CN103269699A - 包括给予二氢杨梅素的治疗酒精中毒、酒精使用障碍以及酒精滥用的方法 - Google Patents
包括给予二氢杨梅素的治疗酒精中毒、酒精使用障碍以及酒精滥用的方法 Download PDFInfo
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Abstract
在此披露了用于治疗酒精中毒、酒精使用障碍以及酒精滥用的方法，这些方法包括给予二氢杨梅素。如在此所披露的，二氢杨梅素增强具有α4βδ亚基的GABAARs的活性，其中α4βδ亚基与乙醇的作用相关，拮抗乙醇对GABAARs的作用，作用于GABAARs的苯二氮卓位点，并且抑制、降低和/或逆转由暴露于乙醇引起的部分或全部GABAAR可塑性。
Description
相关申请的交叉引用
本发明要求2010年8月24日提交的美国专利临时申请序列号61/376,528的权益，该专利申请通过引用以其全文结合在此。
美国政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的批准号AA007680、AA016100和AA0017991的政府支持下做出的。政府在本发明中有某些权利。
发明背景
1.发明领域
本发明总体上涉及使用二氢杨梅素来调节乙醇诱导的γ-氨基丁酸（A）受体的可塑性的方法。本发明还涉及使用二氢杨梅素来治疗乙醇中毒、酒精使用障碍以及酒精滥用的方法。
2.相关技术说明
在美国，酒精依赖在可预防的发病率和死亡率的原因列表中排名第三。在美国，每年有超过20,000例酒精诱导的死亡，不包括事故和杀人。2008年，11,773人死于酒后驾驶撞车，几乎占美国所有交通相关死亡的三分之一。根据美国国家疾病控制与预防中心，与酒精有关的撞车的年度费用总数超过510亿美元。
酒精（乙醇，EtOH）与γ-氨基丁酸（A）受体（GABAARS）的相互作用在戒酒综合征（AWS）中起重要作用。参见贝克尔HC（Becker HC）（1998），《酒精健康与研究世界》（Alcohol Health Res World）22(l):25-33）；布恩SL（Boehm SL）等人（2004），《生化药理学》（BiochemPharmacol）68(8):1581-1602）；库布GF（Koob GF）（2004），《生化药理学》（Biochem Pharmacol）68:1515-1525）；Anacker AM和Ryabinin AE（2010），《环境研究与公共卫生国际期刊》（Int J EnvironRes Public Health）7(2):473-493）；以及Dopico AM和Lovinger DM（2009），《药理学评论》（Pharmacol Rev）61(1):98-114）。
突触上的GABAARs是由对乙醇具有低敏感性的αβγ亚基形成的；而含有α4βδ亚基的GABAARs对低乙醇浓度是高度敏感的。参见Liang J等人（2008），《酒精临床实验研究》（Alcohol Clin Exp Res）32(1):19-26）；Santhakumar V等人（2007），《酒精》（Alcohol）41(3):211-221）；以及Jia F等人（2005），《神经生理学杂志》（J Neurophysiol）94(6):4491-4501）。已知GABAARS经受乙醇、全身麻醉药、苯二氮卓类以及神经类固醇的变构调节。参见奥尔森RW（Olsen RW）和Homanics GE（2000）《神经系统中的GABA：五十年的观点》（GABA IN THENERVOUS SYSTEM:THE VIEW AT FIFTY YEARS）（马丁DL（MartinDL)和奥尔森RW编辑)第81-96页，利平科特（Lippincott）威廉姆斯&威尔金斯（Williams&Wilkins），费城（Philadelphia））；以及沃尔尼M（Wallner M）（2003），《美国国家科学院院刊》100(25):15218-15223）。这些研究表明AWS的内在机制是由过度滥用乙醇诱导的GABAARS可塑性，该可塑性与普遍降低的GABAAR激活以及差异改变的亚基表达相关。参见奥尔森（2005），《神经化学研究》（Neurochem Res）30:1579-1588）；Liang J等人（2006），《神经科学杂志》（J Neurosci）26:1749-1758）；以及Liang J等人（2007），《神经科学杂志》（J Neurosci）27:12367-12377）。含有GABAARS的突触外α4βδ亚基在体内或体外乙醇中毒之后不久内化。参见Shen Y等人（2010），《分子药理学》（Mol Pharmacol）79(3):432-442）；以及Liang J等人（2007）。含有GABAARS的突触外α4βδ亚基与由乙醇中毒和其他镇静催眠麻醉药诱导的行为性翻正反射丧失（LORR）展现出显著的线性关系。参见Liang J等人（2009），《神经生理学杂志》（J Neurophysiol）102:224-233）。换言之，含有GABAAR性质改变的突触外α4βδ是酒精诱导的行为改变的基础。因此，GABAARS已经被指示为一种可能用于治疗酒精依赖的神经药理学靶标。参见奥尔森和席哈特W(Sieghart W)（2009），《神经药理学》（Neuropharmacology）56:141-148）。遗憾的是，还没有已知的抑制和/或逆转由慢性暴露于乙醇导致的GABAAR可塑性的方法或组合物。
苯二氮卓类（例如，地西泮）是用于减少AWS症状的经典药剂。然而，苯二氮卓类在含有酒精敏感性和不敏感性α4βδ亚基的GABAARS下是无活性的。另外，苯二氮卓类对乙醇产生交叉耐受性。而且，作为一个主要副作用，频繁使用苯二氮卓类可能导致依赖性。事实上，苯二氮卓类和酒精的结合导致更大的物质成瘾问题，这些问题与酒精依赖本身相比更难克服。
除了苯二氮卓类，目前只有三种用于治疗酒精依赖的药剂通过了美国FDA的批准，即纳曲酮、阿坎酸、以及双硫仑。纳曲酮阻断阿片样受体且它可能还减少思考和反应时间，并且产生焦虑和其他不愉快的感觉。阿坎酸引起包括头痛、腹泻、肠胃气胀以及恶心的副作用，且两个大型美国临床试验未能证实其疗效。双硫仑是针对阻断酒精代谢的，由此引起对于酒精摄入的负反应，于是它的副作用包括潮红、心率加快、呼吸急促、恶心、呕吐、头痛、视觉障碍、精神错乱、以及循环衰竭。双硫仑还可能引起周围神经病变。
因此，对于治疗、抑制、降低和/或逆转部分或全部由暴露于乙醇引起的GABAAR可塑性的制剂和方法存在着一种需要。
发明概述
在一些实施例中，本发明提供了治疗、抑制、降低和/或逆转部分或全部由暴露于乙醇引起的GABAAR可塑性的方法，这些方法包括向一种将要、正在、和/或已经暴露于乙醇的GABAA受体给予二氢杨梅素。在一些实施例中，本发明提供了增强GABAA受体的活性的方法，包括向GABAA受体给予二氢杨梅素。在一些实施例中，本发明提供了拮抗乙醇对GABAA受体的活性的方法，包括在暴露于乙醇之前、期间和/或之后向脑组织给予作用于中枢神经系统GABAA受体的二氢杨梅素。
在一些实施例中，本发明提供了用于治疗、抑制和/或减轻受试者中的乙醇中毒、戒酒综合征的至少一种症状、酒精使用障碍和/或酒精滥用的方法，包括如在此所披露的治疗、降低和/或逆转GABAA受体的GABAAR可塑性、增强GABAA受体的活性、和/或拮抗酒精对GABAA受体的活性。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物，优选人类。在一些实施例中，戒酒综合征的症状选自下组，该组由以下各项组成：对乙醇的耐受性、基础焦虑增加、以及过度兴奋。在一些实施例中，该治疗减轻或抑制了受试者中的由暴露于乙醇引起的警觉性下降。在一些实施例中，酒精滥用是一种由酒精暴露诱导的大量饮酒。
如在此所披露的实施例，二氢杨梅素可以在暴露于乙醇之前、期间和/或之后给予。在一些实施例中，在范围从暴露于乙醇之前大约30分钟到立刻暴露于乙醇的时期期间给予二氢杨梅素。在一些实施例中，在范围从立刻暴露于乙醇之后到暴露于乙醇大约30分钟之后的时期期间给予二氢杨梅素。在一些实施例中，可以以一种可能含有或可能不含有乙醇的食品的形式（如饮料）给予二氢杨梅素。在一些实施例中，可以以一种药物制剂的形式给予二氢杨梅素。在一些实施例中，二氢杨梅素是与乙醇共同给予的。在在此所披露的实施例中，可以给予有效量的二氢杨梅素。在一些实施例中，给予治疗有效量的二氢杨梅素。在一些实施例中，给予单位剂量形式的二氢杨梅素。在一些环境下，对于一个人，单位剂量形式的二氢杨梅素的量是大约50-70mg。
上述总体说明和以下详细说明两者都仅仅是示例性的和说明性的，并且旨在为所要求的本发明提供进一步解释。附图被包括以便为本发明提供进一步的理解，并且被结合在本说明书中并构成它的一部分，图解本发明的若干实施例，以及与该说明一起用来解释本发明的原理。
附图说明
通过参考附图进一步理解本发明，其中：
图1A-1F为显示DHM阻断急性EtOH中毒并且防止EtOH戒断症状的图。通过用DHM（1mg/kg，腹膜内注射，n=5-7只大鼠/组）预治疗（图1A）、后治疗（图1B）以及联合治疗（图1C），缩短了EtOH（3g/kg，腹膜内注射）诱导的LORR持续时间。载体组大鼠接受盐水（20mL/kg，腹膜内注射）。这些结果显示单独的DHM不诱导LORR（图1C），然而即使在注射EtOH后30分钟时（虚线），DHM显著缩短了LORR持续时间。图1D是显示一个单独实验的结果的图。如在图1D中所示，乙醇（3g/kg）和DHM（1mg/kg，腹膜内注射）的同时腹膜内注射消除了戒断（48小时）诱导的耐受性以及EtOH（3g/kg，腹膜内注射）诱导的LORR（n=7/组）。DHM和EtOH的共同给予阻止了戒断（24小时）诱导的在PTZ诱导的发作持续时间（图1E）以及单剂量EtOH中毒（与图1B中相同的动物）发生率（图1F）方面的增加。*，p<0.01，相对于载体治疗，单因素方差分析。
图2A-2B是显示DHM阻止单剂量EtOH暴露/戒断诱导的GABAAR可塑性的图。将大鼠分为4个组并且用载体、EtOH（5g/kg，E）、EtOH联合DHM（1mg/Kg，E+D）或DHM（D）管饲。在戒断48小时之后，在海马切片中的DGCs上进行膜片钳记录。I强直的变化显示于图2A中，mIPSC的变化显示于图2B中（对照%）。0}N=4-7只鼠/组。*，p<0.05对0；
p<0.05，相对于载体治疗，双向RM方差分析。
图3是显示DHM增强GABAAR介导的电流，并且通过来自初次接受试验的大鼠的DGCs中的急性EtOH拮抗他们的增强的图。图a为一个连续电流跟踪，显示了DHM对I强直幅值和mIPSC电荷转移（mIPSC面积）的影响。DHM（1.0μΜ）轻微增加了总的电荷转移。I强直（图a-1）以及mIPSC（图a-2）的DHM浓度依赖性增强。N=6个神经元/组。*，p<0.05，相对于给药前，单因素方差分析。图B是一个样品跟踪记录，该踪迹记录来自施用EtOH（60mM）继之共同施用EtOH和DHM（0.3μΜ和1μΜ）的过程中的DGC。图b-1显示EtOH显著增强了I强直幅值；这种增强通过DHM共同施用而被浓度依赖性地减弱。n=6个神经元/组。图b-2显示EtOH-DHM类似地影响了mIPSC总电荷转移，但是由于mIPSC对EtOH和DHM两者的低敏感性，这种影响并不显著。n=5-7神经元/组。图c为一个样品跟踪记录，该踪迹记录来自施用EtOH（0.3μΜ）继之共同施用EtOH和DHM（10mΜ和60mΜ）的过程中的DGC。图c-1显示EtOH并没有通过DHM影响I强直的增强。图c-2显示DHM-EtOH类似地影响了mIPSC总电荷转移，但这种影响并不显著。n=5-7个神经元/组。*，p<0.01，DHM治疗后相对于给药前，单因素方差分析。
图4A-4B显示DHM+EtOH的共同给予防止了在DIV14原代培养的海马神经元中EtOH中毒诱导的功能性GABAAR可塑性。图4A是I强直幅值的总和，图4B显示了响应于来自载体治疗的、EtOH治疗的、EtOH+DHM治疗的以及DHM治疗的神经元的急性EtOH（60mM）的mIPSC电荷转移的变化（给药前%）。n=8-9个神经元/组。*，p<0.05，相对于EtOH治疗前；
p<0.05，药物治疗相对于载体治疗，双向RM方差分析。
图5A-5D显示DHM在对照神经元和EtOH暴露/戒断神经元两者中都增强了GABAAR功能。DHM浓度依赖性地增强了DIV14神经元中GABAAR介导的I强直（图5A）和mIPSC（图5B）。与对照（空心圆）相比较，这种反应在EtOH暴露之后（实心圆）适度地降低了。在EtOH暴露/戒断之后，I强直幅值存在轻微的右移，但mIPSC总电荷迁移则不然（n=5-9个神经元/组）。图5C显示了激发的GABAAR介导的电流的样品跟踪。图5D显示了DHM对GABA浓度反应曲线的影响。将幅值标准化到峰值电流，该峰值电流在不存在DHM的情况下由300μΜGABA激活。每个数值点为来自5-9个神经元的平均幅值。DHM是与GABA共同施用的。
图6A-6C是显示DHM消除了EtOH中毒以及DHM的作用被氟马西尼拮抗的图。图6A显示EtOH（E，3g/kg，腹膜内注射）诱导了翻正反射的丧失（LORR），而DHM（1mg/kg，腹膜内注射）和EtOH（E+D1）的同时注射大大缩短了LORR的持续时间。作为盐水注射，DHM（D1）没有诱导LORR（n=8-20只大鼠/组）。图6B显示在EtOH注射30分钟前施用DHM消除了EtOH诱导的LORR；而在EtOH诱导的LORR（用黑线指示）30分钟后，注射DHM降低了LORR的残余（n=5-10只大鼠/组）。图6C显示EtOH和DHM（3mg/kg，E+D3）的共同注射大大降低了EtOH诱导的LORR。氟马西尼（10mg/kg，F10）、EtOH以及DHM的同时注射（E+D3+F10）逆转了DHM的作用。当DHM的剂量增加到10mg/kg（E+D10+F10）时，氟马西尼部分地逆转了DHM的作用。当氟马西尼的剂量增加到30mg/kg（E+D10+F30），观察到DHM的更强的拮抗作用。氟马西尼和EtOH（E+F10）的共同注射没有改变LORR持续时间（n=5-6只大鼠/组，
p<0.05，相对于盐水组，*，p<0.05，相对于EtOH组）。
图7显示了在大鼠中的高剂量DHM和氟马西尼对LORR的影响。100mg/kg或300mg/kg的DHM（腹膜内注射）诱导了很短的LORR持续时间，以30和200mg/kg氟马西尼腹膜内注射没有诱导LORR。
图8显示了在EtOH诱导的LORR过程中的血浆[EtOH]测定的结果。X轴显示了在腹膜内注射EtOH（3g/kg）或共同施用DHM（1mg/kg和10mg/kg）与EtOH（E+D）之后的血液取样时间点（n=3-4只大鼠/组，*，p<0.05，相对于EtOH组，双向RM方差分析）。
图9显示DHM拮抗了EtOH诱导的GABAAR增强，并且该作用被氟马西尼阻断。图A显示了来自大鼠海马DGC的全细胞电压钳（-70mV）记录（左）以及叠加的平均mIPSC（右）。灰色虚线代表在所有GABAAR电流被印防己毒素（PTX，一种GABAAR拮抗剂，100μΜ）完全阻断后的平均电流，该电流作为用于计算GABAAR介导的I强直的幅值的基线。EtOH（60Mm，E）的浴应用（bath application）增加了I强直和mIPSC。DHM（0.3和1.0μΜ）拮抗了这些EtOH效应。图B总结了响应于EtOH和DHM的I强直面积。图C显示了响应于EtOH和DHM的mIPSC面积。图D是记录自DGC的样品跟踪（左）和叠加的平均mIPSC（右）。DHM（3μΜ）对急性EtOH诱导的GABAAR增强的拮抗作用被10μΜ氟马西尼逆转。图E是响应于EtOH、DHM以及氟马西尼的I强直面积的总结。图F是响应于EtOH、DHM以及氟马西尼的mIPSC面积的总结。n=4-6/组。*，p<0.05，相对于药物0；
p<0.05，相对于EtOH，双向RM方差分析。
图10显示了DHM是一种GABAARS在苯二氮卓位点的正向调节剂。图A显示了来自大鼠的海马DGC的全细胞电压钳（-70mV）记录（左）以及叠加的平均mIPSC（右）。图B是被DHM（从0.1μΜ到30μΜ）增强的I强直的总结（n=4-5.*，p<0.05，相对于药物0，单因素RM方差分析）。图C是被DHM（从0.1μΜ到30μΜ）增强的mIPSC面积的总结（n=4-5.*，p<0.05，相对于药物0，单因素RM方差分析）。图D显示了来自在DIV14的（DIV：在体外的天数）培养的海马神经元的全细胞电压钳（-70mV）记录。DHM（1μΜ，D1）增强的GABAAR介导的I强直和mIPSC被氟马西尼（F，10μΜ和100μΜ）逆转。所有GABAAR电流被荷包牡丹碱（GABAAR拮抗剂，Bic，10μΜ，灰色虚线）阻断。I强直(图E)以及mIPSC（图F）的DHM（1μΜ，D1）增强的总和（给药前（0）的%），而氟马西尼浓度依赖性地抑制了它们（n=7，*p<0.05，相对于药物0，单因素RM方差分析）。图G显示DHM抑制了结合在大鼠皮层膜匀浆中的[3H]氟硝西泮（flu）。增加DHM（0.03-100μΜ）的终浓度导致在皮层结合位点的[3H]氟硝西泮（终浓度为1nM）的移位。结果用GraphPad Prism4.0绘制并且呈现为两次实验的平均值（每个点做三次重复，n=2）。
图11A至11D显示DHM以一种浓度依赖性的方式增强了在来自大鼠的在DIV14的原代培养的海马神经元中的GABAAR介导的抑制。DHM以一种浓度依赖的方式增强了GABAAR介导的抑制。在DIV14的培养的神经元是在-70mV下电压钳制的全细胞。DHM对I强直（图11A）和mIPSC（图11B）的剂量反应曲线（n=9-10个神经元/组）。图11C显示了来自培养的海马神经元的样品跟踪，显示DHM（1μΜ）增强了由10μΜ和300μΜGABA的局灶胀泡（focal puff）激发的GABAAR电流。图11D显示了由GABA的局灶胀泡诱导的GABAAR电流的浓度反应曲线被DHM左移（0.3和1μΜ，n=5-9个神经元/组，*，p<0.05，相对于DHM0，单因素方差分析）。
图12A-12E显示DHM防止了EtOH戒断症状并且在大鼠海马中拮抗了EtOH暴露/戒断诱导的GABAARα4亚基表达的改变。向4组大鼠注射（腹膜内）单剂量载体、EtOH（3g/kg，E）、EtOH加上DHM（1mg/kg，E+D）、或单独的DHM（图12D）。在戒断48小时之后：图12A通过高架十字迷宫（EPM）测量焦虑。E组在开放臂中花费较短的时间而在封闭臂中花费较长的时间。E+D组在两种臂中花费的时间和载体组相似；图12B显示了通过LORR测量的耐受性。E组显示出显著较短的急性EtOH诱导的LORR的持续时间。E+D组显示在LORR方面与载体组相比没有差异；图12C显示E组增加了PTZ诱导的发作持续时间。E+D组显示与载体组相似的PTZ诱导的发作。在所有三组测定中，D组与载体组相比未显示出差异（n=5-13只大鼠/组）。图12D显示了来自用载体、EtOH、E+D或者DHM管饲的大鼠的海马组织GABAARα4亚基在戒断48小时之后的蛋白质印迹。β肌动蛋白被显示为内参照（loadingcontrol）。图12E显示了来自图12D的实验的总α4亚基蛋白质的定量。EtOH戒断诱导了α4GABAAR亚基的增加，而E+D治疗防止了这种增长。DHM在α4GABAAR亚基蛋白方面未产生变化（n=3只大鼠/组，*，p<0.05，相对于载体治疗，单因素方差分析）。□=载体，■=EtOH，
=EtOH+DHM，
图13显示DHM抑制了在大鼠海马DGC中的EtOH暴露/戒断诱导的GABAAR功能性可塑性。将大鼠分为4组，并且用载体、EtOH（5g/kg，E）、EtOH联合DHM（1mg/Kg，E+D）或DHM（图D）的任何之一管饲。在戒断48小时之后，在海马切片中的DGC上进行膜片钳记录。图A显示了急性EtOH（60mM）增强了载体治疗大鼠中的I强直和mIPSC。图B显示在EtOH/戒断组中，EtOH没有增加I强直但它大大地增强了mIPSC面积。图C显示在E+D组中，EtOH增加了I强直和mIPSC，与载体组中的那些相似。图D显示来自DHM组的I强直和mIPSC对EtOH的反应与载体组中的那些类似。图E和F显示，与在载体组中一样，唑吡坦（ZP，一种苯二氮卓激动剂，0.3μΜ）增强了DHM组中的I强直和mIPSC；但它对EtOH组中的GABAAR电流没有影响。图G显示了EtOH对4组中的I强直影响的总和。图H显示了EtOH对4组中的mIPSC影响的总和。图I显示了唑吡坦在4组中对I强直影响的总和，并且图J显示了在4组中的mIPSC面积的总和（n=4-7只大鼠/组，*，p<0.05，相对于药物0；
p<0.05，相对于载体组，双向RM方差分析）。
图14A-14D显示了DHM增强了预暴露于乙醇的培养的海马神经元中的GABAAR介导的抑制；DHM和EtOH的共同给予防止了体外EtOH诱导的GABAAR的可塑性。与图11A和11B相比较，在培养的海马神经元（DIV13-14）暴露于EtOH（60mM，30分钟）之后，DHM仍然能够浓度依赖性地没有耐受地增强GABAAR介导的I强直（图14A）和mIPSC面积（图14B）两者（n=8-9个神经元/组，*，p<0.05，相对于药物0，单因素方差分析）。图14C显示EtOH和DHM的共同给予防止了EtOH诱导的GABAAR可塑性。在用载体、EtOH、E+D以及DHM治疗之后的24小时后检测的代表性蛋白质印迹显示了在培养的海马神经元中（DIV13-14）的GABAARα4亚基的相对于总表达（tol）的细胞表面表达（sur）。β-肌动蛋白被显示为内参照，并且在细胞表面上未检测到。图14D显示了表面GABAARα4蛋白（载体的%）的定量。将表面信号标准化为对应的β肌动蛋白信号（载体=100%）。EtOH在GABAARα4蛋白的表面表达中诱导了1.5倍的增加，而E+D防止了这种增加（n=5/组，*，p<0.05，相对于载体，单因素方差分析）。
图15A和15B显示通过加入DHM完全防止了在双瓶选择范例中增加的EtOH消耗。图15A显示在暴露于间歇性接触20%EtOH的EtOH/水的组中，EtOH消耗快速增加。DHM（0.05mg/ml）和EtOH（E+D/水）的共同给予消除了这种增加。这些标志是平均EtOH摄入量（g/kg/24小时）±SEM。在4周之后，E/水组被分成两个亚组；一组继续间歇性接触EtOH；而另一组间歇性接触E+D。而E/水组保持着高水平的EtOH消耗，E+D/水组在三个剂量的DHM中显示出在EtOH消耗方面的大大降低，并且到第四个剂量的DHM时在EtOH消耗方面变得相似。注意的是，在水/水组和D/水组之间的溶液消耗没有显著差异（n=6-8只大鼠/组.*，p<0.05，E+D/水组相对于E/水组；
p<0.05，从第5周的E+D/水组相对于第5、6和7周的E/水组；双向RM方差分析，继之为纽曼-科伊尔斯事后检验）。图15B显示了在第5周测量的血浆[EtOH]（n=2-5只大鼠/组，*，p<0.05，相对于EtOH组，学生t-检验）。
发明详细说明
本发明是针对用于治疗、抑制和/或减轻酒精（乙醇，EtOH）中毒、从酒精暴露和酒精滥用戒断的方法和组合物，包括给予二氢杨梅素（DHM）。
DHM可以从枳椇子（Hovenia dulcis））中获得。含有北枳椇提取物以及纯化的DHM的草药疗法被用来改善由酒精以及其他化学品诱导的肝损伤，改善酒后宿醉的症状，以及减轻酒精中毒。参见卡瓦依K（KawaiK）等人（1977），Experientia33(11):1454）；哈泽K（Hase K）等人（1997），Biol Pharm Bull20:381-385）；Yoshikawa等人（1997），YakugakuSasshi117(2):108-118）；Ji Y等人（2001），《中药材》（Zhong Yao Cai）24:126-128）；Ji Y等人（2002），《中药材》（Zhong Yao Cai）25:190-191）；Chen SH等人（2006），《中药材杂志》（Zhongguo Zhong Yao Za Zhi）31:1094-1096）；Liu XL等人（2006），《中药材杂志》（Zhongguo ZhongYao Za Zhi）31:1097-1100）；Fang HL等人（2007），《美国中医药杂志》（Am J Chin Med）35:693-703）；Hussain RA等人（1990），《民族药物学杂志》（J Ethnopharmacol）28(1):103-115）；Yoshikawa K等人（1993），《植物化学》（Phytochemistry）34:1431-1433）；YoshikawaM等人（1996），Chem Pharm Bull(东京)44:1454-1464）；Wang Y等人（1994），《中草药》（China Trad Herbal Drugs）25:306-307）；以及Kim K等人（2000）《韩国医学作物科学杂志》（Korean J Med Crop Sci）8:225-233。
然而，在本发明之前，DHM和/或任何枳椇子提取物是否能够调节由酒精暴露引起的GABAAR可塑性是未知的。事实上，在本发明之前，还没有研究证实DHM和/或任何枳椇子提取物对GABAARS的影响。另外，现有技术研究不一定涉及慢性酒精暴露的情况，这样可以说现有技术研究固有地传授或暗示了给予DHM和/或枳椇子提取物来治疗、抑制和/或逆转由于酒精暴露引起的部分或全部GABAAR可塑性。
除了二氢杨梅素之外，许多种黄酮类，如杨梅树皮素、槲皮素（quercitin）、hovenitin、西伯利亚落叶松黄酮（laricitrin）、芹菜苷元等等，发现于枳椇子和其他植物中（例如，野葛），并且它们的提取物被用于多种病症的草药疗法中。黄酮类相对于酒精暴露的许多有益效果是它们的抗氧化性能的结果。因此，DHM或任何枳椇子的化合物或提取物对由慢性酒精暴露引起的GABAAR可塑性是否有影响或者DHM和枳椇子提取物的有益效果是否仅仅是抗氧化活性的结果是未知的。另外，虽然我们诸位发明人相信一定量的DHM可能会穿过血脑屏障，但这些量是否对GABAARS有影响是未知的，因为许多黄酮类和抗氧化剂对GABAARS没有影响。因此，我们进行了如在此所描述的各种实验。如在此所提供的，该实验显示：
1）DHM（1mg/kg）有效消除了EtOH中毒。因此，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻受试者中的EtOH中毒的方法，包括向对有需要的受试者给予DHM。在一些实施例中，DHM是在暴露于EtOH之前、期间和/或之后给予的。在一些实施例中，DHM是与EtOH一起给予的。例如，DMH被加到一种包含EtOH的组合物（例如一种食品，如饮料）中，然后向受试者给予该组合物。在一些实施例中，EtOH中毒是急性EtOH中毒。
2）DHM改善了EtOH暴露/戒断诱导的行为改变，包括a）对EtOH的耐受性；b）基础焦虑增加；以及c）对PTZ诱导的发作（过度兴奋）的超敏感性。因此，本发明提供了用于治疗由于从EtOH暴露戒断引起的症状的方法，包括向对其有需要的受试者给予DHM。在一些实施例中，DHM是在暴露于EtOH之前、期间和/或之后给予的。在一些实施例中，该症状选自下组，该组以下各项组成：对EtOH的耐受性、基础焦虑增加、以及过度兴奋。
3）DHM防止了受试者中EtOH消费的增加。因此，本发明提供了用于抑制、降低或防止受试者自愿消费更多的EtOH，包括向受试者给予DHM。在一些实施例中，DHM是在EtOH消费之前、期间和/或之后给予的。在一些实施例中，DHM是与将被消费的EtOH一起给予的。例如，DMH被加到一种包含EtOH的组合物（例如一种食品，如饮料）中，然后向受试者给予该组合物。
4）DHM不引起中毒、镇静或麻醉现象。因此，本发明提供了用于治疗、减轻或抑制受试者中的由于暴露于EtOH而引起的警觉性的下降，包括向受试者给予DHM。在一些实施例中，DHM是在暴露于EtOH之前、期间和/或之后给予的。在一些实施例中，DHM是与EtOH一起给予的。例如，DMH被加到一种包含EtOH的组合物（例如一种食品，如饮料）中，然后向受试者给予该组合物。
在此披露的实验还显示：a）DHM的消除作用在体内和在体外被氟马西尼拮抗，并且DHM竞争性地抑制[3H]氟硝西泮结合到GABAARS的苯二氮卓位点；b）DHM拮抗了急性EtOH诱导的GABAARS的增强；c）DHM拮抗了EtOH诱导的在GABAARS对急性EtOH的反应性方面的改变（包括I强直调节的丧失以及增加的mIPSC敏感性）；d）DHM增强了在海马切片和培养的神经元中的GABAARS，并且即使在EtOH暴露/戒断之后仍保持增强GABAARS的功效（诱导对EtOH的耐受性）；以及e）DHM阻断了EtOH暴露/戒断诱导的在大鼠海马中GABAARα4亚基的量的增加。换言之，DHM增强了与EtOH暴露相关的GABAARS的活性，拮抗了EtOH对相应的GABAARS的作用，并且结合到GABAARS的苯二氮卓位点上。如在此所使用的，“增强”表示引起GABAARS活性和/或效力的增加。
出人意料地，在此的实验还显示DHM抑制、降低、以及甚至逆转了由暴露于EtOH引起的GABAARS的可塑性。如在此所使用的，受体的“可塑性”表示该受体的在亚基组成方面的变化。如在此所使用的，关于本发明，“GABAAR可塑性”是指GABAARS的在亚基组成方面的变化。暴露于EtOH引起含有α4βδ亚基的GABAARS将被内化。当α4亚基返回到突触后膜时，δ亚基的位置被改变了，这样δ亚基就不再与α4亚基结合，因此导致了GABAAR的可塑性，与EtOH暴露之前相比α4亚基在突触后膜的增加。如在此所示的，DHM抑制、降低、逆转和/或防止了由暴露于EtOH引起的GABAAR的可塑性。这些结果是出人意料的，因为直到本发明为止，还不存在已知的抑制、降低、逆转和/或防止由EtOH暴露引起的GABAAR可塑性的化合物或组合物。在此的实验结果是尤其是出人意料的，这是鉴于这样的事实，即，其他的与DHM相似的黄酮类（例如大豆甙和槲皮素）未呈现出与DHM相同或相似的活性，即增强GABAARS、拮抗EtOH作用、以及结合GABAARs的苯二氮卓位点。
因此，本发明提供了用于治疗、抑制、降低、逆转和/或防止由暴露于乙醇引起的GABAAR的可塑性的方法，包括向脑组织给予作用于GABAARS的DHM。如在此所使用的，“由EtOH暴露引起的GABAAR可塑性”是指如由以下文献所描述的GABAAR的可塑性：Liang等人（2007），《神经科学杂志》（J Neurosci.）27(45):12367-77）；Zucca S和ValenzuelaCF（2010），《神经科学杂志》30(19):6776-81）；以及Shen等人（2011），《分子药理学》（Mol Pharmacol.）79(3):432-42。在本发明的一些实施例中，给予的DHM的量是有效量。如在此所使用的，DHM的“有效量”是与对照相比导致所希望的效果的量，即治疗、抑制、降低和/或逆转由暴露于乙醇引起的GABAAR可塑性，或增强GABAA受体的活性，或拮抗乙醇对GABAA受体的活性的量。例如，一个逆转由暴露于EtOH（包括慢性间歇性暴露和单剂量暴露）导致的部分或全部GABAAR的可塑性的DHM的有效量是增加具有一种基本上与相应的天然GABAARs相似或相同的组成和/或活性的GABAARS的量。
DHM的“治疗有效量”是这样一个量，当给予受试者时，该量足以治疗、抑制、降低和/或逆转由暴露于EtOH引起的GABAAR的可塑性，或增强GABAAR的活性，或者拮抗在受试者中的乙醇对GABAAR的活性，使得该受试者的病症与该受试者在治疗之前或与对照受试者相比较可观察到改进。同样，如在此所使用的，DHM的“治疗有效量”是这样一个量，当给予受试者时，与对照相比，该量治疗受试者中的给定的临床病症，例如乙醇中毒、戒酒综合征的至少一个症状、酒精使用障碍、或酒精滥用。典型地，DHM的治疗有效量可以每天以大约0.002到大约200mg/kg的剂量口服或静脉给药，优选大约0.1到大约100mg/kg，例如大约是体重的1mg/kg。
通常，0.01到10mg/kg的剂量被分为每天一到四次剂量，或者以持续释放的制剂给予对获得所希望的药理效应是有效的。然而，将被理解的是，对于任何特定的受试者，具体的剂量水平将取决于各种各样的因素，包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径以及排泄率、联合用药以及特定疾病和/或病症的严重性。给药的频率也可以取决于特定的待治疗的疾病和/或病症而变化。还应当理解的是，治疗的有效剂量在特定的治疗过程中可以增加或减少。通过本领域已知的临床技术中的标准诊断测定，剂量的变化可以产生并且变得清楚。在一些情况下可能需要长期给药。DHM的有效量和治疗有效量可以通过本领域已知的常规方法由一位普通技术人员容易地确定。
在一些实施例中，DHM的有效量可以呈一种食品的形式给予，如饮料。在一些实施例中，该饮料含有可以由发酵的谷物（例如，威士忌酒、波本酒、黑麦酒、伏特加酒、杜松子酒和/或啤酒）、发酵的水果（如葡萄酒、白兰地、雪利酒和科涅克白兰地）、甘蔗和/或甜菜（例如朗姆酒）、和/或发酵的龙舌兰头（龙舌兰酒）制成的酒精。在一些实施例中，DHM的有效量可以以一种口香糖组合物的形式给予。
本发明的药物制剂包括分次剂量或单剂量的DHM并且可以制备成单位剂量的形式和/或适于所希望的给药方式的包装。本发明的药物制剂可以针对治疗通过任何适合的途径来给药，包括口服、直肠、经鼻、局部（包括含服和舌下）、皮肤、粘膜、阴道以及肠胃外（包括皮下、肌内、静脉内和皮内）。将被理解的是，优选的途径将随着接受者的病症和年龄、将被治疗的病症的性质而变化。例如，在一些实施例中，可以以透皮贴剂或泡腾片（例如，一种包含有效量的DHM、一种碳酸盐如碳酸氢钠、一种酸性物质如柠檬酸的片剂，当被溶解于一种液体如水中时导致泡腾）的形式向受试者给予治疗有效量的DHM。
在一些实施例中，对于人类受试者的DHM的单位剂量是大约50-70mg。因此，在一些实施例中，根据本发明的食品、透皮贴剂、口香糖和/或泡腾片包含大约50-70mg的单位剂量。
实验
动物和材料
实验动物管理与使用委员会批准了所有的动物实验。雄性和雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠（250-300g）在动物饲养所中在12小时的光照/黑暗周期下养殖，并且可以随意接近食物和水。
二氢杨梅素（DHM，(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-2,3-二氢苯并吡喃-4-酮)）购自中国上海的ZR化学公司（ZR Chemical）（CAS号27200-12-0，通过HPLC纯化为98%）。氟马西尼、印防己毒素以及荷包牡丹碱购自西格玛公司（Sigma）。
统计分析
如所指示的，数据来自神经元培养物和/或大鼠的至少三种独立的制剂。使用Sigmaplot（Windows版本10.1）和SigmaStat（Windows版本3.5）来进行数据显示和统计分析。数据表示为平均值±SEM。通过基于邓尼特（Dunnett）或纽曼-科伊尔斯（Newman-Keuls）事后对比分析的单因素或双因素重复测量（RM）方差分析、以及学生t-检验来确定在治疗组与载体组之间的显著性差异。
DHM阻断急性EtOH中毒并且防止EtOH戒断症状
在大鼠中进行的代谢研究表明，没有由DHM（口服给药，1mg/kg）给药诱导的代谢变化（对于食物和水的摄取、尿量和粪便量）（数据未显示）。
使用本领域已知的标准LORR测定来检验DHM对大鼠中EtOH诱导的LORR的影响。参见Kakihana R等人（1966），《科学》（Science）154(756):1574-1575）。简言之，在药物注射之后，将大鼠以仰卧位置于一个V形支架中。从药物注射（腹膜内注射）的终点获得LORR起始时间。当动物可以在30秒内翻转三次时，LORR持续时间结束。盲法进行LORR测定。LORR持续时间以平均（min）±SEM的形式报告。
在对照组中，EtOH（3g/kg，腹膜内注射）诱导了72±2分钟的LORR（用盐水预治疗，20mL/kg，在EtOH注射之前30分钟腹膜内注射）。用DHM（1mg/kg，在EtOH注射30分钟之前腹膜内注射）预治疗，EtOH诱导的LORR被降到了8±4LORR（对照的10.6±5.9%，图1A，p<0.05）。在EtOH（3mg/kg，腹膜内注射）给予30分钟之后用DHM（1mg/kg，腹膜内注射）治疗引起LORR从79±2下降到49±2（图1B）。具体地说，从DHM注射开始（在图1B中的红色虚线），LORR持续时间从51±2分钟被减少到21±2分钟（对照组的41.2±3.8%，p<0.05）。EtOH（3mg/kg，腹膜内注射）和DHM（1mg/kg，腹膜内注射）的共同给予将EtOH诱导的LORR持续时间显著地减少到0.7±0.4分钟（对照的1.2±0.6%，图1C，p<0.05）。单独的DHM不诱导LORR（图1C）。这些结果表明当在给予EtOH之前、期间和/或之后给予DHM时，DHM拮抗了急性EtOH中毒。
检验了DHM对单剂量EtOH中毒和戒断的影响。用盐水（20ml/kg，载体）、EtOH（3g/kg）、EtOH+DHM（注射EtOH之后30分钟，1mg/kg）、或单独的DHM（1mg/kg）腹膜内注射大鼠。在48小时的戒断时期之后，进行EtOH诱导的LORR测定（EtOH，3g/kg，腹膜内注射）。通过单剂量EtOH中毒/戒断显著减少了LORR持续时间，即9±3分钟（相对于58±5分钟（载体））。这表明EtOH戒断诱导了EtOH耐受性。用EtOH进行的DHM后治疗显著地抑制、减轻和/或防止了由于EtOH戒断产生的LORR持续时间的降低（图1D，p<0.05）。LORR持续时间（min）:分别为EtOH+DHM61±4和DHM61±4。这表明DHM抑制、降低和/或防止了EtOH戒断诱导的EtOH耐受性。
还测量了大鼠中戊四氮（PTZ）诱导的发作。在距离载体（盐水，20ml/kg，腹膜内注射）、EtOH（3g/kg，腹膜内注射）、DHM+EtOH（1mg/kg+3g/kg，腹膜内注射）或者DHM（1mg/kg，腹膜内注射）治疗的戒断24小时之后，检测到大鼠PTZ诱导的发作。在本研究中使用的PTZ剂量（在盐水中，42mg/kg）被确定为诱导75%初次接受试验的大鼠的发作的剂量。简言之，在PTZ的腹膜内注射之后，如先前描述测定了开始的时间和强直阵挛发作的持续时间。进行动物行为实验的研究者对治疗组是不知情的。对于任何测定，这些动物只使用一次。
EtOH戒断将PTZ发作持续时间从1.7±0.8分钟（载体）显著地增加到8.1±1.2分钟（图1E，p<0.05）。这表明EtOH戒断增加了发作的易感性。DHM和EtOH的共同给予显著地消除、减少、和/或抑制了PTZ发作持续时间的增加（减少到0.9±0.2分钟）。单独用DHM预治疗没有诱导发作持续时间的任何显著的或可观察的变化。DHM也显著地消除、减少、和/或抑制了发作持续时间的增加（图1F）。与载体组（85%）相比，EtOH戒断将发作发生率增加至100%，而DHM抑制、降低和/或防止了这种增长（85%）。这些结果表明DHM改善了EtOH戒断诱导的发作易感性和过度兴奋的增加。
这些发现表明DHM有效地抑制、减轻、和/或防止了急性EtOH中毒、EtOH暴露/戒断诱导的EtOH耐受性、以及EtOH戒断诱导的过度兴奋。
DHM防止了单剂量EtOH中毒诱导的GABAAR可塑性
为了确定DHM是否防止了EtOH中毒诱导的对急性EtOH的GABAAR敏感性的改变，用来自在戒断48小时的大鼠海马切片中的齿状回颗粒细胞（DGC）的全细胞膜片钳记录检验了DHM对EtOH戒断诱导的GABAAR功能性改变的影响。
用振动切片机（VT100，国际技术产品公司，圣路易斯，密苏里州（VT100,Technical Products International,St.Louis,MO））以及本领域已知的标准技术获得背侧海马的横切片（400μm）。用人工脑脊液（ACSF）连续灌注这些切片。参见Liang J等人（2007），《神经科学杂志》（JNeurophysiol）27:12367-12377）。
在用人工脑脊液（ACSF，125mM NaCl、2.5mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、26mM NaHCO3、以及10mM D-葡萄糖）灌注的过程中，在34°C±0.5°C下从位于在-70mV的保持电位的DG层的细胞获得全细胞膜片钳记录。用95%的O2-5%CO2使ACSF连续鼓泡以确保薄片的充分氧合和7.4的pH。从具有7.5ΜΩ-9ΜΩ的电阻的薄壁硼硅酸盐玻璃移液管中拉出贴片电极，并用移液管溶液充满（即，137mM CsCl、2mMMgCl2、1mM CaCl2、11mM EGTA、10mM HEPES和3mM ATP，用CsOH调节pH至7.30）。用Axopatch700B放大器（分子仪器，森尼韦尔，（Sunnyvale），CA）以电压钳模式记录信号。在电气补偿大约70%之前全细胞接入电阻在<25ΜΩ的范围内。在电压钳记录过程中，通过测量响应于5mV单步命令的的电容瞬态大小来监测接入电阻，并且如果遇到>20%的变化就弃去数据。在开始mIPSC记录之前，允许用胞内环境平衡移液器溶液至少10分钟。将胞内信号在3kHz下低通滤波，并且用Digidata1440A和软件CLAMPEX10（分子仪器）在20kHz的采样频率下采集数据。
如前所述，记录药理学分离的GABAAR介导的mIPSC（（Liang(2007)）和（Shen(2011)））。对于GABA浓度反应曲线，使用Valvelink8.02快速交换灌注系统（AutoMate Scientific公司，美国）通过可移除的移液管尖在将GABA、DHM、或地西泮急性施用到神经元上的过程中记录激发的GABAAR电流。使用Clampfit（版本9.0，分子仪器，（Version9.0,Molecular Devices））和MiniAnalysis Program（版本6.0.7，Synaptosoft，德卡特（Decatur），GA）分析数据。
使用MiniAnalysis program（Synaptosoft，德卡特，GA）来分析mIPSC。I强直为一个给定的记录时间段的平均基线电流。将I强直幅值计算为在给予印防己毒素（100μΜ）或荷包牡丹碱（10μΜ）之前和之后测量的保持电流之间的差异。参见Wei等人（2004），《神经科学杂志》（J Neurosci）24,8379-8382）；Liang（2007）和Shen（2011）。简言之，将这些记录在2kHz离线低通滤波（Clampfit软件）。用8pA幅值和20pA*ms电荷转移的阈值标准检测mIPSC（Mini Analysis Program，版本6.0.7）。在给定的100秒记录时期中从所有自动检测事件中确定mIPSC的频率。对于动力学分析，在这些记录跟踪的目测过程中只选择具有稳定基线、急剧上升期（10%到90%的上升时间）、以及指数式衰减的单事件mIPSC。排除掉双峰和多峰的mIPSC。在每个实验条件下，记录至少100个单独的mIPSC事件。在每个单元中，根据与半上升时间对齐的平均选择单事件的分析获得mIPSC动力学。通过将双指数与该平均的mIPSC的下降期的拟合而获得衰减时间常数。从一个给定的记录时间段的平均基线电流获得I强直大小。将I强直幅值计算为在施用印防己毒素（50μΜ）或荷包牡丹碱（10μΜ）之前和之后测量的保持电流之间的差异。参见Liang等人（2007）；Shen（2011）；Hamann（2002）；以及Mangan PS等人（2005），《分子药理学》（Mol Pharmacol）67(3):775-788）。进行这些记录和mIPSC分析的研究者对于大鼠接受的治疗（载体、EtOH、E+D、或D）是不知情的。
来自EtOH治疗的大鼠的神经元的记录揭示，通过急性EtOH施用（60mM），I强直增强丧失（图13A、图3B、图13G）（I强直从14.0±2.1到14.3±2.8pA，相对于载体：28.2±4.5到62.1±3.0pA；图2A p<0.05），并且mIPSC的EtOH易感性增加（增加58.5%±20.0%，相对于载体对照：16.9%±4.1%（图13H，图2B，p<0.05）。相比之下，来自EtOH+DHM治疗的大鼠的神经元的记录展现出对急性EtOH的反应性，该反应性与载体组的不能区别（图13C）（I强直从27.9±3.0增加到61.3±2.3pA，mIPSC增加了18.0%±5.9%，图13G、图13H、图2A、图2B）。
检验了来自大鼠海马的平行蛋白质印迹来确定EtOH是否诱导GABAARα4亚基的总蛋白的变化。将来自大鼠的海马组织溶解在RIPA缓冲液中，该RIPA缓冲液含有1%Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、50mM Na3PO4、150mM的NaCl、2mM的EDTA、50mM的NaF、10mM焦磷酸钠、1mM原钒酸钠、1mM苯甲磺酰氟（PMSF）以及完全蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。将溶解产物离心15分钟（14,000xg，4°C），并收集上清液用于蛋白质印迹分析。使用兔抗GABAARα4（aa379-421）和鼠抗-P肌动蛋白（西格玛公司）以及随后的HRP结合的第二抗体来进行蛋白质印迹。使用ECL检测试剂盒（Amersham）来检测条带，并且使用ImageQuant5.2（分子动力学）通过光密度测量进行分析。用含有62.5mM Tris-HCl、100mMβ-巯基乙醇以及2%SDS的缓冲液（pH6.7）来剥离这些条带，并重测（reprobe）数次。根据制造说明书用BCA蛋白分析试剂盒（Pierce）来测定蛋白浓度。
图12D中显示了来自用载体、EtOH、E+D或者DHM管饲的大鼠的海马组织GABAARα4亚基在戒断48小时之后的蛋白质印迹。EtOH暴露/戒断诱导了α4GABAAR亚基的增加，而E+D治疗防止了这种增长。单独的DHM对α4GABAAR亚基不产生变化（图12D）。图12E显示了来自图12D的实验的总α4亚基蛋白质的定量。这些结果显示，DHM与EtOH的治疗可以抑制、降低和/或防止全部或部分EtOH戒断诱导的GABAAR可塑性。因此，本发明提供了治疗、抑制、降低和/或防止受试者中的EtOH暴露/戒断诱导的GABAAR的可塑性的方法，包括向受试者给予DHM。
DHM增强了GABAAR介导的电流，并且在初次接受试验的大鼠DGC中通过急性EtOH拮抗它们的增强
如上所述，为了确定DHM的抗酒精作用是否是由于它与GABAARS的相互作用（GABAARS代表了酒精作用的主要靶标），检验了急性DHM对来自初次接受试验的大鼠的海马切片中的DGC的GABAAR功能的影响。急性DHM（0.3μΜ）以一种浓度依赖性方式将GABAAR介导的I强 直从17.5±4.9增加到29.0±6.7pA，延长了mIPSC衰减时间，并且增强了mIPSC在DGC中的总电荷转移（面积）（面积从571±61增加到615±22fC）（图3，图a、a-1和a-2）。
当分开施用时，EtOH和DHM两者都增强了GABAAR介导的电流。然而，在EtOH存在的情况下，DHM浓度依赖性地降低了EtOH诱导的I强直增强（通过1μΜ的DHM，从43.8±1.8降低到32.0±2.0pA，图3，图b和b-1，p<0.05）。然而，当在DHM存在的情况下施用EtOH时，I强直没有进一步的增强（通过60mM EtOH，从41.1±2.2到44.4±3.6pA，图3，图c和c-1）。
这些数据表明DHM通过干扰EtOH诱导的GABAARS的增强而拮抗EtOH中毒诱导的GABAAR可塑性。因此，本发明提供了通过共同给予DHM和EtOH来拮抗EtOH诱导的GABAAR可塑性的方法。因此，本发明还提供了通过在暴露于EtOH之前给予DHM来拮抗EtOH诱导的GABAAR可塑性的方法。在一些实施例中，本发明提供了用于增强GABAAR介导的电流的方法，包括给予DHM。
DHM和ETOH的共同给予防止在原代培养的海马神经元中的EtOH中毒诱导的GABAAR可塑性
为了确定DHM是否抑制、和/或防止在体外培养的神经元中的由EtOH诱导的GABAAR可塑性，进行了以下实验。
通过木瓜蛋白酶分解（沃辛顿生化（Worthington Biochemical），莱克伍德（Lakewood），新泽西（NJ））从18天胎龄大鼠制备海马神经元，并且在神经干细胞培养基和B27添加物（英杰公司（Invitrogen））中培养。如前所述，将培养物在37°C下在一个5%CO2加湿培养箱中保持。参见Shen等人（2011），《分子药理学》（Mol Pharmacol）79:432-442）。
如前所述，通过木瓜蛋白酶分解（沃辛顿生化（WorthingtonBiochemical），莱克伍德（Lakewood），新泽西（NJ））从18天胎龄SD大鼠制备海马神经元，并且在神经干细胞培养基和B27添加物（英杰公司（Invitrogen））中培养。参见Stowell JN和Craig AM（1999），《神经元》（Neuron）22(3):525-536）。简言之，从用异氟烷麻醉并用断头术实施安乐死的孕鼠中取出胚胎。切开海马并放到不含Ca2+和Mg2+的HEPES缓冲的Hank氏缓冲盐溶液（pH7.45）中。通过木瓜蛋白酶消化来解离组织，随后通过一个巴斯德吸管和木瓜蛋白酶抑制剂处理将其研磨。使细胞沉淀并且再悬浮于含有2%B27添加物（不含血清）、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.5mM谷氨酰胺（均来自英杰公司）、以及10μΜ谷氨酸盐（西格玛公司）的神经干细胞培养基中。
然后将解离后的神经元以0.3×105细胞/cm2的密度铺板于24孔板的12mm的圆形盖玻片上（用于膜片钳记录）和/或以0.5×105细胞/cm2的密度铺板于用多聚-D-赖氨酸（西格玛公司，50μg/ml）包被的6孔板上（用于蛋白质印迹和生物素酰化分析）。将培养物在37°C下在一个5%CO2加湿培养箱中保持。此后，用含有2%B27添加物以及0.5mM谷氨酰胺的神经干细胞培养基每周更换两次三分之一到一半的培养基。
在DIV13-14神经元之后（体外培养13-14天），培养的神经元的一半培养基用含有120mM EtOH（EtOH终浓度为60mM）、0.2μΜDHM加上120mM EtOH、或只有0.2μΜDHM（DHM对照，即没有EtOH）的神经干细胞培养基更换，持续30分钟，然后分别用一半新鲜的神经干细胞培养基加上一半初始培养基更换所有的培养基。对照神经元用用相应的载体治疗，如EtOH治疗的神经元一样的程序。鉴于之前的实验，选择60mM EtOH的浓度。参见Liang J等人（2007）。具体地说，60mMEtOH的浓度被选择用来处理培养的神经元，以便匹配在用5g/kg的管饲中毒之后的成年大鼠中测量的血液水平，产生了持续大约2-3小时的60mM血浆峰值[EtOH]，并且诱导了显著的GABAARS可塑性和耐受性。
将DIV14神经元（体外培养14天）用载体、EtOH、EtOH+DHM或单独的DHM处理，随后戒断24小时。然后，在电生理记录之前立刻将生长在盖玻片上的细胞转移到一个灌注室中（华纳仪器（WarnerInstruments）），然后用一个倒置显微镜（TE200，尼康（Nikon））观察。在-70mV的保持电位、在室温（22°C-25°C）下在电压钳模式下从培养的神经元获得全细胞膜片钳记录。用一种细胞外溶液（137mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM葡萄糖以及10mM HEPES（310-320渗透压克分子（Osm），用NaOH调节pH至7.40））灌注细胞。用与切片记录中一样的内标溶液充满玻璃移液管，输入电阻为4-7ΜΩ。使用如上提及的同样的药理学方法记录GABAAR介导的mIPSC。对于GABA浓度反应曲线，通过一个位于在神经元的胞体附近的可移除尖端用一种Valvelink8.02快速交换灌注系统（AutoMate Scientific，美国），通过将GABA和/或DHM急性施用到培养的神经元上来记录激发的GABAAR介导的电流。使用Multiclamp200B放大器（分子仪器，美国）来放大电信号。在建立全细胞配置之后，在施用药物之前至少允许经过10分钟，以允许膜片稳定并且允许在记录电极与细胞质之间发生离子交换。用pClamp软件（版本10.0，分子仪器，美国）获取数据，在20kHz下数字化（Digidata1440A，分子仪器），并且使用Clampfit软件（版本10.0，分子仪器）以及Mini Analysis程序（版本6.0.7，Synaptosoft，德卡特，GA）使用本领域已知的方法进行分析。参见Hamann M等人（2002），《神经元》（Neuron）33(4):625-633）；Stell BM和Mody I（2002）《神经科学杂志》（J Neurosci）22(10):RC223）；以及Liang（2007）。
如先前报道的，EtOH暴露/戒断神经元在I强直幅值上显示出急剧降低（从在载体神经元中的13.8±1.4pA到EtOH神经元中的5.6±1.0pA），并且在对急性EtOH的反应性上急剧降低（EtOH增强从载体神经元中的109.6±15.7%降到EtOH神经元中的14.3±18.9%，图4A，p<0.05）；而EtOH暴露/戒断神经元产生增加的针对EtOH神经元中的急性EtOH的mIPSC反应性（EtOH增强从载体神经元中的3.0±10.0%增加到33.7±14.9%），图4B，p<0.05）。参见Shen（2010）。DHM和EtOH的共同给予拮抗了在GABAARS中的这些作用（平均I强直幅值为11.2±0.6pA，通过EtOH增加到25.2±1.2pA，并且通过EtOH的mIPSC增强为8.3±9.4%）；单独的DHM暴露/戒断不改变GABAAR功能（图4A和4B）。
如在此描述的，对培养的神经元进行蛋白质印迹和检验。如前所述进行了培养的神经元的GABAARS的生物素酰化分析。参见Chung WO等人（2000），《感染免疫学》（Infect Immun）68(12):6758-6762）。Briefly,the neurons in culture dishes were placed on ice and washed twice with icecold PBS.<}0{>简言之，将培养皿中的这些神经元置于冰上并且用冰冷PBS洗涤二次。然后将这些神经元在冰上用含有1mg/ml磺基-NHS-LC-生物素（ProteoChem）的PBS孵育30min。在用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）猝灭生物素反应之后，在150μl改良的RIPA缓冲液（20mMTris-HCl（pH7.5）、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1%NP-40、1%脱氧胆酸钠、2.5mM焦磷酸钠、1mM b-甘油酸磷酯、1mMNa3VO4中以及1μg/ml亮抑蛋白酶肽）中溶解这些神经元。将匀浆离心15分钟（14,000x g，4°C）。移出上清液的等分部分（10%）来测量β-肌动蛋白。剩余的上清液在60μl的50%中性亲和素琼脂糖（Pierce化学公司）中在4°C下孵育4小时，然后用溶解缓冲液洗涤四次。将结合琼脂糖的蛋白溶于20μl SDS样品缓冲液中并煮沸。如以上提及的，进行蛋白质印迹。
来自蛋白质印迹和生物素酰化的数据显示，DHM消除或逆转了EtOH暴露/戒断诱导的在培养的神经元的细胞表面GABAARα4亚基方面的改变（图14C）。这些发现证明，DHM和EtOH的共同给予可以抑制、降低和/或阻止体外EtOH诱导的GABAAR可塑性，由此证实了如在此所披露的在大鼠体内的发现。
DHM增强对照神经元和EtOH暴露/戒断神经元两者中的GABAAR功能
还检验了DHM对培养的海马神经元的作用。在培养的神经元中建立了DHM对GABAAR介导的I强直（图5A，空心圆，EC50=大约0.2μΜ）和mIPSC（图5B，空心圆，EC50=大约0.3μΜ）的浓度反应曲线。为了确定EtOH暴露是否改变了GABAAR对DHM的反应性，也建立了在具有EtOH暴露/戒断的神经元中的DHM浓度反应曲线。EtOH暴露对DHM与I强直（图5A，空心圆，EC50=大约0.3μΜ）或mIPSC（图5B，空心圆，EC50=大约0.5μΜ）的浓度反应关系没有影响。这些结果表明，即使在EtOH暴露/戒断的条件下，DHM增强了突触和突触外的GABAARS，表明DHM不产生对EtOH的交叉耐受性。
为了阐明DHM对GABAARS的直接作用，将GABA（1-300μΜ）吹到培养的海马神经元上并建立浓度反应曲线。在相同的GABA浓度下，DHM（0.3和1μΜ）与GABA的共同施用增加了GABA激活的电流的幅值，产生了GABA浓度反应曲线的左移（图5C和5D）。这些结果表明DHM直接增强了GABAARS。
DHM拮抗EtOH中毒而这些DHM作用被氟马西尼拮抗
如下所述进行了进一步的LORR测定。将大鼠分为4个组，并且用盐水、EtOH（3g/kg，E）、EtOH联合DHM（1mg/kg，E+D1）、或DHM（D1）腹腔内注射。EtOH诱导了69±18LORR。E+D1将LORR减少到2.7±1.4（图6A）。和盐水一样，DHM没有诱导LORR。这些结果表明DHM消除了急性EtOH中毒。
还进行了另外的预治疗和后治疗实验。在注射EtOH（Dl+E）之前30分钟，DHM将LORR减少到8.2±4.1（图6B）。在诱导了LORR的EtOH注射之后30分钟，LORR在注射盐水的大鼠中持续另外的42±9.1；而DHM注射将剩余的LORR减少到19±1.0（E+盐水的42%，图6B）。这些结果表明DHM消除了急性EtOH中毒。因此，即使在EtOH暴露之前30分钟或暴露之后30分钟给予，DHM有效地改善了中等到高剂量EtOH中毒。
为了检验DHM的抗EtOH作用的靶标，测试了氟马西尼，一种调节GABAARs的选择性苯二氮卓类拮抗剂。参见Hunkeler,W.等人（1981），《自然》（Nature）290:514-516。EtOH诱导了69±11.3LORR；DHM（3mg/kg）和EtOH的共同注射将LORR减少到2.7±1.7（图6C）。氟马西尼（10mg/kg）逆转了DHM在LORR方面的减少（56.1±4.6）。将DHM剂量增加到10mg/kg降低了氟马西尼的作用（29.3±4.8），而将氟马西尼的剂量增加到30mg/kg增加了它的DHM作用的拮抗作用（58.2±3.9）。与EtOH组（71.1±4.8，图6C）相比，氟马西尼和EtOH共同注射没有改变LORR。这些结果表明，GABAARs在体外EtOH诱导的LORR的行为效应中起主要作用。氟马西尼竞争性地拮抗DHM对EtOH诱导的LORR的作用。另外，这些结果表明，DHM和EtOH的相互作用涉及DHM在GABAAR苯二氮卓位点的作用，这可能成为DHM对EtOH中毒的疗效的基础。
检验了高剂量的DHM（高于其对EtOH中毒具有拮抗作用的剂量的数百倍）。DHM（100mg/kg和300mg/kg）分别仅仅诱导0.9±0.8和4.0±2.8的LORR（图7）。这表明DHM不仅仅是典型的苯二氮卓类。高剂量的氟马西尼（200mg/kg）不诱导LORR（图7）。
在LORR测定的过程中，在从5分钟-180分钟的不同的点处取静脉血样品来测量来自EtOH组和EtOH+DHM组的血浆EtOH浓度（血浆[EtOH]）。收集在EtOH或E+D腹膜内注射后的不同时间点（0、5、30、60、90、180分钟）来自大鼠尾静脉的血液样品，或来自在自愿酒精双瓶选择范例（EtOH和EtOH+DHM组）之后的大鼠的血液样品用于血浆[EtOH]测定。参见Liang（2007）。将大鼠放到一个约束管中，并且在大约40°C下它的尾巴是温暖的。用锋利的刀片穿刺在尾尖处的尾静脉。将大约0.2mL静脉血滴入一个含有肝素锂（拉姆科学公司（Ram ScientificInc），杨克斯（Yonkers），纽约（NY））的毛细血液收集管。血液样品在2500rpm下离心15分钟。收集上清液并且在-80°C下储存直至测定。用EtOH标准品，使用醇氧化酶反应程序，一式两份地测量每个血液样品的EtOH含量（GM7Micro-Stat；安纳劳科斯仪器公司（AnaloxInstruments），卢嫩堡（Lunenberg），加拿大）。
EtOH在5分钟之内诱导了LORR的开始。血浆[EtOH]快速增加持续5分钟，随后缓慢增加到大约60分钟，然后[EtOH]逐渐下降。在E+D1和E+D10（DHM1，10mg/kg）组，血浆[EtOH]的上升时间在早期减慢（图8）。然而，从30分钟到60分钟，血浆[EtOH]在EtOH组与E+D1组之间没有显示出统计显著性差异（30分钟：EtOH相对于E+D1=334.9±37.8相对于287.7±21.5mg/dl；以及60分钟：EtOH相对于E+D1=353.7±35.4相对于326.27±17.8mg/dl），而E+D10组在该期间显著降低了[EtOH]（30分钟为250.6±12.2并且60分钟为306.0±7.6mg/dl，图8）。在30分钟到60分钟的过程中，EtOH组在睡眠而E+D1组和E+D10组处于清醒状态。这些结果表明，DHM影响EtOH药物代谢动力学，但是这种作用不足以解释DHM对EtOH诱导的LORR的阻断。
DHM拮抗EtOH诱导的GABAAR增强，并且这种作用被氟马西尼阻断
如上述进行的，进行了在来自体外海马切片的齿状回颗粒细胞（DGCs）中的全细胞膜片钳记录。EtOH（60mΜ）的浴应用将I强直从22.0±0.7增加到46.9±1.4pA，并且将mIPSC从0.53±0.02提高到0.64±0.02nC（图9，图A-C）。DHM(0.3和1.0μΜ)浓度依赖性地拮抗了这些EtOH效应。
然后如在此所提供的，测试了氟马西尼对DHM的抗EtOH作用的影响。DHM（3μΜ）将EtOH增强的I强直从44.8±2.3降低到21.0±0.9pA并且将mIPSCs从0.78±0.01降低到0.70±0.02nC，而氟马西尼（10μΜ）逆转了这种DHM作用（将I强直逆转到37.3±1.6pA，并且将mIPSCs逆转到0.78±0.01nC，图9，图D-F）。这些数据表明，DHM拮抗了EtOH诱导的突触外和突触GABAARs两者的增强，并且该作用被氟马西尼阻断。这些数据与行为实验观察的结果是一致的（图6C），表明DHM和EtOH对GABAAR苯二氮卓位点的相互作用是成为DHM对EtOH中毒的疗效的基础的细胞机制。
DHM是GABAARS在苯二氮卓位点处的正向调节剂
DHM（0.1到30μΜ）对GABAAR介导的海马切片中的DGC的mIPSC的影响。DHM（1μΜ）浓度依赖性地（从0.1到30μΜ）增强了I强直（从22.5±2.5到44.0±4.1pA）并且增大了mIPSC面积（从0.59±0.01到0.72±0.03nC，图10，图A-C）。这些结果表明，DHM增强了CNS神经元中的GABAAR功能。
为了进一步检验DHM的位点对GABAARS的作用，测定了氟马西尼对在DIV13-14（DIV：体外培养天数）的培养的海马神经元中的DHM增强的GABAAR功能的影响。DHM（1μΜ）增强了I强直（对照组的194.9%±13.6%）和mIPSC面积（对照组的181.8%±9.2%，图10，图D-F）。氟马西尼以一种浓度依赖的方式抑制了DHM增强的GABAAR电流（10μΜ的氟马西尼将I强直降低到143.0%±3.2%并且将mIPSC降低到125.7%±3.9%，图10，图D-F）。这些观察结果表明，DHM作用于GABAARS上与苯二氮卓一样的位点上来增强GABAAR功能。
使用结合在来自初次接受试验的成年大鼠的皮质膜匀浆中的[3H]氟硝西泮，检验了DHM（0.03-100μΜ）对苯二氮卓位点的作用。如前所述的，用离心和清洗的速度和次数以及缓冲液组成的改良来进行制备用于放射性配体结合试验的大鼠皮质膜的标准程序。参见Li GD等人（2010），《生物化学杂志》（J Biol Chem）285:8615-8620。从脑分离初次接受试验的大鼠皮质并在0.32M蔗糖、10mM HEPES缓冲液（pH7.4）中均质化，并且在650x g4°C下离心。将随后的上清液在150,000xg下离心来收集含有所希望的膜的沉淀。该沉淀被洗涤和离心两次以上，第一次使用冰冷的水，第二次施用含有50mM KH2PO4、1mM EDTA、2mM苯甲脒HCl、0.5mM DTT、0.1mM苯乙铵HCl、0.01%杆菌肽、0.2PMSF（pH7.4）的膜缓冲液，然后将产生的沉淀冻干。在结合测定的当天，在含有50mM KH2PO4、1mM EDTA、200mM KC1（pH7.4）的测定缓冲液中将沉淀均质化并且离心，然后在新鲜的测定缓冲液中再悬浮，直至蛋白终浓度为1mg/ml。将[3H]氟硝西泮（85.2Ci/mmol，珀金埃尔默（PerkinElmer），波士顿（Boston），MA）、脑匀浆、以及DHM合并至0.5ml的测定终体积，在冰上孵育，并且用Brandel细胞收集器M-24R（Brandel公司，马里兰州盖瑟斯堡（Gaithersburg MD））过滤。在贝克曼（Beckman）LS-3801液体闪烁计数器中进行样品计数。特异性结合被定义为总的结合量（没有未标记的配体）减去在10μΜ终浓度的氟西泮（西格玛公司）存在下的结合。用GraphPad Prism4.0软件（圣地亚哥，加利福尼亚）分析数据，以便确定IC50（一个位点竞争方程）和希尔斜率（Hill slope）（S型剂量反应方程）。实验一式三份地进行。
观察到DHM对[3H]氟硝西泮结合的显著抑制，以一种浓度依赖性的方式从0.3μΜ开始，其中IC50为4.36μΜ，并且希尔斜率为-0.73（图10，图G）。这些数据表明，DHM直接抑制了[3H]氟硝西泮结合到GABAARS（显然是竞争性的），表明DHM很可能作用在GABAAR苯二氮卓位点。
还检验了DHM对在培养的海马神经元中的GABAAR介导的电流的影响。DHM浓度依赖性地增强了I强直（0.3μΜ的DHM将I强直从9.5±1.5增加到21.0±2.3pA，EC50大约为0.20μΜ）并且增加了mIPSC（1μΜ的DHM将mIPSC增加到对照组的128.2%±8.3%，EC50大约为0.20μΜ；对高于1μΜ的DHM的反应轻微下降，图11A和11B）。
检验了DHM在DIV14的培养的神经元中对由10μΜ和300μΜ的GABA的局灶胀泡诱导的GABAAR电流的影响。DHM（0.3和1μΜ）与GABA的共同施用增加了GABA电流的幅值，并且产生了GABA浓度反应曲线的左移（图11C和11D）。这些结果表明，DHM直接作用在GABAARS并且强有力地增强了突触和突触外GABAARS。
DHM防止EtOH戒断症状并且防止EtOH暴露/戒断诱导的在大鼠海马中的GABAAR可塑性
检验了DHM对大鼠中的EtOH戒断症状的影响。将大鼠分为4个组，并且分别用载体、EtOH（5g/kg，E）、EtOH联合DHM（1mg/kg，E+D）或者DHM管饲。在注射48小时之后，将大鼠再细分为3个组来测量EtOH戒断的征象。
在高架十字迷宫上测量与EtOH戒断相关的在EtOH戒断大鼠中的焦虑和运动/共济失调（EPM，图12A）。以分钟度量花费的时间。如先前所述构建了十字迷宫并且将测量结果平分。参见Liang等人（2004），《药理学与实验治疗学杂志》（J Pharmacol Exp Ther）310:1234-1245）。简言之，使迷宫高于地面1m，并且包含四个成直角地安排的长51cm、宽11.5cm的臂。封闭臂具有延伸该臂的长度的30cm高的不透明的壁。在实验的时候，将每个动物放到该迷宫的中心，面对一个开放臂并且允许探索5分钟的时间。在这期间，将该动物的行为（例如，进入臂的次数以及每次进入臂花费的时间）记录在摄像机上。
属于载体组的受试者在开放臂中花费2.71±0.71并且在封闭臂中花费1.80±0.67。属于EtOH组的受试者在开放臂中花费的时间（0.88±0.32）明显短于载体组，并且在封闭臂中花费的时间（3.64±0.27）长于载体组；而属于EtOH+DHM（E+D）组的受试者花费相似的时间（开放臂：2.68±0.77以及封闭臂：1.88±0.79）。DHM对大鼠在任意的臂中花费的时间没有影响（开放臂：2.92±0.70以及封闭臂：1.52±0.56）。这些数据表明：（1）EtOH暴露/戒断产生了焦虑；（2）DHM联合EtOH抑制、减轻和/或阻止了EtOH诱导的焦虑；以及（3）DHM不影响焦虑水平。
对EtOH的耐受性用急性EtOH诱导的LORR来度量（以分钟计，图12B）。与在EtOH组受试者中诱导的10.8±3.8LORR相比，EtOH在载体组受试者中诱导了63.6±7.0LORR。EtOH在EtOH+DHM组受试者中诱导了61.0±3.8LORR，并且在DHM组受试者中诱导了65.6±8.4LORR。这些结果表明，单次暴露于EtOH产生了对EtOH的耐受性，并且DHM抑制、减轻和/或防止了这种EtOH暴露/戒断诱导的对EtOH的耐受性。
如在此所述的，用PTZ诱导的发作持续时间来量度过度兴奋（图12C）。PTZ在载体组的受试者中诱导了0.9±0.2分钟的发作，并且在EtOH的受试者中诱导了6.5±1.1分钟的发作。在EtOH+DHM组中发作持续时间减少到最低（1.7±0.8分钟）。在DHM组中PTZ诱导的发作与载体组相似（0.6±0.4分钟）。这些结果表明，EtOH暴露/戒断增加了发作的易感性（兴奋过度）并且DHM改善了EtOH的这些影响。
测定了在上述4组治疗48小时之后的海马中的GABAARα4亚基的总蛋白含量。蛋白质印迹表明，与载体组相比，EtOH暴露将总α4蛋白水平增加到84.0±26.0%。在EtOH+DHM组中，总α4蛋白水平没有增加（对照组的93.0±21.0%）。DHM暴露对α4亚基水平没有影响（对照组的88.3±10.3%，图12D和12E）。这些数据表明，DHM抑制、降低和/或防止了体内EtOH暴露/戒断诱导的GABAAR可塑性。
测定了DHM是否防止了在CNS神经元中EtOH诱导的GABAAR可塑性。用载体（载体组）、EtOH（EtOH组）、EtOH联合DHM（1mg/kg，E+D，EtOH+DHM组）或者DHM（DHM组）管饲四个组的大鼠。在戒断48小时之后，记录在海马切片中的DGC上的全细胞GABAAR介导的电流。在载体组中，EtOH（60mM）的浴应用将I强直从28.8±3.1增加到62.1±3.3pA（图13，图A、G）。EtOH将mIPSC面积从0.67±0.08增加到0.78±0.10nC（图13，图A、H）。在EtOH组中，EtOH没有增加I强直(从13.0±0.95到13.8±1.28pA)，但将mIPSC面积从0.95±0.01大大增加到1.4±0.02nC（图13，图B、G、H）。在EtOH+DHM组中，EtOH将I强直从30.0±2.8增加到60.0±2.2pA，而mIPSC调节没有改变（从0.70±0.03到0.78±0.02nC，图13，图C、G、H）。在DHM组中，I强直和mIPSCs对EtOH的反应与载体组对EtOH的反应相似(图13，图D、G、H)。这些结果表明，EtOH联合DHM灌胃给药抑制、降低和/或防止了随后的对EtOH的耐受性以及EtOH诱导的GABAAR可塑性。
在上述4组治疗后唑吡坦（一种苯二氮卓类激动剂）对大鼠中DGC的影响。唑吡坦在DHM组中如在载体组一样诱导了GABAAR电流的增强，但是没有影响EtOH组中的GABAAR电流，因此表明EtOH对唑吡坦产生了交叉耐受性（图13，图F、I、J）。这些结果表明，EtOH和DHM的共同给予抑制、降低和/或防止了EtOH诱导的GABAAR可塑性，并且DHM不产生对EtOH或唑吡坦的交叉耐受性。
检验了DHM对预先暴露于EtOH的培养的神经元的作用。DHM的浴应用浓度依赖性地增强了I强直和mIPSC（0.03-30μΜ，图14A和14B）。用于增强I强直（大约0.20μΜ）和mEPSC（大约0.15μΜ）的EC50与在载体组中的相似（图11A和图11B）。这些数据表明，即使在EtOH暴露/戒断后（导致了对EtOH的耐受性），DHM在增强突触和突触外GABAARS中保持有效。
使用细胞表面生物素化作用继之以蛋白质印迹分析来测量在培养的神经元中的α4亚基的表面表达。EtOH治疗的神经元显示出增加的α4亚基表面表达（对照组的249.7%±28.1%）；而这种增加在用EtOH+DHM治疗的神经元中被阻断（对照组的123.0±8.4%，图14C和14D）。DHM没有改变α4亚基表面表达（对照组的125.0%±27.3%，图14C和14D）。这些体外数据表明，EtOH和DHM的共同给予抑制、降低和/或防止了通常可能由暴露于EtOH（包括单次暴露和慢性间歇性EtOH暴露）而产生的GABAAR的可塑性。
DHM诱导在慢性自愿酒精摄取大鼠模型中的EtOH消耗
检验了DHM对酒精消耗的影响。所有的流体提供在100mL的具有不锈钢饮用管（drinking spout）的有刻度的玻璃量筒中，该量筒在逆向光/暗周期室（reversed light/dark cycle room）中的光线消失15分钟后插入。在提供流体30分钟和24小时之后称量瓶子。每天对每只大鼠称重，以便监测健康，并且计算每公斤体重的乙醇摄入克数。将大鼠分为4个组，并分别间歇接近水/水、20%EtOH/水、E+D/水、或DHM/水的双瓶选择范例。
训练大鼠使其自由接近水/水、20%（w/v）EtOH/水、EtOH+DHM（0.05mg/ml，E+D）/水或DHM/水的双瓶选择，持续两周。第一周向每个瓶中加入甜味剂（2pk/L）。第二周向每个瓶中加入甜味剂（1pk/L）。在训练之后，在每周3个24小时（周一、周三和周五）的期间给予这些大鼠接近水/水、EtOH/水、E+D/水、或DHM/水（全都不含甜味剂）的双瓶选择。大鼠在EtOH接近时期不受限制地接近双瓶。在每个EtOH饮用期间轮换EtOH瓶的布局来控制侧偏好。将大鼠保持在20%EtOH间歇性接近双瓶选择范例上持续7周（21个EtOH接近期间）。从第5周（第13期间）开始向EtOH组的一半大鼠在EtOH瓶中加入DHM。剩余的EtOH组大鼠继续EtOH接近期。EtOH消耗被表示为每公斤体重消耗的EtOH的克数。接近双瓶水的大鼠被视为对照组。在实验结束时，在对照组大鼠与饮用EtOH的大鼠的体重之间没有显著差异。
从第二周开始，在EtOH/水组中的EtOH消耗从3.1±1.3增加到7.5±0.5g/kg/天。EtOH和DHM的共同给予（E+D/水组）消除了这种EtOH摄入的增加（2.6±0.4g/kg/天，图15A）。在四周之后，将EtOH/水组再细分为2个组：一组继续提供EtOH/水，而给另一组提供E+D/水。E/水亚组维持高水平的EtOH摄入，而在E+D/水亚组中，EtOH消耗在第5周末时降低到1.8±1.0g/kg/天，并且在第六周末时降低到1.2±0.2g/kg/天，与用E+D/水开始的组相似（图15A）。在4个组之间的总流体消耗没有显著差异。这些结果表明，DHM抑制、降低、和/或防止了过度的酒精消耗（酒精滥用）（如果采用酒精的话）。当高的自愿EtOH消耗已经通过EtOH暴露建立时，DHM降低了酒精消耗（治疗酒精滥用）。
在第四周末，来自暴露于E+D/水组的大鼠的血浆[EtOH]显著低于来自暴露于E/水的组。血浆[EtOH]与测量的EtOH消耗量很好地关联。在第4周末的酒精日开始的30、45、60以及100分钟的自愿20%EtOH后，测量每个动物的血浆[EtOH]（mg/dl）。两组中的血浆[EtOH]具有显著性差异（p<0.05，图15B）。这些数据表明DHM抑制、降低、和/或防止了高的自愿EtOH消耗（EtOH滥用）。
另外进行的实验表明，通过用DHM（1mg/kg，腹膜内注射，n=6只大鼠/组）联合治疗减少了雌性大鼠中（与雄性大鼠中相似）EtOH（3g/kg，腹膜内注射）诱导的LORR持续时间。同样，在雌性大鼠中，DHM+EtOH的共同给予同样抑制、降低和/或防止了EtOH中毒/戒断诱导的在PTZ诱导的发作持续时间和发作频率方面的增加。
在此的实验显示，培养的或在切片中的海马神经元中，DHM浓度依赖性地增强了GABAAR介导的mIPSC和强直电流。利用培养的神经元，DHM引起GABA浓度反应关系的左移。这些结果表明，DHM增强了突触和突触外GABAARs两者。然而，DHM暴露/戒断不诱导细胞水平的长期GABAAR的可塑性。在足以改善EtOH中毒的剂量范围，DHM不诱导中毒症状（如LORR）或引起AWS（如发作易感性的增加），也不诱导对EtOH的交叉耐受性。因此，DHM可以用于治疗急性或慢性酒精消耗。
在从EtOH暴露中戒断的大鼠中，体内行为实验显示出发作阈值、焦虑、以及对镇静/麻醉药物的耐受性的下降（以一种与在人AWS中观察到的症状相似的方式）。如在此所披露的，用海马切片进行的研究显示，在从DHM和EtOH共同给予戒断48小时后，对急性EtOH具有显著的I强直敏感性。同样，DHM和EtOH的共同给予通过EtOH治疗而阻断了基线I强直幅值的降低。在培养的海马神经元中发现了相似的DHM的作用。这些来自大鼠海马的结果表明，EtOH诱导的在含有α4的GABAARS方面的改变被DHM阻断。这些结果表明，DHM不仅拮抗了EtOH对GABAAR功能的作用响，而且阻断了含有α4的GABAARS从突触外到突触的再定位。因此，DHM可以被用来治疗与由于暴露于EtOH导致的GABAAR可塑性相关的酒精使用障碍。
在此的实验表明，对于初次接受试验的GABAARS和已经暴露到EtOH的GABAARS，DHM继续有效地增强了突触和突触外GABAARS。而且，在脑切片中，DHM阻断了初次接受试验的海马神经元中的突触GABAARS的急性EtOH增强。这些结果表明，DHM是一种GABAARS调节剂，因此表明在受试者中对其他药剂（如苯二氮卓类）有耐受性的酒精中毒和AWS，DHM可能是一种有效的治疗。
用大豆甙、槲皮素、染料木黄酮、杨梅树皮素、以及葛根素的比较实验显示，DHM对与由于EtOH暴露导致的GABAARS相关的酒精中毒、酒精使用障碍以及酒精滥用的影响可能是独特的。具体地说，来自大鼠海马切片的神经元的膜片钳记录显示：A）DHM增强了突触外GABAAR介导的强直电流（I强直）和突触后电流（mIPSC），而大豆甙对I强直没有影响但显著增强了mIPSC。槲皮素对Itonic或mIPSC均没有影响。因此，DHM可以被用来选择性地调节突触外GABAARS。在大鼠海马切片中的神经元的膜片钳记录显示，在60mM EtOH存在的情况下，DHM浓度依赖性地阻断了GABAAR介导的I强直和mIPSC的EtOH增强，而大豆甙和槲皮素则不然。[3H]氟硝西泮结合测定表明，DHM、大豆甙元以及大豆甙(dainzin)结合GABAARS，但是显著地被[3H]氟硝西泮取代；而染料木黄酮、杨梅树皮素、葛根素和槲皮素不与GABAARS结合。这些结果表明，DHM独特地拮抗了CNS神经元中的GABAARS的酒精增强。
到理解或完成本发明的披露必要的程度，在此所提及的所有出版物、专利、专利申请通过引用在其中而清楚地结合，其程度如同各自单独地这样结合。
在此所披露的实例和实验旨在展示而非限制本发明。因此已经描述了本发明的示例性实施例，本领域的技术人员应当注意的是，其中的披露仅仅是示例性的，并且可以在本发明的范围之内做出不同的其他替代方案、适应性改变、以及修改。因此，本发明不限于如在此展示的具体实施例，但是仅由以下权利要求书限定。
Claims (11)
1.一种用于治疗、抑制、减轻和/或逆转与由暴露于乙醇引起的GABAAR可塑性相关的酒精中毒和酒精使用障碍的方法，该方法包括向将要、正在和/或已经暴露于乙醇的GABAA受体给予二氢杨梅素。
2.一种用于增强GABAA受体的活性的方法，包括向GABAA受体给予二氢杨梅素。
3.一种拮抗乙醇对GABAA受体的活性的方法，包括在GABAA受体暴露于乙醇之前、期间和/或之后向其给予二氢杨梅素。
4.一种用于治疗、抑制和/或减轻受试者中的乙醇中毒、戒酒综合征的症状、酒精使用障碍和/或酒精滥用的方法，包括根据权利要求1所述的治疗、降低或逆转受试者中的GABAA受体的GABAAR可塑性；根据权利要求2所述的增强受试者中的GABAA受体的活性；和/或根据权利要求3所述的拮抗受试者中的乙醇对GABAA受体的活性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中戒酒综合征的症状选自下组，该组由以下各项组成：对乙醇的耐受性、基础焦虑增加、以及过度兴奋。
6.根据权利要求4所述的方法，其中该治疗减轻或抑制了受试者中的由暴露于乙醇引起的警觉性的下降。
7.根据以上权利要求中的任何一项所述的方法，其中二氢杨梅素是以有效量给予的。
8.根据以上权利要求中的任何一项所述的方法，其中二氢杨梅素是在暴露于乙醇之前、期间和/或之后给予的。
9.根据以上权利要求中的任何一项所述的方法，其中二氢杨梅素是以可能含有或可能不含有乙醇的食品的形式如饮料给予的。
10.根据以上权利要求中的任何一项所述的方法，其中二氢杨梅素是和乙醇共同给予的。
11.如在此所披露的本发明。
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