-10∶1,优选0.1-10∶1、0.1-5∶1,和更优选0.5-5∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。或者以灯盏花中的单/二咖啡酰奎宁酸和芍药中的芍药苷计,二者的重量比例为0.01-99∶1,优选0.1-20∶1,和更优选0.5-10∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。
本发明组合物中,可以选择药味(芍药、灯盏花)直接粉碎成粉末入药,也可以相当于上述中药材生药量的提取物或其他形式入药。因此,本发明药物组合物的活性组成包括药材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分,或者采用现有技术中已有的制品形式。例如,所述活性组成包括:
a).以芍药苷(Paeoniflorin)为主要活性成分的物质:芍药(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末、含有苷类化合物(优选为芍药苷和芍药内酯苷)的提取物、或芍药苷单体。另外,研究表明,同时含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷等的有效部位也是有益的。本领域技术人员可以理解的是,本发明芍药苷类的来源并不局限于芍药,含有芍药苷类的其它植物(例如牡丹皮)也可实现本发明,其提取和制备方法为已知技术,在此不作赘述。
b).以野黄芩苷(即灯盏乙素,Scutellarein)为主要活性成分的物质:灯盏花(又名灯盏细辛)的全草粉末、灯盏细辛的水提取物、灯盏细辛的低级醇提取物(含有野黄芩苷、单/二咖啡酰奎宁酸等的有效部位)、灯盏花素(含灯盏乙素、灯盏甲素及其它黄酮类成分)、或游离或钠盐形式的野黄芩苷单体。本领域技术人员可以理解的是,本发明野黄芩苷的来源并不局限于灯盏花,含有野黄芩苷的其它植物(例如黄芩、半枝莲等)也可实现本发明,其提取和制备方法为已知技术,在此不作赘述。
有利的是,上述活性成分当以提取物形式入药时,芍药苷在所述提取物中的纯度为2-98wt%、优选25%、50%、75%或92%,和野黄芩苷在所述提取物中的纯度为5-98wt%、优选40%、75%或96%。
在上下文中,“本发明药用组合”所涉及术语“灯盏花”、“芍药”具有上述定义。
下面的试验将证实:按照本发明描述的具有上述定义之“灯盏花”与“芍药”的组合,具有本发明所述的有益效果。鉴于现有技术中业已存在着相当成熟有效的制备上述定义组分的技术,在此不作重点描述。例如,可以采用现代提取和分离技术以提高活性物质的纯度、尽量除去不需要的杂质,类似的技术在现有技术中已相当成熟有效,例如:中国专利申请ZL01115358、ZL021109737、ZL021332983、ZL031131263、中草药(1998年,29(10):664-9)、中成药(1999年,21(12):644-5)、辽宁中医学院学报(2002年,4(1):24)、时珍国医国药(2003年,12(7):392-3);和ZL92108623、ZL00113019、ZL02110973、ZL02153750X、ZL03117754、ZL03141616、JP2000247890A、GB2317613A、中成药(2004年,26(10):855-6)。
可针对芍药苷类、野黄芩苷、咖啡酰奎宁酸的溶解特性和体内吸收特点(中国药科大学学报2003,34(01):65-9;沈阳药科大学学报1999,16(4):250-3;中国药理学通报1992,8(4):278-80),采用标准制剂技术,与药用辅料一起制成适宜的口服或非肠道给药剂型,类似的技术在现有技术中也已相当成熟有效,例如:片剂(ZL01115358、ZL03112999);分散片(ZL03112974、ZL02153445);口腔速崩片(ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256);缓控释制剂(ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、滴丸(ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222);软胶囊(ZL01117620);注射或输液剂(ZL93106319、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845);或含磷脂制剂(ZL03111469、ZL01138902、ZL03153496)。
本发明组合物临床使用中,示例性的每日口服推荐剂量为:灯盏花(以野黄芩苷计)10-200mg(优选40-120mg)、芍药苷10-120mg(优选30-80mg)。
本发明的上述药物组合克服了已有药物存在的作用单一、服药量大等缺点,代表了天然药物治疗和预防糖尿病及其并发症、老年痴呆症、心脑血管疾病、脑细胞保护、视网膜中央静脉阻塞、高脂血症、脂肪肝,以及预防心脑血管疾病复发的新趋势。
药理药效学试验研究
药物:本发明药物组合物(野黄芩苷+芍药苷,简称A);本发明灯盏花与赤芍的提取物(简称B);野黄芩苷;芍药苷。
一.糖尿病方面的药理作用
1.对糖尿病肾病的影响
糖尿病肾病病人36例,其中男25例,女11例,平均年龄65.63±7.1岁,平均空腹血糖(9.64±1.1)mmol/L。野黄芩苷组(简称注射1组,给药50mg)10例、芍药苷组(简称注射2组,给药50mg)10例、本发明组合物针剂(1∶1的野黄芩苷的芍药苷,给药50mg)16例,静脉注射,每日一次,共28天,分别观察用药前后血液流变学各项指标变化。标本取自静脉血,肝素抗凝,仪器为LG-R-20型血流变仪。
表1.治疗前后血液流变学指标的比较(X±S)
|
注射1 |
注射2组 |
本发明组合 |
组处理前 |
处理后 |
处理前 |
处理后 |
处理前 |
处理后 |
全血高切值(Cp)全血中切值H(Cp)全血低切值L(Cp)血浆粘度血沉(mm/h)红细胞压粒(%)全血高切还原粘度全血低切还原粘度 |
4.86±0.516.78±1.0510.22±1.101.82±0.0949.02±14.0140.42±6.019.06±1.129.06±3.1 |
4.41±0.53*6.07±0.989.78±1.211.72±0.11***48.55±13.9135.82±4.21*8.56±1.026.36±2.7* |
4.81±0.496.81±0.5310.21±1.131.81±0.0549.01±13.5340.31±5.539.22±1.328.91±3.3 |
4.40±0.53*6.11±0.93*9.31±0.93*1.61±0.08***46.71±11.0335.07±4.53**8.01±1.1**24.52±2.9*** |
4.79±0.436.81±0.9710.20±1.091.85±0.0749.32±15.7140.54±5.929.10±1.229.51±3.7 |
4.31±0.57*5.88±0.71**8.92±1.11**1.64±0.09***41.02±12.34*29.93±4.07***7.61±1.3**24.01±3.0*** |
红细胞刚性指数红细胞聚集指数血沉方程K值 |
4.61±0.314.51±0.7187.86±59.11 |
3.96±0.22***4.11±0.6564.87±45.43 |
4.61±0.534.61±0.6387.76±60.01 |
3.81±0.33***4.01±0.55**64.01±49.13 |
4.56±0.714.59±0.7389.61±38.55 |
3.32±0.31***3.86±0.63**58.16±36.37* |
治疗前后比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
结论注射1组、2组和本发明组合物均能改善血粘度,而且能有效改善肾脏病变,减少尿蛋白的数量,可以延缓肾病的发生发展过程,注射2组和本发明组合还具有控制血糖作用,但是本发明组合物的效果明显优于单独使用的相同剂量的注射1或2组。
另外,鉴于血管内皮生长因子(VEGF)可能成为防治糖尿病性肾病(DN)的特异靶点,阻断VEGF合成或生物学作用具有重要意义。还考察了本发明组合对II型糖尿病大鼠肾脏血管内皮生长因子的表达和调节作用。在本试验制备T2DM的大鼠模型中(血糖≥16.7mmol/L),具备胰岛素抵抗特征,出现了肾脏肥大,蛋白尿、肾脏VEGF及TGF-β1高表达。实验表明,本发明组合(芍药提取物+灯盏花提取物1∶1)可降低T2DM模型大鼠尿蛋白,减少肾肥大,减轻肾脏VEGF表达,其保护肾功能的机制可能与抑制VEGF有关,其效果明显优于单独使用灯盏花或芍药,高、低剂量两组,(60mg/kg、20mg/kg灌胃)疗效无明显差别。
同时,本发明还对糖尿病模型的大鼠的血糖、体重、肾重/体重与24小时尿白蛋白排泄率(AER)等进行了实验,以及观察各组大鼠肾小球病理形态学指标的变化,结果显示,注射1组、2组和本发明组合物均具有保护肾脏的作用,说明注射1组(野黄芩苷50mg)、2组(芍药苷50mg)都是能改善和治疗糖尿病的药物,但是以本发明组合物(野黄芩苷25mg、芍药苷25mg)的效果最好(明显优于单用组分)。
另外,进一步实验证明,本发明组合物可以纠正糖尿病微血管动力学异常,其效果优于单独使用的野黄芩苷、芍药苷。
2.对糖尿病大鼠视网膜保护作用
2.1材料与方法
实验动物选用雄性SD大鼠100只,适应性饲养7天,测空腹血糖均低于7mmol/L,随机分为正常对照组(E组)20只,实验组80只。用链尿佐菌素(STZ)诱发糖尿病。凡血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病组,再随机分为4组,各20只,D组为糖尿病未治疗组,每天生理盐水100mg/kg灌胃;A组为灯盏细辛提取物组(含野黄芩苷),50mg/kg灌胃;B组为赤芍提取物组(含芍药苷),30mg/kg灌胃;C组为本发明组合物组:芍药提取物(以芍药苷计)+灯盏细辛提取物(以野黄芩苷计)5∶1,60mg/kg灌胃。
2.2结果
试验表明,本发明组合物对于DM大鼠有促进体重增加、降低血糖的作用,见表2。
与正常组比较,各组糖尿病大鼠视网膜组织NOS的活性、AR(醛糖还原酶)的活性显著增强,NO含量显著增加。与D组比较,C组大鼠视网膜组织NOS的活性、AR的活性明显被抑制,NO的含量也显著减少,而A、B组的抑制作用不明显,见表3。
2.3讨论
①高血糖水平和糖化血红蛋白比例升高与视网膜病变发生、发展之间有密切的关系。上述实验表明,本发明组合物降低血糖的作用,能明显抑制AR和NOS的活性,减少NO的合成,对糖尿病视网膜病变有明显防治作用。
同时发现,本发明组合物能显著降低NO含量,这可能与本发明组合物能提高糖尿病大鼠视网膜组织SOD的活性有关,SOD活性增强,及时清除过量生成的NO,对自由基损伤起一定保护作用。
②在另一项试验中,考察了本发明组合物对糖尿病型小猪视网膜血管内皮生长因子表达的影响,研究表明本发明组合物有明显的降血糖和减轻胰岛素抵抗的作用。
③另外,国内外学者认为可通过抑制VEGF的表达来阻止和延迟增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的形成。申请人已进行的研究表明,与对照组(高脂高蔗糖饲料+灯盏细辛提取物或芍药提取物)相比,治疗组(高脂高蔗糖饲料+本发明组合物)的动物视网膜组织中的VEGF蛋白表达具有显著性差异(P<0.01)。
发明人希望借上述表述非限定性地解释本发明组合物效果明显优于单独使用灯盏细辛或芍药的机制。
表2各组大鼠体重和血糖比较(n=20)
组别 |
体重(g) |
血糖(mmol/L) |
4周 |
8周 |
12周 |
4周 |
8周 |
12周 |
EDABC |
278±12178±8*191±13*179±15*252±14*# |
302±12166±11*168±8*179±13*266±12*# |
310±11155±16*163±8*171±7*218±9*# |
3.9±1.121.1±2.1*20.7±1.8*21.5±1.1*12.2±1.6*# |
4.2±0.522.6±1.3*21.1±1.5*21.4±1.3*10.2±1.2*# |
4.3±0.822.6±1.9*22.3±1.7*21.4±1.9*9.2±2.8*# |
与E组比较,*P<0.01;与D组比较,#P<0.01
表3各组大鼠视网膜组织NO的含量、NOS的活性、AR的活性(n=20)
组别 |
NO含量(μmol/gprot) |
NOS活性(U/mg prot) |
AR活性(mU/mg prot) |
EDABC |
35.89±2.1167.88±5.4264.30±3.4659.55±3.9643.65±4.31 |
2.12±0.106.87±1.895.30±1.124.04±0.423.48±0.44 |
0.375±0.0951.111±0.2130.676±0.0510.727±0.0310.541±0.150 |
二.心脑血管方面的药理作用
1.对大鼠实验性血栓形成的影响
1.1对大鼠颈动-静脉血流旁路术血栓形成的影响
总重量-丝线重=血栓湿重/干重。
表4对大鼠颈动-静脉血流旁路术血栓形成的影响(X±S,n=10)
组别与剂量 |
血栓湿重(mg) |
血栓干重(mg) |
对照组华佗再造丸2g/kg组合物A高剂量0.035g/kg组合物A中剂量0.015g/kg组合物A低剂量0.005g/kg组合物B 0.1g/kg野黄芩苷组0.01g/kg芍药苷组0.01g/kg |
10.1±2.848.9±3.726.1±2.68***6.5±2.73***7.1±2.31**6.4±3.08***7.5±2.27**8.9±3.11 |
2.1±0.581.75±0.361.4±0.37***1.4±0.36***1.6±0.72**1.35±0.28***1.46±0.69***1.85±0.38 |
与对照组比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
结果与对照组比较,各给药组均可使血栓湿重减轻。与对照组比较,本发明组合物A中、高剂量组和组合物B组表现出显著性差异(P<0.01)。
1.2对大鼠体外血栓形成的影响
将体重200g左右的大白鼠随机分组,连续ig给药10天,末次给药40分钟,动物腹腔注射麻醉,按照药理学公知方法取下分别测定血栓湿重(用滤纸吸干后测定)及血栓干重(65℃烘20min)。
结果表明,在大鼠动脉-静脉血流旁路术血栓形成的实验中,与模型对照组比较,本发明组合物及对照组形成的血栓湿重均有减轻,本发明组合物P<0.05;在大鼠体外血栓形成过程中,本发明组合物各给药组均使血栓湿重较对照组比较有显著性差异(P<0.05),而单组分的野黄芩苷和芍药苷与对照组形成的血栓湿重相比虽有减轻,但没有显著性差异,其效果与阳性对照药相似。
1.3对小鼠体内血栓形成的影响
本发明组合物A0.005g/kg以上剂量连续口服给药5天,明显抑制小鼠体内血栓,提高小鼠15分钟内的偏瘫恢复数,表明该药对体内血栓形成具有明显对抗作用。
2.对正常大鼠血小板聚集性影响
取体重150-200g大白鼠随机分组,ig给药10日,末次给药后1hr,腹主动脉取血,柠檬酸钠抗凝,分离富血小板血浆(PRP)及贫血小板血浆(PPP),用SPA-4型血小板聚集以测定血小板3min最大聚集率(以1mM的ADP为诱导剂)。
表5.对正常大鼠血小板聚集性的影响(X±S,n=10)
组别与剂量 |
3分钟最大聚集率(%) |
正常对照组华佗再造丸2g/kg组合物A高剂量0.035g/kg组合物A中剂量0.015g/kg组合物A低剂量0.005g/kg组合物B 0.1g/kg野黄芩苷组0.01g/kg芍药苷组0.01g/kg |
72.1±19.257.5±30.441.3±25.76***43.1±15.61***49.3±17.18**47.8±19.07**48.7±20.74**59.1±21.54 |
与对照组比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
结果显示,给药各组对正常大鼠血小板聚集均显示出明显的抑制作用(P<0.05),阳性对照野黄芩苷组和芍药苷组也显示出明显抑制作用,但是组合物A给药大、中剂量组与对照组(野黄芩苷和芍药苷组)比较作用更明显。
同样,还对血瘀大鼠进行了血小板聚集性影响的实验,结果显示组合物A组大、中剂量组和组合物B组与对照组比较有显著性差异(P<0.01),并且显著延长动物的凝血时间,明显缩短尾静脉注射ADP-Na所致的小鼠肺栓塞呼吸喘促时间,其在抗血小板凝集方面作用优于或相当于阿司匹林,提示可以产生抗血栓作用,以及野黄芩苷和芍药苷伍用时抗血栓效果最佳,有协同抗血栓形成的作用。
3.对大鼠试验性脑缺血的保护作用
3.1对脑水含量的影响
将体重150-180g大鼠随机分组,试验前9天及术前1hr每天ig(口服)给药一次。结扎双侧颈动脉造成急性实验性不完全缺血模型。
表6对实验性脑缺血大鼠脑水含量的影响(X±S)(n=10)
组别与剂量 |
脑水含量(%) |
正常对照组脑缺血模型华佗再造丸2g/kg组合物A高剂量0.035g/kg组合物A中剂量0.015g/kg组合物A低剂量0.005g/kg组合物B 0.1g/kg野黄芩苷组0.01g/kg芍药苷组0.01g/kg |
74.2±2.8775.1±2.4573.9±3.0664.0±2.70***66.7±2.54***70.8±3.09**65.99±2.48***70.7±3.57**70.2±3.56** |
与对照组比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
由上表可知,本发明各组以及单组方的野黄芩苷和芍药苷组对不完全性脑缺血引起的脑水肿均显示出保护作用,但是与脑缺血模型组比较,组合物A组0.015g/kg以上剂量组和组合物B组使脑含水量减少更加显著(P<0.01),表明其对不完全性脑缺血引起的脑水肿有显著的保护作用。
4.对缺血性脑损伤的影响
4.1对大鼠脑梗塞组织重量的影响
取70只大鼠,雌雄各半,随机分为7组(假手术组、生理盐水组(NS)、本发明组合物3个剂量组、阳性药组(野黄芩苷组、芍药苷组)),每组10只。按照已知药理学方法做成大鼠大脑中动脉结扎(MCAO)模型。结果见下表。
表7对MCAO所致大鼠脑梗塞组织重量的影响(n=10)
组别与剂量 |
梗塞脑组织重量百分比 |
抑制率% |
对照组NS本发明组合物A高剂量0.01g/kg本发明组合物A中剂量0.005g/kg本发明组合物A低剂量0.002g/kg本发明组合物B 0.05g/kg野黄芩苷组0.005g/kg芍药苷组0.005g/kg |
4.0±5.130.7±6.321.3±3.2***22.4±4.4***26.1±5.624.0±5.4**24.6±6.4**25.0±7.3* |
----27.3%23.8%14.9%21.8%20.0%17.2% |
与NS比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
结果表明,大鼠MCAO后明显有脑梗塞发生,本发明组合物A的0.01、0.005g/kg(iv)以及组合物B组均可明显降低脑梗塞组织重量百分比(P<0.01,P<0.05),而同样0.005g/kg的野黄芩苷组(灯盏花素注射液)组也有较明显的降低效果(P<0.05),但是与组合物A大、中剂量和B相比,阳性对照组效果明显不如本发明组合。
同样,在采用与上表相同的药物及其剂量,对MCAO所致大鼠缺血损伤行为学指标的影响的实验中,结果显示了并可以得出与上述相类似的结论,即组合物、野黄芩苷和芍药苷组均显示了相关的作用,但以本发明组合大、中剂量A组和组合物B组的效果最好,明显优于单纯的野黄芩苷和芍药苷组。
另外,试验证明本发明组合物A的0.002、0.005、0.01g/kg(iv)剂量和组合物B组给药,能明显延长小鼠脑循环障碍存活时间,高、中剂量组和组合物B分别较对照组延长了约2-3倍,表明该药可增加小鼠脑循环障碍的血流,从而提高了对脑缺血缺氧动物耐受作用。
5.对麻醉犬急性心肌缺血的影响
取35只杂种犬,体重在10.0-14.0公斤,每组5只,雌雄兼用,随机分为7组:第1组为0.9%NaCl对照组;第2-4组为野黄芩苷和芍药苷的组合物组(剂量分别为0.002、0.005、0.01g/kg);第5组为血塞通14mg/kg经十二指肠给药组;第6组为野黄芩苷(灯盏花素注射液)静脉给药组,0.015g/kg;第7组为芍药苷静脉给药组,0.015g/kg。各给药组在给药前用0.9%NaCl配制所需浓度药液。
结果表明,本发明药物组合静脉给药后,对冠状动脉结扎犬心肌缺血有明显的改善作用,表现为:①各给药组给药后,心外膜电图ST段位移总和(ZST),及ST移位超过1mV导联数(N-ST)的变化率,明显低于对照组,有非常显著或显著的差异;②各给药组,于结扎冠状动脉后,给药的不同时间点的血清肌酸激酶(CK)的变化率,与对照组比较明显下降,低于对照组,有非常显著或显著差异;与对照组比较,乳酸脱氢酶(LDH)的变化率,也有非常明显的下降趋势,比对照组有非常显著或显著差异;③心肌梗死范围的定量组织学测定结果表明:各给药组梗死心肌重量/心室重量百分比、梗死心肌重量/全心重量百分比,均明显低于对照组,其间有非常显著或显著的差异。
6.对小鼠尾出血时的影响
取小鼠70只,体重19-23g,雌雄各半,实验前禁食6小时,随机分为7组:第1组为对照组:第2-4组为野黄芩苷和芍药苷的组合物静脉给药高、中、低三个剂量组,剂量分别为0.002、0.005、0.01g/kg;第5组为血塞通70mg/kg给药组;第6组为野黄芩苷(灯盏花素注射液)静脉给药组,0.015g/kg;第7组为芍药苷静脉给药组,0.015g/kg。对照组静脉注射0.9%氯化钠溶液,给药容积为20ml/kg体重,其余各组按相等容积静脉注射给相应药物。
该实验结果表明,静脉注射本发明组合后,与对照组比较,对小鼠体外凝血时间均有显著或非常显著的延长作用,而且其作用强于单方组。
结论上述实验1-6显示,当本发明组方中缺少芍药苷或者野黄芩苷时,其药效均达不到本发明组合物所能达到的药效。尤其值得注意的是,在多数试验中,本发明小剂量组(例如0.005、0.002g/kg),其作用就已明显强于剂量相对更高的(例如0.01g/kg)野黄芩苷组或芍药苷组,这对于减少给药剂量、降低不良反应是极为有利的(实验一、三结果也类似,不一一赘述)。因此,上述研究证实,加入芍药苷后,对于单方野黄芩苷在提高小鼠对脑缺血缺氧的耐受作用、对不完全性脑缺血引起脑水肿的保护作用等方面均有显著改善和协同效果。
7防止血管成形术后再狭窄
血管成形术后再狭窄(RS),其发病率高达30-50%。由于血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖,是RS的病理特征,因此抑制VSMCs异常增殖成为世界性心血管研究预防RS的重要手段。
7.1材料
本发明药物组合(芍药苷+野黄芩苷+总咖啡酸酯4∶1∶4,以20、40、60mg/kg注射);
空白对照组:生理盐水;
阳性对照药:相当于同样用药量的单组分芍药苷注射,8mg/kg;灯盏花注射,8mg/kg;三七皂苷注射液;
7.2方法
血管平滑肌细胞分离、培养、鉴定,参照文献(Piper HM编辑,Cell CultureTechinques in Heart and Vessel Research.Springer-Verlag:Germany.1990:280)操作。
待90%VSMCs汇合后,经胰蛋白酶消化后种于培养碟内,加10%FBS+SMWM过夜培养,使细胞贴壁,细胞汇合约80%,再换成无血清DMEM(含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)继续培养24h,使细胞生长同步,最后换成10%FBS+DMEM,并随机加入药物,各浓度用DMEM稀释至10μl/孔。
3H-TdR掺入实验:置换每孔1ml的DMEM,加入1uCi的3H-TdR,用液体闪烁计数器(1900CA)测定各孔的CPM值。
细胞存活率=贴壁细胞/总细胞数(贴壁细胞+不贴壁细胞)
7.3结果
结果见下二表。
对平滑肌细胞
3H-TdR掺入量的影响(
X±s)
|
培养24小时 |
培养48小时 |
3H-TdR掺入 |
抑制率% |
3H-TdR掺入 |
抑制率% |
对照组芍药苷灯盏注射液三七皂苷本发明组合物(大)本发明组合物(中)本发明组合物(小) |
9027±4518477±508*6791±529**5349±479**3836±227**△△##4071±416**△△##7051±491**△ |
-6.0924.7840.7457.5154.9021.89 |
18790±181614214±1257**10207±1167**11588±2437**△3511±291**△△##4243±317**△△##14068±1817** |
-24.3545.6838.3381.3177.4225.13 |
与空白对照比较,*p<0.05 **p<0.01;与芍药比较,△P<0.05,△△P<0.01;与灯盏比较,#P<0.05。
对平滑肌细胞计数的影响(
X±s)
|
培养24小时细胞数量1×104 |
培养48小时细胞数量1×104 |
贴壁细胞 |
贴壁细胞 |
对照组芍药苷灯盏注射液三七皂苷本发明组合物(大)本发明组合物(中)本发明组合物(小) |
40.27±2.1139.41±2.2338.11±2.17*37.81±2.32*△27.51±1.40**△△##33.47±1.38**△△##38.29±1.93** |
76.11±3.0360.11±3.32**58.97±2.99**58.51±3.12**34.61±3.01**△△##43.72±3.01**△△##48.15±2.99**△△## |
与空白对照比较,*p<0.05 **p<0.01;与芍药比较,△P<0.05,△△P<0.01;与灯盏比较,#P<0.05,##P<0.01
本实验用细胞计数法分析,各组药物对细胞增殖的影响与对平滑肌细胞3H-TdR掺入基本一致,并且测得细胞存活率没有明显影响,均在90%以上。
7.4结论
本发明药物组合物、芍药苷、灯盏注射液对血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖具有抑制作用,其中本发明药物组合物最强,灯盏、三七皂苷和芍药苷分别次之,本发明药物组合与芍药苷和灯盏比较,组间具有显著性差异。
8脑细胞保护作用
8.1材料和方法
实验动物:健康Wistar大鼠72只,体重260±15g;
药物:本发明组合物(芍药苷+总咖啡酸酯5∶1,24mg/kg);
阳性对照药:芍药苷注射,20mg/kg;
灯盏细辛(野黄芩苷+总咖啡酸酯1∶5)注射,24mg/kg;
依达拉奉注射液注射,10mg/kg;
实验方法:大鼠随机分为6组,每组12只。正常对照组:由左颈外静脉插管,静注1%肝素,分别于即刻及1.5h经左颈外静脉插管给0.9%氯化钠液3ml/kg,3h后取脑检测或固定。模型组:参照Kaizumis栓线法建立脑缺血再灌注动物模型。实验动物模型均缺血1.5h取脑检测或固定,然后取出栓线再灌注1.5h,取脑检测或固定。标本:将大鼠断头取脑,剥离脑组织,取视交叉和脚间窝两个冠状切面间分别取脑皮质和尾壳核光、电镜标本。
脑水肿及脑钙含量的测定:取右前脑50~100mg,烘干至恒重,即为干重。
脑含水量测定:用公式:(湿重-干重)/湿重,计算脑含水量。
8.2结果
(1)大鼠脑组织梗塞区观察:
光镜下:模型组神经元轮廓模糊,胞体着色变深,胞核小、胞质分界不清。细胞周围亮区变宽与正常对照组有显著差异(P<0.01)。本发明组合物组及依达拉奉组神经元结构尚清晰,胞核与胞质界限尚能分清,细胞周围亮区较宽,与模型组相比虽有缩小,但无显著性差异。芍药苷组和灯盏细辛组神经元结构欠清晰,胞核与胞质界限能分清,细胞周围亮区较宽,与模型组相比未见明显缩小。
电镜下:模型组神经元变形,明暗神经元不易区分,胞核变形,表面呈锯齿状,核内异染色质增多、核膜及核周隙模糊不清、核质分界不清、网状结构消失、细胞器减少或变形、结构不清。线粒体呈气球样肿胀、质膜结构不清或消失断裂、细胞周围有大量水肿液呈低电子密度亮区。本发明组合物组及依达拉奉组神经元核周核膜清晰、核内异染色质稍增多、核周间隙较狭窄、胞质内细胞器较明显、但线粒体均有水肿样改变、细胞周围有少量水肿液。芍药苷组和灯盏细辛组神经元核周核膜欠清晰、核内异染色质稍明显增多、核周间隙较狭窄、胞质内细胞器不明显、线粒体有水肿样改变。模型组星形胶质细胞水肿、胞质电子密度降低、细胞器减少、局部细胞膜结构不清。本发明组合物组及依达拉奉组星形胶质细胞的水肿表现较模型组轻,细胞器与模型组相比明显较多。芍药苷组和灯盏细辛组星形胶质细胞则与模型组基本相似。
(2)脑组织钙、丙二醛、超氧化物歧化酶、脑水分含量的实验结果:模型组脑组织丙二醛含量、钙含量、脑水分均较正常对照组明显升高(P<0.01),而SOD活性则明显低于正常对照组(P<0.01);本发明组合物能抑制灌注后脑组织丙二醛含量的升高和升高SOD活性(P<0.01),改善脑水含量(P<0.01),效果与依达拉奉相当,明显优于灯盏细辛和芍药苷组。
8.3结论
本发明组合物能显著抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA含量的升高和提高SOD活性,改善脑水含量,并从超微结构上证实对膜性结构尚有一定保护作用。本发明组合物主要通过提高SOD活性,清除氧自由基,从而对脑细胞起保护作用,其作用与依达拉奉相当,明显优于芍药苷和灯盏细辛组。
三.老年痴呆方面的药理作用
对缺血再灌注制备的VD模型的作用
大鼠分为假手术组、模型组、当归芍药散组(口服)、野黄芩苷组、芍药苷组和本发明组合物组(注射用药的A组,和口服给药的B组),在制备模型前连续给药,然后用反复缺血再灌注制备VD大鼠模型,测定海马组织中MDA的含量。
表8.对再灌注制备的VD大鼠海马组织中MDA含量的影响比较(n=10)
组别与剂量 |
MDA(n mol/mg) |
假手术组模型组本发明组合A高剂量0.01g/kg本发明组合A中剂量0.005g/kg本发明组合A低剂量0.002g/kg本发明组合B 0.2g/kg野黄芩苷组0.01g/kg芍药苷组0.01g/kg当归芍药散组3.8g/kg |
6.521±2.516.071±0.4833.886±0.562***4.197±0.672**5.186±0.6024.197±0.589**6.021±0.4134.875±0.637*4.271±0.413** |
与假手术组比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01
上表显示,本发明组合物和当归芍药苷组均可降低大鼠海马MDA含量,有抗氧化作用,但以本发明组合物(中、高剂量的A组和B组)的作用最显著,芍药苷组也降低了MDA含量,而单组分的野黄芩苷组则较弱。
同时本发明对上述实验的大鼠死亡率、改善记忆障碍、抗D-半乳糖致脑老化、预防/治疗VD、被动回避实验中对诱发小鼠记忆巩固/再现障碍的作用等指标,以及对小鼠学习记忆能力的影响也作以详细测试,实验证明,本发明组合物的效果均好于单独使用野黄芩苷或芍药苷,表明本发明组合物(A组和B组)产生了效果协同作用,在防治VD方面好于单纯组分以及成方当归芍药散。
四.抗氧化方面的药理作用
1.对高血脂症大鼠的抗氧化作用
1.1材料
本发明药物组合物:芍药+灯盏花1∶5(含芍药苷、野黄芩苷、二咖啡酰奎宁酸),50mg/kg灌胃;
正常对照组:生理盐水;
高血脂组:生理盐水;
阳性对照药:灯盏花提取物(50mg/kg);芍药提取物(50mg/kg);VE(50mg/kg);丹芍颗粒(50mg/kg,含水牛角、生地、丹参、赤勺等9味药);
1.2实验方法
高血脂模型的建立:Wistar大鼠给予高脂饲料;正常对照组喂食普通饲料。与正常组比较,高脂模型血清和肝脏的LPO明显升高,而SOD活性明显降低。
药物灌胃,处理动物,测过LPO和SOD,按照试剂盒说明书操作,取1/2肝脏待测LPO和SOD,结果见下表:
表9.对高血脂大鼠血清和肝脏LPO和SOD的影响(nmol/L)
组别 |
血清LPO |
血清SOD |
肝脏LPO |
肝脏SOD |
高血脂组VE组灯盏花提取物芍药提取物丹芍颗粒本发明组合物 |
8.99±2.006.54±1.23**8.17±1.207.89±1.176.96±1.07*△6.29±1.08**△△## |
400.9±56.7440.1±28.9447.1±31.7*451.6±40.1*451.8±35.6*457.1±29.0* |
6.91±1.185.61±1.13*6.00±1.475.89±1.375.87±1.595.23±1.31** |
7.59±1.198.87±1.27*8.78±1.39*8.73±1.18*9.01±1.28*9.27±1.18** |
与高血脂组比较*p<0.05 **p<0.01;与芍药比较,△P<0.05,△△P<0.01;
与灯盏比较,#P<0.05,##P<0.01
1.3结论
上述实验表明,单独施用的灯盏和芍药提取物(50mg/kg)表现出一定的抗氧化活性,低剂量则不明显。本发明组合物具有显著的抗氧化活性,效果优于单独施用的芍药、灯盏和其他对照药(P<0.01),可能是因为本发明组合物中不仅仅含有芍药苷、野黄芩苷,其灯盏提取物中还含有咖啡酰化合物。试验证明,咖啡酰化合物可抑制乳酸脱氢酶的释放,具有显著的抗氧化和抗活性氧的作用,具有一定的抗脂质过氧化作用,因此本发明组合对高血脂症的抗氧化作用明显优于优于单独施用的芍药苷、灯盏提取物(以野黄芩苷为主)和其他对照药(P<0.01)。
本发明组合物的伍用则没有发现毒副作用,因此为了确保活血、抗氧化、抗炎等作用,采用芍药和灯盏花伍用,既起到协同作用增加了疗效,又克服了芍药可能带来的不良副作用。
另外,还从保护神经细胞、减少脑组织丙二醛(MDA)和NO生成等方面,考察了本发明组合物的抗氧化作用,结果证明本发明组合物对脑组织MDA有明显的抑制作用,降低了脑组织中升高的NO,对神经细胞也显示了保护作用,其中的灯盏花提取物-芍药提取物(10∶1)两者存在明显的协同作用,其原因和机理有待进一步探讨。五.抗动脉粥样硬化的药理作用
1.对兔实验性动脉粥样硬化(AS)血管重构的影响
1.1材料
本发明药物组合物:芍药苷+野黄芩苷1∶1,50mg/kg灌胃;
正常对照组:生理盐水;
模型组:生理盐水;
阳性对照药:灯盏花提取物(50mg/kg)、芍药提取物(50mg/kg)、普罗布考(25mg/kg)。
1.2实验方法
将纯种雄性新西兰兔,随机分组,饲养1周后,采用球囊损伤内皮继喂食高脂饲料的方法复制家兔实验性AS模型。观察12周。
1.3测定项目及结果
组织病理学:光学显微镜下,正常对照组内皮细胞完整未见异常改变;模型组动脉内皮细胞缺损,内膜增生,6周时内膜增生严重,管腔明显狭窄而且大小不规则,细胞胞质嗜酸性不明显,出现大量大小不规则的泡沫细胞,有的可见脂肪坏死中心,内膜下层可见大量梭形增生细胞;各给药组内皮缺损面减少,增厚明显减轻,泡沫细胞减少,尤其以本发明组合物组为最优。
组织形态学:最大内膜厚度(MIT)、最小管腔直径(MLD)、管腔面积(LA)、内弹力膜围绕面积(IELa)、外弹力膜围绕面积(EELa),并得出内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、管腔狭窄百分比(LS),其中,IA=IELa-LA;MA=EELa-IELa;LS=IA/IELa。见下表:
项目 |
正常对照 |
模型组 |
普罗布考 |
芍药 |
灯盏 |
组合物 |
MIT(mm)IA(mm2)MLD(mm)LA(mm2)IELa(mm2)EELa(mm2)MA(mm2)LS(%) |
001.32±0.162.08±0.292.08±0.312.58±0.410.50±0.070 |
0.37±0.131.30±0.661.09±0.201.69±0.502.99±0.894.26±1.991.27±1.1043.33±12.8 |
0.11±0.10**0.45±0.27**1.55±0.31**3.14±1.22**3.59±1.215.00±1.721.41±0.9812.5±7.31** |
0.18±0.07**0.33±0.30**1.55±0.32**3.05±1.10**3.38±1.124.45±1.311.07±0.339.86±7.63** |
0.23±0.11*1.09±0.541.50±0.51**3.11±0.92**4.20±1.16*5.39±1.021.19±0.3325.95±11.1** |
0.08±0.06**△##0.30±0.21**##1.51±0.39**3.09±0.77**3.39±1.134.13±1.050.74±0.4**△##8.85±7.17**## |
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01;与芍药比较,△P<0.05,△△P<0.01;
与灯盏花比较,#P<0.05,##P<0.01。
内膜厚度已经被证实可以作为早期动脉硬化的有用指征。由上表可知,在减小MIT、IA和LS、增加LA方面,各给药组表现出不同程度作用。在抑制内膜增殖方面,以本发明组合物和普罗布考组作用尤为明显,显著优于芍药组(P<0.05)。
1.4讨论
已知芍药和灯盏对AS都有一定治疗作用,但其抗AS的侧重点不同,灯盏的有效成分主要表现为对胆固醇合成和丙二醛生成有抑制作用,这些可以通过灯盏花提取物对血脂和AS斑块形成的作用研究结果得以证实。以芍药苷为主要活性成分的芍药提取物有利于防止血小板粘附、聚集,并能显著降低血清总胆固醇低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平,并使高密度脂蛋白胆固醇升高,改善脂蛋白组分比值,所以也有较明显的抗AS作用。芍药与灯盏的合用,其主要活性成分是苷类和黄酮类的合并应用,配伍相对稳定,不会产生化学反应而失效或减损药效,相反,由于治疗机理的侧重方向不同,可产生更显著的协同作用,优于芍药与其它活性成分(例如川芎)合用的效果。
六.抗炎性方面的药理作用
1.对二甲苯致小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
1.1材料
本发明药物组合物:芍药苷+野黄芩苷8∶1,30mg/kg、50mg/kg灌胃;
正常对照组:生理盐水;
阳性对照药:灯盏花提取物(50mg/kg);芍药提取物(50mg/kg);双黄连提取物(50mg/kg);
1.2实验方法
参照陈奇主编的《中药药理研究方法学》制作动物炎症模型,结果见下表:
组别 |
OD值 |
正常对照组双黄连芍药提取物灯盏花提取物本发明组合物(低)本发明组合物(高) |
0.067±0.0220.031±0.023**0.039±0.018**0.032±0.014**0.030±0.021**0.022±0.010**□# |
与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与芍药提取物比较,△P<0.05,△△P<0.01;
与灯盏花提取物比较,#P<0.05,##P<0.01
1.3结果
无论是芍药、灯盏提取物,还是公认的解热抗炎药物双黄连,以及本发明组合物,都可以减轻二甲苯致小鼠皮肤毛细血管通透性,具有抑制炎症早期毛细血管通透性增高的作用,与对照组相比具有显著性差异,与同等剂量的单组分提取物组相比,本发明高剂量组合物组也具有统计学差异(P<0.05)。
而且,申请人进一步发现:本发明组合既可抑制早期炎症由于毛细血管扩张通透性亢进造成的肿胀、渗出增加,又可抑制炎症中期白细胞游走,即对炎症的早期、中期和晚期均呈现明显的抑制作用和效果,推测其机制可能是灯盏花素可抑制体内炎性介质PGE2的合成,而芍药苷则侧重于抑制炎症晚期的肉芽组织增生。因此,本发明突破性地发现,芍药和灯盏花在均具有抗炎作用的前提下,二药合用,效果明显增强,显示出显著的协同作用。
七.其它面的药理作用
1.治疗大鼠脂肪肝的疗效观察
1.1材料与方法
本发明组合(芍药苷+野黄芩苷2∶1,60mg/kg、20mg/kg);野黄芩苷(40mg/kg);芍药苷(20mg/kg)。
雄性SD大鼠50只,体重150g±10g。正常喂养1周后,随机分为2组:实验组(40只),饲以高脂高胆固醇饲料(10.0%猪油、2.0%胆固醇、0.5%胆酸钠、87.5%基础饲料);和正常对照组(10只),给予基础饲料,两组大鼠均自由进水。
12周后,从实验组随机抽取8只,正常对照组随机抽取2只,处死动物取肝脏做病理切片,验证脂肪肝造模成功。将余下实验组大鼠按体重层次再随机分为组合物高剂量治疗组、组合物低剂量治疗组、野黄芩苷治疗组及芍药苷治疗组。正常对照组以同等容积蒸馏水灌胃,各组均予基础饲料饲养,给药4周后取血及肝组织,检测各项指标。
1.2观察指标
(1)实验结束处死动物时,称体重及肝重;
(2)生物化学指标:测定空腹血糖(FBG)总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的含量、空腹血清胰岛素(FINS);
(3)胰岛素抵抗指数:胰岛素抵抗指数HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5;和
(4)组织病理学检查:分光光度法测定TG的含量。
1.3结果
实验进行中各组均无动物死亡。
实验结束时,野黄芩苷、芍药苷治疗组动物的体重、肝指数(肝湿重/体重×100%)比正常对照组显著增高(P<0.05;P<0.01);与野黄芩苷、芍药苷治疗组比较,高、低剂量组合物治疗组的体重、肝指数显著降低(P<0.01);与正常对照组相比,高、低剂量组合物治疗组体重、肝指数差异无统计学意义,见下表10。
血清和肝组织匀浆脂质的变化:野黄芩苷、芍药苷治疗组血清TG、TC及肝组织TG较正常对照组升高;与野黄芩苷、芍药苷治疗组比较,高、低剂量组合物治疗组中上述指标均明显改善,见下表11。
FBG和FINS等变化:野黄芩苷治疗组FBG和FINS及HOMA-IR呈增高趋势;芍药苷治疗组FBG和FINS及HOMA-IR呈下降趋势;与野黄芩苷组比较,高、低剂量组合物组的FINS及HOMA-IR显著下降,其余比较差异均无统计学意义,见下表12。
病理学改变:(1)肉眼观察:野黄芩苷、芍药治疗组大鼠肝外观呈奶油黄,体积明显增大,边缘变钝,质地变软,切面略带油腻感;高、低剂量组合物治疗组肝外观接近正常对照组;和(2)光镜观察:野黄芩苷、芍药苷治疗组肝小叶中心带肝细胞中出现大小不等的脂肪滴,部分肝细胞核则被脂肪滴挤压而明显偏位,小叶内及汇管区局灶性炎性细胞浸润,伴有一定程度的点片状坏死;高、低剂量组合物治疗组肝小叶和肝血窦结构清晰,细胞内见少许小泡性脂肪滴,偶见肝细胞坏死。
1.4结论
上述实验提示,本发明组合用于大鼠脂肪肝模型干预可以显著改善脂肪肝病变程度,改善脂肪代谢,优于单独应用野黄芩苷或芍药干预,具有显著性差异。
由于非酒精性脂肪肝的发生与胰岛素抵抗密切相关,且患者常合并肥胖、高血糖、高胰岛素血症。我们认为本发明组合物是通过降低患者胰岛素抵抗,改善脂代谢,抗细胞炎性等方面产生改善脂肪肝病变的作用,且这种作用在单独使用野黄芩苷时未呈现,其协同作用机制值得进一步探讨。
表10大鼠体重、肝指数的变化(
X±S,n=8)
分组 |
体重(g) |
肝指数 |
正常对照组野黄芩苷治疗组芍药治疗组组合物高剂量治疗组组合物低剂量治疗组 |
382.5±48.21453.0±57.46*441.6±36.53*371.5±29.86△▲381.3±30.76△▲ |
2.51±0.323.33±0.13#3.12±0.29#2.23±0.11△▲2.41±0.12△▲ |
与正常对照组比较:*P<0.05;#P<0.01;
与正常对照组比较:□P>0.05;与野黄芩苷、芍药治疗组比较:▲P<0.01
表11大鼠血清及肝匀浆脂质的变化(
X±S)
分组 |
TG(mmol/L) |
TC(mmol/L) |
HDL-C(mmol/L) |
肝组织TG(mg/g) |
正常对照野黄芩苷芍药组合物(高)组合物(低) |
0.75±0.311.21±0.46*1.18±0.67*0.84±0.28△▲0.87±0.32△▲ |
1.36±0.312.22±0.38#2.22±0.31#1.52±0.25△▲1.62±0.26△▲ |
0.89±0.210.44±0.18#0.47±0.11#0.79±0.10△▲0.86±0.12△▲ |
16.43±6.7826.44±6.62#25.89±6.87#18.17±6.15△▲18.42±6.34△▲ |
与正常对照组比较:*p<0.05;#p<0.01;
与模型对照组比较:□P>0.05;与野黄芩苷、芍药治疗组比较:▲p<0.05
表12大鼠空腹血糖、血清胰岛素及胰岛素抵抗指数水平的变化(
X±S)
分组 |
空腹血糖(mmol/L) |
血清胰岛素(mu/L) |
胰岛素抵抗指数 |
正常对照野黄芩苷治疗芍药治疗组合物(高)组合物(低) |
5.66±0.726.20±1.415.51±0.345.11±0.45*5.32±0.52* |
27.30±3.6929.82±6.3825.89±8.5725.78±4.67*26.01±5.11* |
6.76±2.028.21±2.675.21±2.18*5.21±0.65*5.51±0.74* |
与野黄芩苷治疗组比较:*p<0.05
2.治疗兔视网膜静脉阻塞的实验研究
2.1材料和方法
纯种雄性新西兰白兔48只,造成视网膜静脉阻塞模型。
分为6组,每组8只,即:空白对照组、本发明组合物治疗组(芍药苷+野黄芩苷1∶10,分高、中、低三个剂量组)、野黄芩苷治疗组、芍药苷治疗组,造模后第3天开始连续给药10天,空白对照组给予等容量饮用水。
2.2结果
眼底情况:造模第2天可见眼底出血,第6天本发明组合物高剂量组眼底出血明显开始吸收,而空白对照组眼底出血20天后才明显开始吸收,差别有显著性差异。野黄芩苷治疗组和芍药苷治疗组分别与第11、18天开始眼底出血明显开始吸收,这与空白对照组相比无显著性差异。血液完全吸收后,空白对照组与芍药苷治疗组的眼底血管细而迂曲,而本发明组合物3个剂量组的眼底血管均接近正常情况,野黄芩苷治疗组的眼底血管改变介于空白对照组和本发明组合物低剂量组之间。结果见表13。
眼底照相及荧光素眼底血管造影检查:本发明组合物3个剂量组、野黄芩苷治疗组眼底血管形态接近正常,未见荧光素渗漏,亦未见新生血管,而空白对照组、芍药苷组虽然眼底出血已经吸收,但仍可见荧光素渗漏,并可见新生血管。眼底照相见6个组出血均已完全吸收,但血管形态不同,情况与直接检眼镜的检查一致。
2.3结论
实验表明,本发明组合物对兔实验性视网膜中央静脉阻塞有非常显著的治疗作用。尤其值得注意的是,单独施用的野黄芩苷或芍药均无法达到本发明组合物的治疗效果。我们认为,这与组合物中野黄芩苷和芍药苷在下述作用机制中产生明显协同作用有关:扩张血管,减少血管阻力;改善微循环,提高耐缺氧能力;抑制纤维蛋白合成,抗凝血和组织增生;抑制过敏介质的释放,抗过敏反应。
表13对兔眼底出血完全吸收时间的影响(x±s,n=8)
组别 |
剂量/(mg·kg-1) |
吸收时间/d |
空白对照组野黄芩苷治疗组芍药苷治疗组本发明组合物(高剂量) |
--202030 |
35.94±4.1329.79±4.6333.84±5.2419.25±4.74** |
本发明组合物(中剂量)本发明组合物(低剂量) |
2010 |
21.93±4.27**23.89±5.13* |
与生理盐水组比较,*P<0.05 **P<0.01
毒理学
1.小鼠急性毒性
小鼠一次性口服本发明组合物30g/kg后,连续观察7日,未见动物毒性反应及死亡发生。故本发明组合物最大给药量为30g/kg,约为临床成人拟日用量的200倍,(临床成人拟日用量为0.15g生药/kg)。本发明组合物小鼠LD50>30g/kg。
本发明组合物静脉注射小鼠的最大耐受量为1.5g/kg,腹腔注射的LD50为3g/kg。
2.大鼠长期毒性
本发明组合物0.005、0.015、0.035g/kg三个剂量连续口服给药12周、26周和停药4周,各给药组雌雄大鼠一般体征与对照组无明显差异;尿常规检查中,各项指标与对照组无显著差别;在血液学测定中,仅见给药0.015周时高、中、低剂量组雌鼠凝血时间明显延长,停药4周各组无显著差异,此作用提示该药具有一定的抗凝作用,而并非毒性反应。其它各项生化指标均均在正常范围内;脏器系数检查中,本发明组合物在给药26周时,给药组各脏器系数与对照组相比均无显著差异;病理形态学观察,大鼠主要脏器均未见与受试药物毒性相关的病理改变。
临床观察
1.糖尿病性冠心病(无症状性心肌缺血)的临床试验
符合WHO冠心病以及WHO糖尿病(II型)诊断标准的患者80例,平均年龄60岁,随机分为灯盏细辛注射液组(含有野黄芩苷20mg)、硝酸甘油组(5mg)、芍药苷注射液组(含芍药苷50mg)、本发明组合组(含野黄芩苷和芍药苷各25mg),每组20例,每日一次静脉注射,14天为一疗程,治疗前后各记录一次24h动态心电图和血糖。
评判标准:ST段压低恢复正常、血糖控制在正常范围内为显效;ST段回升0.05mV以上、血糖控制在大致正常范围内为有效;未达到正常标准为无效。
结果云南灯盏细辛注射液组有效率42例,无效38例,有效率52.5%;硝酸甘油组有效15例,无效65例,有效率18.75%;芍药苷注射液组有效16例,无效64例,有效率20%;本发明组合物组显效36例,有效31例,无效13例,有效率83.75%。可以验证,本发明组合物对糖尿病合并冠心病的相关病征有着极好的治疗效果,与云南灯盏细辛注射液组和芍药苷注射液组有显著差异。
2.心脑血管方面的临床试验
采用随机双盲对照的方法考察其疗效和不良反应,共观察冠心病病人170例,其中治疗组100例,疗效愈显率39.87%,总有效率88.33%;对照组70例,愈显率26.46%,总有效率74.93%,两组冠心病疗效经统计学处理,P<0.05,有统计学差异,治疗组优于对照组。治疗组未见明显的不良反应。
3.治疗高脂血症的临床观察
3.1材料和方法
病例入选条件:(1)空腹血浆TC≥5.Smmol/L、TG≥1.8mmol/L;(2)无肝、肾、甲状腺功能异常;(3)无糖尿病病史,可伴有高血压病。
血脂水平达到入选标准的初治病人共99例,其中:高胆固醇血症63例(男21例,女42例,57.9±11.4岁),高甘油三酯血症84例(男36例,女48例,56.1±9.5岁),病人再随机平均分为三组。同期血脂康治疗为对照组共37例(男21例,女16例,龄52±9岁),四组病例年龄及性别经统计学处理无显著差别。
药品:(1)阳性对照药:血脂康胶囊(口服,1.2g/日);(2)本发明组合(含芍药苷+灯盏花素1∶2,口服,100mg/日);(3)灯盏花素片(口服,120mg/日);(4)芍药提取物(口服,相当于芍药苷40mg/日)。
3.2观察指标及结果
血清TC,TG和GDL-C以酶学方法测定。血清LDL-C由Friedwald公式:LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2计算获得,结果见表14。
结果表明,服药8周后,本发明组合和血脂康组患者的血清TC、TG水平均较服药前显著降低,灯盏花素及芍药组则治疗前后指标均无显著性差异。这表明,经本发明组合治疗后,高脂血症血清TC、TG均能降低,效果与每日服1.2g血脂康胶囊相同,且明显优于单独应用灯盏花素及芍药的治疗方案。
表14临床观察结果x±s(n),mmol/L
组别 |
TC |
TG |
LDL-C |
HDL-C |
服药前 |
本发明组合 |
7.12±1.23(21) |
2.97±1.43(28) |
3.64±1.16(33) |
1.32±0.50(33) |
灯盏花素芍药血脂康 |
6.94±1.24(21)7.13±1.32(21)6.63±1.12(37) |
2.69±1.33(28)2.48±0.93(28)1.69±0.54(37) |
3.23±1.12(33)3.73±1.08(33)3.98±0.64(37) |
1.38±0.48(33)1.36±0.55(33)1.42±0.21(37) |
服药8周后 |
本发明组合灯盏花素芍药血脂康 |
5.71±0.65(21)*6.62±1.12(21)6.71±1.23(21)5.19±0.45(37)* |
2.28±1.37(28)*2.56±1.21(28)2.31±0.86(28)1.35±0.19(37)* |
3.17±0.82(33)3.01±1.03(33)3.55±1.01(33)2.59±0.34(37)* |
1.35±0.35(33)1.36±0.43(33)1.34±0.45(33)1.44±0.18(37) |
给药前后差异(%) |
本发明组合灯盏花素芍药血脂康 |
-19.8-4.6-5.9-21.7 |
-23.2-4.8-6.8-20.1 |
-12.9-6.8-4.8-34.9 |
+2.3-0.02-1.8+1.4 |
*p<0.01与服药前同组比较
4.缺血性脑卒中二级预防的临床观察
4.1对象
入选标准:年龄<75岁;缺血性脑卒中;首发或二次复发病例;急性期3月后;有CT/MRI诊断,并与临床表现相符合。
排除标准:各种出血性卒中;三次及以上脑卒中发作;影像学检查为缺血性脑卒中,而无临床症状或体征的病人;无CT/MRI确诊的脑卒中患者:缺血性脑卒中急性期3个月内;瘤卒中;血液病;严重肝肾功能损伤;静息卒中。
4.2方法与结果
本发明组合:灯盏花提取物(以野黄芩苷计),口服120mg/天,和芍药提取物(以芍药苷计)口服20mg/天,420例;
药物对照:阿司匹林,口服75mg/天,480例;
空白对照:不提供阿司匹林或本发明组合,470例。
于实验开始的第30、60、90、180天,观察是否有卒中复发、副作用(出现胃肠不适、黑便、恶心、嗳气等症状)和严重副作用(以出现黑便,大便潜血检查阳性,经停药抗酸治疗后黑便、潜血消失为判定上消化道出血副反应依据),评定复发必须有CT/MRI确诊。结果见表15。
4.3结论
本发明组合及阿司匹林均可以降低缺血性脑卒中的复发率,两者效果相当。与空白对照组相比,本发明组合和药物对照组均有着显著性差异。
服用阿司匹林的480例中,出现37例副作用和11例严重副作用;而服用本发明组合的400例中,只有7例副作用,1例严重副作用产生,两组对比有显著性差异。
表15二级预防的临床观察结果
|
30天 |
60天 |
90天 |
180天 |
累积复发 |
卒中复发率 |
本发明组合药物对照空白对照 |
111116 |
151525 |
172142 |
242853 |
5.7%5.8%11.3% |
消化道副反应 |
本发明组合药物对照空白对照 |
1112 |
3212 |
5285 |
7378 |
1.67%7.71%1.70% |
上消化道出血副反应 |
本发明组合药物对照空白对照 |
030 |
050 |
161 |
1112 |
0.24%2.29%0.43% |