CN103179973A

CN103179973A - 芍药内酯苷或其代谢物的抗焦虑及改善睡眠障碍的用途

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Publication number: CN103179973A
Application number: CN2011800514673A
Authority: CN
Inventors: 张作光
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: EP2644198B1; CN103179973B; DK2644198T3; EP2644198A4; ES2633127T3; EP2644198A1; US9555055B2; US20130316966A1; WO2012068958A1

Abstract

本发明公开了一种芍药内酯苷或其代谢物在制备抗焦虑、改善睡眠的药物或保健食品中的新用途。试验证明，芍药内酯苷抗焦虑和通过延长SWS改善睡眠的疗效显著，毒副作用小，是一种安全、有效地治疗焦虑症和睡眠障碍的单体化合物。

Description

芍药内酯苷或其代谢物的抗焦虑及改善睡眠障碍的用途技术领域

本发明涉及芍药内酯苷或者芍药内酯苷代谢物在制备用于预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物或保健食品中的用途。背景技术

现代社会由于竞争加剧和生活节奏的加快，患有焦虑症和睡眠障碍的人群越来越多。现有的镇静安眠药和抗焦虑药（如苯二氮卓类药物）的作用特点在于使失眠者入睡快，虽然浅睡眠时间可能延长，却不同程度地损害了两种重要的睡眠成分：慢波睡眠（SWS ) 和快动眼睡眠（REMS)。因此，并未真正改善睡眠质量，不可避免地会出现头晕、乏力、困倦、注意力不集中等现象，反复应用甚至可能出现心理和生理上的依赖性。新一代抗焦虑、镇静安眠药（如丁螺环酮）在改善睡眠质量上提高很多，且无明显的成瘾性，但服用后可能会出现头晕、头疼及肠胃功能紊乱等副作用。因此，继续探寻和研发新的治疗焦虑症及睡眠障碍的药物十分必要。

芍药内酯苷（Albiflorin ) —种单萜类天然活性物质，分子式为 C₂₃H₂₈0„, 分子量为 480.46，分子结构如式 I所示，其来源于毛茛科植物白苟 (Paeonia lactiflora Pall ) 川赤苟 (Paeonia veitchii Lynch) 或牡丹 R suffrsticosci ARD 的根。

(I)

芍药内酯苷具有内酯环结构，但是没有半縮醛结构，其在厌氧条件下转化成两种产物，分别为芍药内酯人、芍药内酯8。芍药内酯八、 B的结构分别如式（II) 和式（III) 所示：

现代药理研究表明芍药内酯苷（也称芍药内酯甙）具有镇痛、抗惊厥作用，对免疫系统的作用，对平滑肌的作用，抗炎作用，抗病原微生物作用，护肝作用，临床上主要用于抗癫痫、镇痛、戒毒、止眩晕，治疗类风湿性关节炎，治疗细菌性痢疾及肠炎，治疗病毒性肝炎，治疗老年性疾病，抗硫酸钡絮凝和溶解粘液。

现有技术（张安平等，白芍总甙对大白鼠睡眠节律的影响，中国药理学通报， 1993， 9(6)： 454) 曾记载：白芍总甙是从白芍中提取的有效成分，包括芍药甙、羟基芍药甙、芍药花甙、芍药内酯甙和苯甲酰芍药甙等，其中芍药甙的含量约占总甙的 90%以上。因此，芍药总甙的药理作用基本上代表了芍药甙的药理作用，并且白芍总甙对大白鼠的睡眠节律有影响。换言之，现有技术仅是记载了白芍总甙对大白鼠的睡眠节律有影响，而未提示芍药内酯苷这个单体化合物的抗焦虑和治疗睡眠障碍的功效。

本发明人采用先进的分离纯化技术，从白芍中提取治疗焦虑症和睡眠障碍的有效成分芍药内酯苷，使其纯度达到 50-99%，并对芍药内酯苷及其相应的药物制剂进行了缓解、治疗焦虑症和睡眠障碍（特别是治疗抑郁症伴生的睡眠障碍）的药效学、药理学研究，结果表明芍药内酯苷单体治疗焦虑症和睡眠障碍的药理作用清楚，功效显著，毒副作用低，安全性高，可以为焦虑症和睡眠障碍患者提供一种高效低毒的药物。此外，还对芍药苷与芍药内酯苷在改善睡眠障碍的功效方面进行了比较，实验结果证明芍药内酯苷在改善睡眠障碍功效上明显强于芍药苷，是白芍总苷抗焦虑及改善睡眠障碍的主要有效成分，这点修正了以往的传统观点。

保健食品或称营养增补剂（dietary supplement)为一种在日常饮食之外为增加营养成分而摄入的含有营养素的口服产品或者制剂。它不替换页 (细则第 26条) 是药品，而是一种食物，但是也有别于餐桌上一日三餐的食物。 "保健食品"既属于食物的范畴，但又不同于传统意义上的食物，它们的作用都是在饮食之外补充营养，调节人体机能，增强体质。发明内容

本发明的目的在于提供芍药内酯苷或者芍药内酯苷代谢物在制备用于预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍药物或保健食品中的用途。芍药内酯苷代谢物是芍药内酯人、芍药内酯8。

所述睡眠障碍是失眠，主要表现为睡眠维持困难和早醒，所述睡眠障碍还包含焦虑症、抑郁症伴生的睡眠障碍。

根据本发明所述的药物可以由芍药内酯苷或者芍药内酯苷代谢物和药学上可接受的载体组成。

采用现有技术的方法，所述药物可以加工成片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂形式。

本发明的另一个目的在于提供一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物，其特征在于所述药物至少含有以下物质中的一种：芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。所述芍药内酯苷代谢物是芍药内酯 A、芍药内酯 B。所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6-100%。其中所述芍药内酯苷组合物可选自芍药内酯苷的药学上可接受的盐和芍药内酯苷的溶剂化物。

本发明的另一个目的在于提供一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的保健食品，其特征在于所述保健食品至少含有以下物质中的一种：芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。其中所述芍药内酯苷代谢物为芍药内酯 A、芍药内酯 B。所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6%-100%。

本发明的另一个目的在于提供一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的方法，其包括向患者施用治疗有效量的芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。其中，所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6%-100%。

换言之，本发明涉及芍药内酯苷（Albifl_OTin)、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物的预防、缓解和 /或治疗焦虑症和睡眠障碍的新用途，提供芍药内酯苷或其药学上可接受的盐或其溶剂化物或是含有效量芍药内酯苷的芍药提取物新的药用用途，即在预防、缓解和 /或治疗焦虑症和睡眠障碍的药物、保健食品中的新用途。

为实现上述目的，本发明提供一种芍药内酯苷在制备预防、缓解和 /或治疗焦虑症和睡眠障碍疾病（特别是治疗抑郁症伴生的睡眠障碍）的药物、保健食品中的用途，本文所述的睡眠障碍主要指的是以睡眠维持困难为特征的失眠症或早醒。

在筛选具有治疗焦虑症和睡眠障碍功效的天然活性成分的过程中，本发明人发现中药芍药的提取物中的化学成分之一芍药内酯苷具有强烈的药效作用，同时发现芍药内酯苷在人体内的两个代谢产物芍药内酯 A (paeonilactone A)和芍药内酯 B (paeonilactone B )也具有治疗、预防焦虑症和睡眠障碍的药用价值。

其中，所述"芍药内酯苷"是指芍药内酯苷的外消旋体、立体异构体或以任意比例混合的立体异构体混合物。

特别地，所述芍药内酯苷的两个代谢产物为芍药内酯 A

( aeonilactone A) 禾口苟药内酉 B (paeonilactone B )。

特别地，所述药学上可接受的载体通常被认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》（Handbook of Pharmaceutical excipients,第 2版，由 A. Wade 禾口 R J. Weller 编辑； American Pharmaceutical Association 出片反， Washington and The Pharmaceutical Press, London, 1994) 等工具书中找到。

尤其地，所述载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂；矫味剂；香料等。

其中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂形式存在。

其中，所述药物是通过胃肠道给药和非胃肠道给药途径给药。特别地，所述的非胃肠道给药途径选自注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。

其中，非胃肠道给药制剂选自注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等。特别地，所述胃肠道给药制剂选自片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂等。

其中，所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为

6-100%, 优选为 10-40%, 进一步优选为 15-25%。

本发明的另一方面提供一种芍药内酯苷组合物在制备预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物、保健食品中的用途。

其中，所述芍药内酯苷组合物选自芍药内酯苷的药学上可接受的盐和芍药内酯苷的溶剂化物。

特别地，所述芍药内酯苷的药学上可接受的盐为生理学上（尤其是作为药物施用于人类和 /或哺乳动物时）可接受的盐。

其中，所述盐包括芍药内酯苷与酸加成反应得到的盐；所述芍药内酯苷的溶剂化物为芍药内酯苷的水合物。

特别地，所述酸选自盐酸、富马酸、马来酸、柠檬酸或琥珀酸中的一种或多种，所提及的这些酸仅作为说明的目的而不用来起限定作用。

本发明的另一方面提供一种含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物在制备预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物、保健食品中的用途。

其中，所述含有芍药内酯苷的药材选自药材芍药或牡丹皮，优选为白芍。

6-100%, 优选为 10-40%, 进一步优选为 15-25%。

本发明的另一方面提供一种芍药内酯苷代谢物在制备预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍疾病的药物或保健食品中的用途。

其中，所述芍药内酯苷代谢物为芍药内酯 A、芍药内酯8。

本发明的另一方面提供一种用于预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物，其包含芍药内酯苷。

其中，所述药物还含有药学上可接受的载体。

本发明的另一方面提供一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物，其至少含有以下物质中的一种：芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。

其中，所述药物由芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物中的一种与药学上可接受的载体组成。

特别地，其中，所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6-100%, 优选为 10-40%, 进一步优选为 15-25%。

其中，所述芍药内酯苷代谢物为芍药内酯 A、芍药内酯8。

其中，芍药内酯苷组合物选自芍药内酯苷的药学上可接受的盐和芍药内酯苷的溶剂化物。

其中，所述盐包括芍药内酯苷与酸加成反应得到的盐。

特别的，所述酸选自盐酸、富马酸、马来酸、柠檬酸或琥珀酸中的一种或多种，所提及的这些酸仅作为说明的目的而不用来起限定作用。

其中，所述芍药内酯苷的溶剂化物为芍药内酯苷的水合物。

其中，所述含有芍药内酯苷的药材选择芍药或牡丹皮，优选为白特别地，所述载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂；矫味剂；香料等。

所述药物可以采用本领域公知的方法制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等。

本发明的另一方面提供一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的保健食品，其含有以下物质中的一种：芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。

其中，所述保健食品中芍药内酯苷的含量为 6-100% , 优选为 10-40%, 进一步优选为 15-25%。

本发明还提供了一种治疗焦虑症及睡眠障碍的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的芍药内酯苷的药物组合物，所述治疗有效量为

0.6-4mg/kg/d , 优选为 l-3.5mg/kg/d，进一步优选为 1.2-2mg/kg/d。

除非另外说明，本文所用的术语"治疗有效量"为需要产生有效作用的药物的用量； "治疗有效量 "是可以调整和变化的，最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。

本发明具有以下优点：

1、本发明对已知化合物芍药内酯苷或其药学上可接受的盐或其溶剂化物发掘了新的药用价值，将其用于治疗焦虑症和改善睡眠障碍（芍药内酯苷通过激活 5-HT1A受体可明显增加 SWS, 达到抗焦虑及改善睡眠的功效），并可制备成预防、缓解和 /或治疗抑郁症伴生的睡眠障碍的药物或保健食品，从而为芍药等药材的应用开拓一个新的领域。

2、本发明的一系列实验研究证明，芍药内酯苷具有显著的预防和治疗焦虑症、改善睡眠障碍的作用，是芍药以及芍药提取物治疗焦虑症和睡眠障碍（特别是治疗抑郁症伴生的睡眠障碍）的主要功效成分，此发现修正了传统上认为芍药苷是白芍总苷改善睡眠的主要功效成分的观点。

3、本发明的芍药内酯苷的抗焦虑症和改善睡眠的作用机理明确，疗效显著，毒副作用小，安全性好，能够长期服用，具有较高的成药性和良好的药用前景。

4、本发明的产品原料来源丰富、价廉，临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。

5、本发明既可采用单一成分的芍药内酯苷活性成分制备预防和治疗焦虑症和改善睡眠的药物，又可采用芍药内酯苷与其它活性成分（例如芍药苷、甘草酸、五味子乙素等化合物）共同组方，制备多靶点抗焦虑症和改善睡眠的复方药物。具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件进行。

以下通过实施例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，所述实验例包括了本发明药物的药效学实验。实施例 1

将 100g纯度为 96.77%的芍药内酯苷加入到 50g淀粉和 10g淀粉硅胶中，混匀后直接灌入明胶硬胶囊中，制成每粒含 40mg芍药内酯苷的胶囊剂。实施例 2

将 100g纯度为 92%的芍药内酯苷，粉碎过 100目筛后与过 100目筛的 100g淀粉混匀后，加入适量的淀粉浆搅拌均匀，经 16 目铁丝筛网制粒， 60°C以下干燥，整粒，加入适量的硬脂酸镁混匀，送入压片机内进行压片，制成每片含 30mg芍药内酯苷的片剂。实施例 3

取 10g纯度为 98.5%芍药内酯苷，加入氯化钠 90g，加入注射用水，搅拌使其溶解，加注射用水至 1000ml, 然后用 0.22μηι微孔滤膜过滤，分装灌封，灭菌即可制备成芍药内酯苷氯化钠输液。实施例 4

将 100g芍药内酯苷含量为 16%的芍药提取物粉碎至 200目，加入到 100g已经溶胀的羧甲基纤维素钠（CMC ) 中，搅拌均匀，加入蒸馏水至 10L, 搅拌制成混悬液，每毫升混悬液含 10mg芍药内酯苷。实施例 5 芍药内酯苷对小鼠明暗箱实验的影响（抗焦虑实验） 5.1 实验材料与方法

5.1.1药品芍药内酯苷（96.77%) , 由中国北京欧纳尔生物工程技术有限公司提供。地西泮，中国天津金辉氨基酸有限公司产品。

5丄 2动物

雄性，体重 24-26g，二级，由北京大学医学部实验

5丄 3仪器

自制明暗穿箱

5.1.4方法

5.1.4.1动物分组与给药方法

小鼠随机分为 5组，芍药内酯苷高剂量组（14mg/kg/d)、苷中剂量组（7mg/kg/d)、芍药内酯苷低剂量组（3.5mg/kg/d) 组（2.5mg/kg/d)、 NS组。每天一次灌胃给药，连续给药 7天

间动物自由进食饮水，于第八天给药后 lh后进行试验。

5.1.4.2小鼠明暗箱实验

明暗穿箱（44cmx21 cmx21 cm) 中暗箱占 1/3，顶部加盖；明箱占 2/3，光亮照明，两箱间有一门洞供动物穿过。实验时将小鼠置于明箱中央，背朝暗箱，观察并记录 lOmin内小鼠进入暗箱后返回明箱的次数，并以此作为评价药物抗焦虑作用的指标。

5.1.5统计学处理

数据以表示，实验结果用 SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。

5.2 结果

芍药内酯苷对小鼠明暗箱实验中穿箱次数的影响，其结果如表 1 所示，芍药内酯苷高、中、低剂量组及地西泮组均可显著增加小鼠由暗箱返回明箱的次数，与 NS组比较差异具有统计学意义。表 1 芍药内酯苷对小鼠明暗箱实验中穿箱次数的影响

动物数（只）剂量（mg/kg/d) 由暗箱返回明箱的次数芍药内酯苷高剂量： 10 14mg/kg/d 12.1±3.51 **

芍药内酯苷中剂量： 10 7mg/kg/d 13.4±3.23 **

芍药内酯苷低剂量： 10 3.5mg/kg/d 10.6±3.42*

地西泮 10 2.5mg/kg/d 13.6±3.35

_Νς 10 6.9±3.74

注： * Ρ<0.05， ** Ρ<0.01，与 NS组比较 5.3 结论

明暗箱实验是建立在鼠类对强光的先天性厌恶和对新环境的自发性探究行为基础上设计的抗焦虑实验模型，有抗焦虑作用的药物（如地西泮等）均可增加动物的穿箱速度及在明箱的滞留时间，非抗焦虑剂则无此作用。本发明采用的明暗箱实验结果显示芍药内酯苷高、中、低剂量组及地西泮组均可显著增加小鼠由暗箱返回明箱的次数，与 NS 组比较差异具有统计学意义（PO.Ol , P<0.05 )o 实验结果表明芍药内酯苷具有一定的抗焦虑作用。实施例 6芍药内酯苷对大鼠睡眠节律的影响

6.1 试剂与材料

6.1.1 材料

6.1.1.1 药品

芍药内酯苷（98.3%), 由中国北京欧纳尔生物工程技术有限公司提供。临用前用 NS溶解并配制成所需浓度。 6.1.1.2 动物

SD雄性大鼠， 30只，体重 200-250g， 3-4月鼠龄，由维通利华实验动物公司提供。

6.1.1.3 仪器

日产 RM-6000型八导生理记录仪，国产江湾 I型 C通用脑立体定向仪。

6.2 方法 6.2.1 大鼠记录电极的安装

将大鼠用戊巴比妥钠（35mg/kg， ip) 麻醉，固定于江湾 I型脑立体定向仪上，头部剪毛并消毒。切开皮肤暴露颅骨，分离骨膜，分别于顶叶和枕叶皮层部位各插入一镀金螺丝电极，使其与硬脑膜接触，用于记录大鼠皮层脑电图（EEO)。另于预肌或颈肌部位各插入一对镀金裸导线电极于左右两侧，用于记录肌电图（EMG)。电极埋入后均用自凝牙托粉固定，并焊接于微型插座上供记录时使用。

6.2.2 实验记录与分析

将埋好记录电极的大鼠单独饲养于自制圆形有机玻璃笼内，使其自然恢复 1 周后投入实验。实验前将动物置于无噪声干扰的屏蔽室内适应 24h，保持 I2/12h的明暗节律。室温 22±2°C ，湿度 60±10， EEG 和 EMG 信号由八导记录仪接收并同步描记于记录纸上（纸速： 10mm/s), 连续 6 h。记录观测结果：以目测法划分为醒觉（Waking)、慢波睡眠和异相睡眠（PS) 3个时相（Phase), 以 60s为一段，计算各时相的发生次数（Episode frequency) 与持续时间（ Episode during )。

6.3 结果

将埋好电极的大鼠 30只按表分组并给药。给药前先描记两次正常睡眠多导图（每天描记 1次，每次连续 6h)，取其均值作为正常基础对照值。表 2中的结果表明，两种剂量的芍药内酯苷连续服用 1天对大鼠各睡眠时相无明显影响；连续服用 5 天，芍药内酯苷小剂量组（7 mg/kg) 可见 SWS相有延长趋势；连服 7天，该剂量组则可明显縮短大鼠的醒觉（Waking) 时间，延长其慢波睡眠（SWS) 时间。与用药前相比， SWS相平均延长了 23.26% (PO.05 ) , 而对 PS无明显影响。表 2 芍药内酯苷对大鼠睡眠（连续 6h) 周期的影响（x±s ) 药物剂量 n 睡眠给药前第 1天第 3天第 5天第 7天

(mg/kg/d) 时相 (%)

NS - 10 SWS 51.7i4.3 512t5.5 52516.6 542t5.4 54214.1

PS 72tl.l 7.5±1.6 7.3士 1.4 8. 2.0 73士1.4

Waking 41.&14.9 0.&t5.0 39.6t5.5 37.6t6.1 38.714.0 芍药内酯苷 14 10 SWS 50. 6 521=t4.8 53.3±5.1 54.5t5.5 55.1=ΰ2

PS 6.¾0.8 7.0ttl2 7.3±1.3 7.6tl.5 6.1士 12 Waking 37.1=ΰ.3 36.516.5 36.7±7.0 30.4t7.5 36.4i4.5

7 10 SWS 54.6i3.4 55.¾t6.7 56.3±5.9 6i .i 673i3.6*

PS 8.W).8 7.7士 1.8 72tl.3 8.0ttl.5 72tl.l

Waking 0.6i4.8 412t5.3 0.1±5.6 37.6 .5 38.6142 注：与给药前比较， * P<0.05

6.4 讨论

本文实验结果表明：

1、芍药内酯苷（7mg/kg， igx7d) 可改变正常大鼠睡眠各时相的分布，表现为大鼠觉醒时间縮短， SWS时间明显延长。

2、芍药内酯苷影响睡眠的作用机理可能与激动中枢神经突触后膜 5-HTA1受体有关，这方面的问题尚待深入研究。实施例 7芍药苷和芍药内酯苷改善睡眠作用的考察

7.1 动物分组及给药

7.1.1动物分组

ICR小鼠 140 只（15-17g，雄性，购于医科院动物所），随机分为 10组，每组 14只。分别为芍药苷 100mg/kg剂量组、芍药苷 50mg/kg 剂量组、芍药苷 25mg/kg剂量组、芍药苷 12.5mg/kg剂量组、芍药内酯苷 28mg/kg剂量组、芍药内酯苷 14mg/kg剂量组、芍药内酯苷 7mg/kg 剂量组、生理盐水对照组、阳性药多塞平 25mg/kg大剂量组、阳性药多塞平 lmg/kg小剂量组。 7.1.2 试剂

芍药内酯苷及芍药苷（中国北京欧纳尔生物工程技术有限公司提供），盐酸多塞平片（中国北京恒生药业有限公司，购于天坛医院），地西泮片（中国北京益民药业有限公司，购于天坛医院），戊巴比妥钠 (购于中国国药集团化学试剂北京有限公司）。

7.2 实验方法

7.2.1睡眠潜伏期、睡眠持续期及入睡率的判断准则

小鼠保持背卧位 lmin以上，认为小鼠翻正反射消失。小鼠自动翻正身位后，立即将小鼠置于背卧位， lmin之内小鼠翻正身位，认为小鼠翻正反射恢复。记录小鼠翻正反射消失时间及恢复时间。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠至小鼠出现翻正反射消失的时间段记为睡眠潜伏期。小鼠翻正反射消失至小鼠翻正反射恢复的时间段记为睡眠持续期。小鼠睡眠持续期在 5min以上者认为小鼠入睡。

7.2.2 戊巴比妥钠最小阈上剂量和最大阈下剂量的确定

随机取 4 只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠（45mg/kg， 0.1ml/10g) , 观察 15min内小鼠翻正反射消失及恢复的情况，评判准则见 7.2.1。根据实验结果，进一步调整戊巴比妥钠剂量为 51mg/kg、 40mg/kg、 35mg/kg、 38mg/kg, 观察 15min内小鼠翻正反射消失及恢复的情况，初步确定戊巴比妥钠的最大阈下剂量为 35mg/kg，最小阈上剂量为 51mg/kg, 进一步增加小鼠只数，同法实验，观察 15min内小鼠翻正反射消失及恢复的情况。能使每组小鼠 100%入睡的戊巴比妥钠剂量为阈上剂量，使每组小鼠 90%以上不入睡的剂量为戊巴比妥钠的阈下剂量。

7.2.3 阈上剂量的戊巴比妥钠延长睡眠实验

小鼠连续给药 10天后，末次给药 lh后腹腔注射阈上剂量的戊巴比妥钠（51mg/kg， 0.1ml/10g)。观察小鼠翻正反射消失及恢复的情况，记录小鼠翻正反射消失时间及恢复时间，睡眠潜伏期、睡眠持续期及入睡率的判断准则同 7.2.1。

7.2.4阈下剂量的戊巴比妥钠诱导睡眠实验

小鼠连续给药 14天后，末次给药 lh后腹腔注射阈下剂量的戊巴比妥钠（35mg/kg， 0.1ml/10g)。观察小鼠翻正反射消失及恢复的情况，记录小鼠翻正反射消失时间及恢复时间，睡眠潜伏期、睡眠持续期及入睡率的判断准则同 7.2.1。 7.3实验结果表 3 芍药苷及芍药内酯苷对阈上剂量的戊巴比妥钠延长睡眠的影响 (给药后 10天) 组别入睡潜伏期（min) 睡眠持续期（miti) 芍药内酯苷（28mg/kg) ~~ 13.17±23.54 84.14±20.72 芍药内酯苷（14mg/kg) 5.89±3.12 87.66±32.04*

芍药内酯苷（7mg/kg) 4.45±1.89 97.46±11.81 *

芍药苷（100mg/kg) 28.10±44.63 72.98±20.83

芍药苷（50mg/kg) 5.17±1.37 73.70±27.88

芍药苷（25mg/kg) 4.96±2.18 68.64±19.23

芍药苷（12.5mg/kg) 4.11±1.52 74.57±13.02

多塞平（lmg/kg) 4.38±1.60 74.91±16.55

多塞平（25mg/kg) 4.72±2.40 63.60±12.09

生理盐水对照组 6.05±4.78 69.83±24.24

数据以 Means±S.D.表示， ONE-WAY ANOVA统计， * P<0.05， ** P<0.01

组别小鼠只数 /组入睡只数 /组入睡率芍药内酯苷（28mg/kg) 13 0 0/13

芍药内酯苷（14mg/kg) 13 8 8/13*

芍药内酯苷（7mg/kg) 13 10 10/13*

芍药苷（100mg/kg) 1 1 3 3/11

芍药苷（50mg/kg) 12 5 5/12

芍药苷（25mg/kg) 12 4 1/3

芍药苷（12.5mg/kg) 12 2 2/13

多塞平（lmg/kg) 12 1 1/12

地西泮（2mg/kg) 13 12 12/13*

生理盐水对照组 13 2 2/13

数据以 Means±S.D.表示， Chi-square统计， * P<0.05 , ** P<0.01 表 5 芍药苷及芍药内酯苷对小鼠自主活动的影响（给药后 14天）

组别自主活动数

芍药内酯苷（28mg/kg) 476.78±113.78

芍药内酯苷（14mg/kg) 393.28±107.73*

芍药内酯苷（7mg/kg) 342.64±133.38**

芍药苷（100mg/kg) 434.45±76.43

芍药苷（50mg/kg) 503.00±137.04

芍药苷（25mg/kg) 468.71±73.56

芍药苷（12.5mg/kg) 456.71±93.95

多塞平（lmg/kg) 420.50±110.28

地西泮（2mg/kg) 301.85±103.11 **

生理盐水对照组 482.46±74.15

数据以 Means±S.D.表示， ONE- WAY ANOVA统计， * P<0.05， ** P<0.01

7.4 实验结论

连续给药 10天，芍药内酯苷（14mg/kg)组、芍药内酯苷（7mg/kg) 组均能明显延长阈上剂量的戊巴比妥钠的睡眠时间；连续给药 14天，芍药内酯苷（14mg/kg)组、芍药内酯苷（7mg/kg) 组和阳性药地西泮均能明显增加阈下剂量的戊巴比妥钠诱导睡眠的入睡率，减少小鼠的自主活动次数。实验结果提示：芍药内酯苷（14mg/kg)、芍药内酯苷 (7mg/kg) 可能具有一定的催眠作用。实施例 8 白芍提取物（含 16%芍药内酯苷）对慢性应激大鼠 5-HT1A受体 mRNA表达的影响

8.1 实验材料

8.1.1实验药物

受试药物白芍提取物（含 16%芍药内酯苷），由中国北京欧纳尔生物工程技术有限公司提供。阳性药盐酸氟西汀（Fluoxetine, Prozac百忧解）由礼来苏州制药有限公司提供（批号：国药准字 J20030017)。

8.1.2实验动物

Wistar雄性大鼠，体重 220g-240g，由北京维通利华公司提供；所有动物提前一周购入，常规饲养。

8.1.3仪器与试剂

Universal 32R低温高速离心机（Hettich, 德国）； CD3192电热恒温水浴（杭州雪中炭恒温技术有限公司）； SPECTRAmaxl90 (Molecular Devices, 美国）； PTC-200 PCR仪（MJ Research, 美国）； DYY-8C电泳仪（北京市六一仪器厂）； ChampChemi X化学发光凝胶图像分析系统（中国北京赛智创业科技有限公司）； TRIzol (Invitrogen) , DEPC

( Amresco )、 RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit ( Fermentas )。

8.2 实验方法

8.2.1 分组和给药

正常大鼠 72只， 24h禁水不禁食后，给予 1 %蔗糖水，测定 lh内的消耗量。根据蔗糖水消耗量随机分成 6个组，每组 12只，即正常对照组、模型组、阳性药百忧解组（ 2.5mg/kg/d )、白芍提取物高 (70mg/kg/d, 含 11.2mg白芍内酯苷）、中（35mg/kg/d，含 5.6mg白芍内酯苷）、低（17.5mg/kg/d，含 2.8mg白芍内酯苷）剂量组。造模同时给药，每日一次，连续给药 21天。各组均按 l.Oml/lOOg体重给药，每周称量一次体重。 8.2.2 造模

对照组大鼠群养，用药组及模型组大鼠每笼单只饲养。用药组（给药同时）及模型组大鼠接受 21天各种不同的随机应激，包括 4°C冰水游泳（5min)、 45°C热烘（5min)、夹尾 ( lmin)、潮湿饲养（潮湿垫料）、昼夜颠倒（24h)、禁食（24h)、禁水 (24h) 等刺激。

8.2.3 RT-PCR实验

8.2.3.1 取材

大鼠慢性应激实验结束后，立即断头处死，取大脑于冰上快速分离出海马，于 -70 °C低温储存待用。

8.2.3.2 总 RNA的提取

按照 TRIzol试剂说明，采用异硫氰酸胍一步法提取总 RNA, 所提总 RNA经 0.9 %的琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并用紫外分光光度计测定 RNA含量及纯度。

8.2.3.3 RT-PCR

取总 RNA样品，加入 Oligo (dT) 和 M-MLV逆转录酶，以 25μ1 体系在 42°C下反应 60min合成 cDNA第一链，之后于 94°C加热 2min 以灭活逆转录酶。按照 PCR使用说明，在 25μ1体系中，取上述反应物 2μ1，加入 PCRMix 12·5μ1，并分别加入 5-HT1A-R引物 2μ1:上游 5' CCC AGC GAG TCA GGA TCT AAC 3'，下游 5' GAT TGA GCA GGG AGT TGG AGT 3'，扩增长度为 268bp。 β-actin的弓 |物序列为：上游 5' CAT CCT GCG TCT GGA CCT 3'，下游 5' CAC ACA GAG TAC TTG CGC TCA 3'，扩增长度为 498bp。PCR反应条件为 95 °C变性 5min。95°C， 30秒； 58°C， 30秒； 72°C， 30秒；共 25个循环。

8.2.3.4 扩增产物的半定量分析将 30μ1 5-HT1A-R扩增产物和 ΙΟμΙ Actin扩增产物混合后进行 1.5

%琼脂糖凝胶电泳， 100V电泳 30min，利用化学发光凝胶图像分析系统进行图像采集后，用 ChampGd凝胶图像处理和分析软件进行条带的灰度扫描， IOD5-HTR /IODActin比值为扩增产物的相对定量，进行组间比较。

8.2.4统计学处理

实验数据以均数±标准差（^± 表示，采用 SPSS13.0统计软件，运用单因素方差分析（one-way ANOVA) 进行各组间比较，显著性水平以 0.05和 0.01为标准。

8.3 实验结果

白芍提取物（含 16%芍药内酯苷）对慢性应激抑郁大鼠 5-HT1A 受体 mRNA表达的影响：结果表明，连续给药 21天后，与空白组比较模型组大鼠 5-HT1A受体 mRNA表达水平降低（PO.05 ); 与模型组相比白芍提取物中、高剂量组和阳性药盐酸氟西汀组大鼠 5-HT1A受体 mRNA表达水平升高（PO.05 ); 见表 6。表 6 白芍提取物（含 16%芍药内酯苷）对慢性应激抑郁大鼠 5-HT1 A受体 mRNA 表达的影响

组别齐糧 (mg/kg) 样本数 5-HT1A受体 mRNA表达空白组 - 6 0.70±0.16* 模型组 - 6 0.31±0.07 阳性组 2.5mg/kg/d 6 0.63±0.21* 白芍提取物低剂 t组 17.5mg/kg/d 6 0.39±0.23

白芍提取物中剂 t组 35mg/kg/d 6 0.63±0.11* 白芍提取物高剂 t组 70mg/kg/d 6 0.63±0.14* 与模型组比较， * P<0.05， ** P<0.01

8.4.讨论

海马是参与调节情感、认知、行为的重要边缘系统结构，富含突触后膜 5-HT1A受体。本实验采用慢性不可预见性应激抑郁大鼠模型，模拟人类慢性、低水平的应激源所致抑郁症来研究海马 5-HT1AR, 在受体水平探讨抑郁症的生化病因。

5-HT1AR 含有 421 个氨基酸，属 G蛋白偶联受体家族。人类 5-HT1AR 遗传基因位于第 5 号染色体 qll.2-ql3 区域。突触前膜 5-HT1AR自身受体主要位于脑干中缝背核的 5-羟色胺能神经元细胞体树突，它的激活抑制了 5-HT神经元的电活动，使前额叶皮层 5-HT神经递质释放减少。突触后膜 5-HT1AR主要位于海马、杏仁核、额叶皮层，调节 5-HT释放。 5-HT1AR转导机制主要是偶联 G蛋白，抑制腺苷酸环化酶（AC)。虽然有许多 5-HT1AR与抑郁症的报道，但未获一致的肯定。一组基础研究报道急性和慢性不可预见性应激增加血浆糖皮质激素，并下调 5-HT1AR结合和 5-HT1AR的 mRNA水平。 Sargent 在采用 [11C]WAY-100635PET法测定脑中 5-HT1AR时发现：重症抑郁患者额叶皮层、颞叶皮层、边缘皮层 5-HT 1 AR结合广泛下降。 Stockmeier 等报道自杀的抑郁症患者脑干中缝核区 [3H]8-OH-DPAT 结合的突触前膜 5-HT1AR明显升高。这些证据支持抑郁症时突触前膜的 5-HT1AR 自身受体高敏，而突触后膜 5-HT1AR低敏的观点。三环类抗抑郁药通过增加突触后膜 5-HT1AR的敏感性发挥抗抑郁作用。 5-HT再摄取抑制剂（SSRI)使突触前膜 5-HT1AR自身受体脱敏，从而发挥抗抑郁作用。 5-HT1AR 自身受体拮抗剂可提高 SSRI的抗抑郁效果，明显縮短抗抑郁药起效时间。丁螺环酮可选择性激动突触后膜 5-HT1AR, 有显著的抗抑郁作用。

本实验结果发现应激抑郁模型大鼠海马 5-HT1A受体 mRNA表达水平下降，这与近期国外报道一致，提示海马 5-HT1A受体与慢性应激所致抑郁的发生密切相关。受试药物白芍提取物（含 16%芍药内酯苷）能对抗慢性应激引起海马 5-HT1A受体 mRNA表达水平的降低，提示白芍提取物的抗抑郁、抗焦虑和通过延长 SWS改善睡眠的作用可能与上调海马 5-HT1A受体相关。

Claims

权利要求书

1、芍药内酯苷或者芍药内酯苷代谢物在制备用于预防、缓解和 / 或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物或保健食品中的用途。

2、根据权利要求 1所述的用途，其特征在于所述芍药内酯苷代谢物是芍药内酯人、芍药内酯8。

3、根据权利要求 1或 2所述的用途，其特征在于所述睡眠障碍是失眠，主要表现为睡眠维持困难和早醒，所述睡眠障碍还包含焦虑症、抑郁症伴生的睡眠障碍。

4、根据权利要求 1或 2所述的用途，其特征在于所述药物由芍药内酯苷或者芍药内酯苷代谢物和药学上可接受的载体组成。

5、根据权利要求 1所述的用途，其特征在于所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂形式存在。 6、一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的药物，其特征在于所述药物至少含有以下物质中的一种：芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。

7、根据权利要求 6所述的药物，其特征在于所述芍药内酯苷代谢物是芍药内酯人、芍药内酯8。

8、根据权利要求 6所述的药物，其特征在于所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6-100%。

9、根据权利要求 6或 8所述的药物，其特征在于所述芍药内酯苷组合物选自芍药内酯苷的药学上可接受的盐和芍药内酯苷的溶剂化物。

10、一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的保健食品，其特征在于所述保健食品至少含有以下物质中的一种：芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。

11、根据权利要求 10所述的保健食品，其特征在于所述芍药内酯苷代谢物为芍药内酯人、芍药内酯8。

12、根据权利要求 10所述的保健食品，其特征在于所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6%-100%。

13、一种预防、缓解和 /或治疗焦虑症及睡眠障碍的方法，其包括向患者施用治疗有效量的芍药内酯苷、芍药内酯苷代谢物、芍药内酯苷组合物、含芍药内酯苷的药材或含芍药内酯苷的药材提取物。

14、根据权利要求 13所述的方法，其特征在于所述芍药内酯苷代谢物为芍药内酯 A、芍药内酯8。

15、根据权利要求 13所述的方法，其特征在于所述含芍药内酯苷的药材提取物中芍药内酯苷的含量为 6%-100%。