KR20210039366A - 시계꽃 추출물을 함유하는 간질의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간질의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 간질을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

Description

시계꽃 추출물을 함유하는 간질의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating of epilepsy comprising Passiflora incarnata L. extract}

본 발명은 시계꽃(Passiflora incarnata L.) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 간질의 개선, 예방 또는 치료가 가능한 조성물에 관한 것이다.

현대인의 대부분이 수면장애 경험이 있다고 하는 조사 결과도 있듯이 스트레스가 급증한 사회적 분위기나 환경에 의해 수면장애로 고민하는 사람이 증가하고 있다.

이러한 수면장애는 수면각성장애라고도 하며, 불면증, 과면증, 수면각성시간 장애, 수면시 이상행동 등으로 분류한다. 불면증은 수면경향이 감퇴하는 양적 이상을 말하는데, 좀처럼 잠들기가 어려운 취면장애(就眠障碍), 일단 잠이 들었어도 숙면이 되지 않는 숙면장애(熟眠障碍), 아침 일찍 깨는 조조각성(早朝覺醒) 등이 있다. 과면증은 수면경향이 항진하는 것을 말하며, 탈력발작(脫力發作), 입면시 환각, 꿈, 수면, 마비, 수면발작 등의 증세가 있으며, 1주일 정도 경면기(傾眠期)를 반복하는 주기성 경면증 등도 있다. 수면각성시간장애는 시차병(時差病)이나 야간 근무자의 수면장애 등을 말하며, 수면시 이상행동은 몽유병, 야경증(夜警症), 야뇨증(夜尿症) 등의 질병으로 수면장애를 일으킨다.

그 중에서 불면증은 가장 흔한 증상이며, 대부분이 정신과적 문제나 내과적 또는 신경과적 문제, 약물의 사용이나 사용 중지 등에 의하여 생긴 것이 아닌 불면증인 일차성 불면증이다. 불면증 증상을 평가할 때, 의사들은 일반적으로 ① 수면 잠복기(latency to sleep), ② 수면 지속기간(duration of sleep), ③ 수면의 불안정한 패턴, 즉, 빈번한 야간 각성 현상(frequent nocturnal wakening event) 및 ④ 잠에서 깰 때 생기는 졸음(drowsiness), ⑤ 인지 및 운동 기능의 손상 같은 잔여 숙취 작용(residual hangover effect)으로 분류하여 평가한다.

불면증의 원인은 과도한 각성이라 생각되고 있으며, 상향망상체 형성계의 활동이 수면 시에도 과도하게 활성화되어 발생하는 것으로 생각된다. 또한, 수면에 대한 부정적인 조건이 형성되면 일차성 불면증, 특히 정신생리적 불면증을 발생시킨다고 생각되고 있다. 이는 잠들기 어려운 부정적 경험들이 반복되고 학습되어 불면증을 발생시킨다는 것이다.

불면증에 대한 초기 치료법에서는 바르비투르산염과 같은 중추신경계 억제제를 통상적으로 사용하였다. 그러나 이들 화합물들은 기면, 착란 및 우울증 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 또 다른 약물치료제로서 조디아제핀류의 진정-수면제(sedative-hypnotic)가 있다. 그러나 이 화학약물종도 반복적인 투약에 따른 내성의 발생, 투약 중지에 따른 반동 불면증 등의 부작용이 있다. 불면증에 대한 또 다른 화학약물 치료제는 피라졸로피리미딘계 수면제, 졸피뎀 및 잘레프론 등을 포함한다. 그러나 현재까지 개발된 불면증의 화학약물 치료제들은 대부분 부작용을 수반하고, 특히 장기 복용 시 약물에 대한 중독 증상 등 심각한 부작용을 발생시키는 문제점이 있다.

따라서 부작용 없이 수면시간을 향상시킬 수 있는 천연물 소재의 조성무리 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제1961974호 대한민국 공개특허 제2019-0024593호

본 발명의 목적은 발명은 시계꽃(Passiflora incarnata L.) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 간질의 예방 및 치료가 가능한 약학 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시계꽃(Passiflora incarnata L.) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 간질의 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 간질의 예방 및 치료가 가능한 약학 조성물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

상기 추출물은 인비트로(in vitro) 상에서 GABA 합성 효소 GAD1, GABA의 베타 서브 타입인 Gabbr1와 Gabbr2, 감마-서브 타입인 Gabrg2, 및 GABA 트랜스 포터인 GAT1과 GAT3의 mRNA 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 추출물은 혼합물과 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 1 내지 100의 부피비로 혼합하여 추출하는 것일 수 있다.

상기 혼합용매는 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.

상기 조성물은 간질에 의한 발작을 억제시킬 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 간질의 개선 또는 예방이 가능한 식품 조성물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 간질에 의한 발작을 억제시키는 등 간질을 개선, 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 작용하며, 더욱이 독성이 없으므로 식품의 형태로도 섭취할 수 있다.

도 1A는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 체중을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 음식 섭취량을 나타낸 그래프이고, 도 1C는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 물 섭취량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 c-fos 항체로 면역 조직 화학 염색을 수행하여 증류수, PI 250 mg/kg 및 PI 500 mg/kg의 투여로 인해 뇌에서 주요 작용하는 부위를 측정한 도면이다.
도 3A는 증류수, PI 추출물을 6, 0.6 및 0.06 μg/mL로 배양한 경우의 세포 내 ROS 생성 수준을 나타낸 형광 강도이며, 도 3B는 증류수 및 PI 추출물로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 DCF 형광 세기 변화를 정량화한 그래프이고, 도 3C는 증류수 및 PI 추출물로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 세포 생존력을 측정한 그래프이며, 도 3D는 증류수 및 PI 추출물로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 PCR에 의한 GABA 수용체 mRNA 발현을 정량화한 그래프이다.
도 4A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여 후의 멜라토닌 수치를 나타낸 그래프이며, 도 4B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 반복 투여 후의 멜라토닌 수치를 나타낸 그래프이다.
도 5A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여한 후의 부동성 점수를 나타낸 그래프이며, 도 5B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 5일 동안 반복 투여한 후의 부동성 점수를 나타낸 그래프이고, 도 5C는 상기 도 5B의 수치를 곡선 처리 면적(AUC)으로 나타낸 그래프이다.
도 6A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여한 후의 안구 폐쇄 시간을 나타낸 그래프이며, 도 6B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 3일 동안 반복 투여한 후의 안구 폐쇄 시간을 나타낸 그래프이고, 도 6C는 상기 도 6B의 수치를 곡선 처리 면적(AUC)으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따라 추출된 PI 추출물을 HPLC로 측정한 그래프이다.

본 발명은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 간질의 개선, 예방 또는 치료가 가능한 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 간질을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 시계꽃(Passiflora incarnata L.)은 상록성 다년 덩굴식물로서 시계꽃의 꽃, 잎, 줄기, 뿌리, 열매를 이용할 수 있다. 아메리카 원주민들은 눈이 붓거나 염증이 생길 때 식물 전체를 사용했으며, 뿌리는 일반적으로 강장제로 사용된다. 또한 잎은 빠른 맥박을 예방하며 고혈압을 감소시키고 비중독적이고 불안의 진정제로 사용될 뿐만 아니라 천식의 근육 경련, 간질, 신경 과민, 대장성 증후군을 완화시키며 습포제로 사용되어 화상과 피부 염증을 부드럽게 한다.

본 발명의 시계꽃 추출물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.2-0.5의 중량비로 혼합된 추출물이다. 시계꽃 잎을 기준으로 시계꽃 열매의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 간질을 개선, 예방 또는 치료할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 본 발명의 효과가 전혀 발현되지 않으며 독성이 유발될 수 있다.

상기 시계꽃 잎과 시계꽃 열매를 함께 사용하지 않고 단독으로 사용하는 경우에는 상기 두 물질을 함께 사용하는 경우에 비하여 1.5 내지 20배로 낮은 효능을 보이며; 시계꽃 꽃, 줄기, 뿌리를 사용하는 경우에는 상기 두 물질을 함께 사용하는 경우에 비하여 5 내지 50배로 낮은 효능을 보인다.

상기 시계꽃, 예컨대 시계꽃 잎과 시계꽃 열매의 혼합물은 추출용매와 1 : 1 내지 100, 바람직하게는 1 : 5 내지 20의 중량비로 혼합하여 70 내지 100 ℃에서 추출하여 추출물을 제조한다. 상기 시계꽃 잎과 시계꽃 열매의 혼합물과, 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 시계꽃 잎과 시계꽃 열매 혼합물의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.

상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액, 바람직하게는 20 내지 80 부피%의 에탄올로 추출된 추출물이 우수한 효과를 보인다.

본 명세서에서 시계꽃을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 시계꽃 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 시계꽃 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 시계꽃 추출물은 광의로는 시계꽃을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 시계꽃의 가공물, 예컨대, 시계꽃 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 시계꽃 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 시계꽃의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 시계꽃 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 시계꽃 추출물은 200 내지 3000 mg/kg, 바람직하게는 200 내지 2500 mg/kg의 농도를 단회 또는 반복투여로 사용된다. 시계꽃 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 시계꽃 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 수면시간을 향상시키기 위한 약제학적 조성물로 이용될 수 있으며, 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 수면 유도용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 시계꽃 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 시계꽃 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상기 시계꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면시간 향상용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 시계꽃 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 시계꽃 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 수면시간 향상용 의약 또는 식품의 제조를 위한 시계꽃 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 시계꽃 추출물은 수면시간 향상을 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 시계꽃 추출물을 투여하는 것을 포함하는 수면시간 향상용 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 시계꽃 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 200 내지 1500 mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 시계꽃 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 시계꽃 잎 : 시계꽃 열매 = 1 : 0.25의 중량비 추출물(PI 추출물)

시계꽃 잎과 시계꽃 열매를 1 : 0.25의 중량비로 혼합한 혼합물을 50% 에탄올과 혼합하여 80 ℃에서 4시간 동안 추출한 후 여과하고 농축한 다음 분무 건조시켜 시계꽃 추출물(PI 추출물)을 수득하였다(도 7).

<시험예>

마우스 준비

수면시간 향상용 조성물로서의 효과를 검증하기 위해 사람을 대상으로 하는 연구에는 한계가 있기 때문에 동물을 이용하였다.

실험동물은 7 주령의 ICR 수컷 마우스(체중 24 내지 27g) 24마리를 구입(Saeron Bio, 한국)하였다. 상기 마우스들은 특별한 질병, 병원체 또는 유전적 결함이 없다.

실험 시작 전 1주일간 적응시킨 후 12시간 명암주기(light cycle from 7:00-19:00) 하에서 상온(22±1 ℃) 및 60% 습도로 사육하였다. 상기 동물들은 정상적인 음식(2018S; Harlan, USA)과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 제공되었다. 상기 마우스는 시험물질을 투여하기 시작한 후 2일 또는 6일 날에 희생시켰다.

본 실험에 사용한 모든 시험물질은 매일 동일한 시간에 경구 투여하였으며, 상기 마우스와 관련된 모든 절차는 순천향대학교의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC approval no. SCH16-0037)의 윤리적 기준에 따라 수행하였다.

-3개 군의 마우스-

대조군(Veh): 증류수(DW) 700 mg/kg_무게/day 식이군 8마리

PI 250군(PI 250): 실시예 1의 시계꽃 추출물 250 mg/kg_무게/day 단일 투여 식이군 8마리

PI 500군(PI 500): 실시예 1의 시계꽃 추출물 500 mg/kg_무게/day 반복 투여 식이군 8마리

상기 ICR 마우스는 눈이 너무 작아서 안구 폐쇄 시간을 측정할 수 없어, 상기 마우스 대신 SD(Sprague-Dawely) 마우스를 사용하였다.

실험동물은 7 주령의 SD 수컷 마우스(체중 175~225 g) 24마리를 구입(Saeron Bio, 한국)하였으며, 다른 방에 있는 ICR 마우스와 동일한 조건하에 보관되었다.

본 실험에 사용한 모든 시험물질은 매일 동일한 시간에 경구 투여하였으며, 상기 마우스와 관련된 모든 절차는 순천향대학교의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC approval no. SCH16-0037)의 윤리적 기준에 따라 수행하였다.

본 발명에서 단회 투여는 하기 농도를 한번에 투여한 것을 의미하고 반복 투여는 하기 농도로 5일 동안 투여한 것을 의미한다.

-3개 군의 마우스-

대조군(Veh): 증류수(DW) 700 mg/kg_무게/day 식이군 8마리

PI 250군(PI 250): 실시예 1의 시계꽃 추출물 250 mg/kg_무게/day 투여 식이군 8마리

PI 500군(PI 500): 실시예 1의 시계꽃 추출물 500 mg/kg_무게/day 투여 식이군 8마리

HPLC 분석

실시예 1의 시계꽃 추출물 분말(1 g)을 50% 에탄올 수용액 50 ml에 용해시키고 10분간 초음파 처리한 후 0.45 ㎛ 주사기 필터로 여과하였다. HPLC는 모델 G1312A 바이너리 LC 펌프, 오토 샘플러 및 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시스템을 사용하여 수행되었다. C-18(Waters, SunFireTMC18) 컬럼 (250 mm X 4.6 mm id 및 5μm 입자 크기)을 선택하였으며, 스탠다드는 Sigma Chemicals(미국 미주리 주 세인트 루이스)에서 구입하였다.

크로마토그래피 분리는 nanopure water(87%)와 100% acetonitrile(13%)에서 60분 동안 준비한 0.1% 인산으로 구성된 이동상으로 수행하였으며, 주입량은 20 μL였다. 이동상 유속은 1 ml min-1이고, 오븐 온도는 35 ℃이며, 검출 파장은 360 nm이다.

PI 추출물 투여 후 뇌에서의 활동 영역을 c-fos 항체로 면역 조직 화학 염색

면역 조직 화학 염색은 종래 사용되는 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 절편을 실온(RT)에서 30분 동안 0.3% 과산화수소가 함유된 PBS로 처리하고, 30분 동안 실온에서 0.05 M PBS 하에서 10% 정상 염소 또는 토끼 혈청으로 순차적으로 처리하였다. 그런 다음, 4 ℃에서 희석된 염소 anti-c-fos 항체(1 : 500, Santa Cruz biotechnology, CA, USA)를 밤새 배양한 후 비오틴화된 염소 anti-goat IgG와 streptavidin peroxidase complex(1:200 희석, Vector, Burlingame, CA, USA)에서 25 ℃, 2시간 동안 배양하였다.

절편을 토끼 anti-COX-2 항체(1:200, Cayman, Ann Arbor, MI, USA) 또는 마우스 phospho-IκBα(1:500; SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 4 ℃에서 48시간 동안 밤새 배양하였다. 그 다음, 절편을 비오틴화된 염소 anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG와 streptavidin-peroxidase complex(1 : 200, Vector, Burlingame, CA, USA)하에서 25 ℃, 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에서 3, 3'- 다이노벤지딘으로 염색하여 절편을 시각화하였다.

절편은 탈수 후 Canada Balsam (Wako, Tokyo, Japan)과 함께 젤라틴 코팅 슬라이드 상에 올려놓았다.

세포 배양 및 시약

Rat C6 신경교종 세포주(C6, ATCC-CCl-107)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, C6 신경교종 세포주를 10%(v/v) 열-불활성화된 태아소혈청(Gemcell, GEMINI Bioproducts, USA)이 첨가된 Dulbecco 's modified eagle medium high glucose(DMEM, 4.5 g/L glucose; Corning, NY, USA)와 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신용액(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 CO₂ 인큐베이터(Thermo Fisher Scientific; 95% air and 5% CO₂)에서 37 ℃로 배양하였다.

세포 생존율 분석

세포 생존력은 수용성 테트라졸륨염-1(WST-1) 분석 키트(DoGenBio, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. Rat C6 신경교종 세포를 96 well plate(SPL Life Sciences, Pocheonsi, Gyeonggi-do, Korea)에 3X10⁵ cells/well의 밀도로 100 mL 배지에 접종하였다. 세포를 5% CO2 배양기에서 37 ℃로 밤새 배양한 후, 24시간 동안 0.06 μg/mL의 농도인 PI 추출물로 처리되었다. 그 후 10 mL의 EZ cytox 세포 생존력 측정 시약을 각 well에 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 마지막으로, 마이크로 플레이트 판독기(SunriseTM, Tecan)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 모든 실험은 적어도 3번 반복되었다.

Rat C6 신경교종 세포를 다른 농도(6, 0.6 및 0.06 μg/mL)의 PI 추출물과 함께 배양하고 세포 생존율을 50% 감소시킨 농도를 산출하였다. 억제 농도(IC50)는 GraphPad PRISM Version 7.0.1(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 측정되었다.

세포 내 ROS의 측정

세포 내 ROS 수준은 ROS 지시자 플루오게닉 디클로로플루오레신 디아세테이트(H2DCFDA, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 측정하였다. Rat C6 신경교종 세포를 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양한 후 6, 0.6, 0.06 μg/mL의 농도의 PI 추출물로 6시간 동안 처리하였다. DW는 vehicle로 사용되었다.

세포를 수득하여 PBS로 2회 세척한 후 Guava EasyCyte Flow Cytometer (Millipore, Temecula, CA)를 사용하여 분석하고, FlowJo Version 10.0.7.2 (TreeStar, Ashland, OR, USA)를 사용하여 중간 형광강도(MFI)를 측정하였다. 모든 실험을 3번 반복하였다.

Rat C6 신경교종 세포는 유세포 분석과 같이 PI 추출물로 플레이트되고 처리되었으며, 각 플레이트에 10 μM H2DCFDA를 넣고 37 ℃, 5% CO2 조건에서 30분간 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, DMi8 형광 현미경(Leica, Deerfield, IL, USA)을 사용하여 세포를 시각화하였다. 이미지는 LAS X (Leica) 및 Photoshop CC 2017 프로그램(Adobe 시스템)으로 얻었다.

정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)

Rat C6 신경교종 세포를 60 mm 플레이트에 도포하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 세포는 6시간 동안 6 μg/ml 농도의 PI 추출물로 처리되었다.

Isol-RNA Lysis 시약(2302700, SPRIME, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하고, MMLV 역전사 효소(RT001, Enzynomics, Yuseong-gu, Daejeon, Korea)를 RNA(11μg), 1 μL의 10 pM 올리고(dT) 프라이머, 1 μL의 dNTP 혼합물(각 2 mM)을 따라 표준 보충제 DNA(cDNA)를 발생시켜 사용하며, 0.1% (v/v) DEPC 처리된 물(DB0154, BioBasic, Markham, ON, 캐나다)을 200 μL의 PCR 튜브 (Gunster biotech, USA)에 6.5 μL의 최종 부피로 첨가하였다. 상기 혼합물을 42 ℃에서 5분 동안 배양하고 즉시 얼음에서 냉각시킨 후, 10 ㎕ MMLV-RT 완충액 2 ㎕, MMLV 역전사 효소 1 ㎕ 및 RNase 억제제(M007, Enzynomics) 0.5 μL를 첨가하였다.

마지막으로, SimpliAmp Thermal Cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 42 ℃에서 50분 동안 배양한 후 95 ℃에서 5분 동안 배양하였다. qRT-PCR을 위해, Gabra4, Gabbr1, Gabbr2, Gabrg2, GAT1, GAT3, Slc32a1, 및 GAD1 mRNA를 검출하기 위해 고안된 SYBR green (DQ385-40H, Biofact, Yuseong-gu, Daejeon, Korea), 3 μL DW, cDNA (10 μg) 및 1 μL의 primer(정방향 및 역방향 프라이머 각각 10 μM을 함유하는)를 포함하는 2 x 실시간 PCR Master Mix는 광 96-플레이트(Applied Biosystems)에 첨가되었다. PCR 물질을 증폭시키기 위해, 95 ℃에서 10분, 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분으로 40회 처리하여 예비 변성시키고 StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 PCR을 수행하였다.

본 발명에서 사용된 프라이머 서열을 [표 1]에 나타내었다. 모든 실험을 최소 3회 반복하였으며, 상대 유전자 발현 수준은 리바케 (Livaket) 등이 기술한 2^-△△Ct 방법을 사용하여 분석하였다.

PI 추출물을 단회 및 반복 투여에 따른 부동 시간

7 주령의 ICR(Saeron Bio, Korea) 마우스에 PI 추출물을 경구 투여하여 실험 동물의 부동 시간을 측정하였다. 단회 또는 반복 투여로 Veh(대조군), PI 250 mg/kg(PI 250군) 또는 PI 500 mg/kg(PI 500군)을 각 그룹의 마우스에 경구 투여하였다. 경구 투여 30분 후, 마우스의 부동 시간을 1시간 동안 기록하고, 녹화는 디지털 캠코더(HDR-CX405, SONY)를 사용하여 수행되었다. 비디오 녹화 후, 마우스의 부동 시간을 30초로 분리하고 시각적으로 분석하였다. 객관성을 위해 두 관찰자가 무작위로 측정을 수행하였다.

30초 동안 움직이지 않는 시간이 10초이면 1점을 얻고, 20초 또는 30초이면 2점 또는 3점을 각각 득점한다.

PI 추출물을 단회 및 반복 투여에 따른 안구 폐쇄 시간

ICR 마우스의 눈의 움직임을 비디오 촬영으로 쉽게 인지할 수 없다는 기술적 인 문제가 있었기 때문에 SD 마우스에 PI 추출물을 단회 또는 반복적으로 투여하여 안구 폐쇄 시간을 측정하였다. 동물에 대한 PI 투여의 추가 신뢰를 얻기 위해, SD 마우스에 PI 추출물을 3일 동안 반복 투여한 후 안구 폐쇄 시간을 대조군과 비교하였다.

단회 또는 반복 투여로 Veh(대조군), PI 250 mg/kg(PI 250군) 또는 PI 500 mg/kg(PI 500군)을 각 그룹의 마우스에 경구 투여하였다. PI 추출물의 경구 투여 30분 후에, SD 마우스의 팔다리 움직임을 10분 동안 기록하였다. 녹화는 디지털 캠코더(HDR-CX405, SONY)를 사용하여 수행되었으며, 비디오 촬영 후 각 SD 마우스의 안구 폐쇄 시간을 10초 간격으로 육안으로 분석하였다. 객관성을 위해 두 관찰자가 무작위로 측정을 수행하였다.

데이터 분석

객관성을 보장하기 위해 동일한 조건에서 실험 당 두 명의 관찰자가 모든 조건을 블라인드 조건으로 수행하였다. 면역 반응의 정량을 위해, 염색의 정도는 각 실험군 당 5개의 섹션을 사용하여 측정되었다. 컴퓨터와 모니터에 연결된 디지털 카메라(DP71, 올림푸스)가 장착된 BX53 광학 현미경(Olympus, Japan)을 사용하여 c-fos 면역 반응 구조 이미지를 촬영하였다.

표시된 데이터는 각 실험 그룹에 대한 실험 평균 ± 표준 오차(SE)를 나타낸다. 평균값 간의 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA), 적절한 경우 t-검정 및/또는 unpaired t- 검정으로 분석하였다.

통계 분석은 JMP9(SAS Institute, USA)와 Prism7 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. P 값(*: <0.05, **: <0.005, ***: <0.0005)은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

시험예 1. PI 추출물을 투여 후 생리학적 변화 측정

도 1A는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 체중을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 음식 섭취량을 나타낸 그래프이고, 도 1C는 대조군, PI 250군 및 PI 500군 마우스의 물 섭취량을 나타낸 그래프이다.

기능성 식품으로서의 안전성을 위해, PI 추출물은 동물의 수면시간의 향상 효과 이외의 음식 섭취나 체중 변화에 영향을 주어서는 안된다.

도 1A 내지 1C에 도시된 바와 같이, 대조군, PI 250군 및 PI 500군은 체중, 음식물 섭취량 또는 물 소비량이 변화하지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PI 250군 및 PI 500군과 대조군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.

그러므로 PI 추출물은 동물의 기본적인 기능에 영향을 미치지 않는다.

시험예 2. PI 추출물 투여 후 c-fos 항체를 이용한 면역 조직 화학 염색으로 뇌에서의 활동 영역 확인

도 2는 c-fos 항체로 면역 조직 화학 염색을 수행하여 증류수, PI 250 mg/kg 및 PI 500 mg/kg의 투여로 인해 뇌에서 주요 작용하는 부위를 측정한 도면이다.

검은색 사각형은 MB의 RMM을 나타낸다(MB : Mamillary body; RMM: Retromammillary nu medial). 상기 RMM은 수면과 관련이 높은 것으로 알려져 있으며, PI 추출물 투여 후 RMM 부위에서 일차적인 활동이 일어나 동물이 수면을 취할 수 있는 것으로 보인다.

뇌 조직 전체를 20 μm 간격으로 관상 동맥을 절개하고 항-c-fos를 이용한 면역 조직 화학 염색을 시행하였다. bregma -2.54 mm부터 bregma -2.80 mm까지의 MB(뇌 구성도, 우측도) 주변에서 대조군, PI 250군 및 PI 500군의 이미지를 얻었다.

도 2에 도시된 바와 같이, PI 250군 및 PI 500군은 MB(mammillary body) 주변에 c-fos 양성 세포가 발견된 반면, 대조군은 MB 주변에는 어떠한 c-fos 신호가 없는 것을 확인하였다.

다수의 c-fos 양성 세포가 PI 250군 및 PI 500 군에서 MB 주위에서 관찰되었지만, 대조군에서는 관찰되지 않았다.

시험예 3. 랫트 C6 신경교종 세포를 PI 추출물로 처리 후 ROS 생성 및 세포 생존 능력 측정

도 3A는 증류수, PI 추출물을 6, 0.6 및 0.06 μg/mL로 배양한 경우의 세포 내 ROS 생성 수준을 나타낸 형광 강도이며(형광 강도는 유동 세포 계측법으로 측정), 도 3B는 증류수 및 PI 추출물로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 DCF 형광 세기 변화를 정량화한 그래프이고, 도 3C는 증류수 및 PI 추출물로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 세포 생존력을 측정한 그래프이다(WST-1 분석 이용).

ROS 검출기 H2DCFDA는 비형광 세포막에 침투할 수 있으며, 세포막을 통해 세포로 들어가면 에스테르화 효소 또는 HO-와 반응하여 DCFH로 가수분해되어 비형광성을 보인다. 신경교종 세포를 PI 추출물로 6시간 동안 처리한 후 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.

미토콘드리아 탈수소효소 활성에 따라 분광 광도계로 검출될 수 있는 오렌지 포르마잔 생성물을 생성하는 WST-1에 기초한 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정하였으며, 이때 랫트 C6 신경교종 세포를 PI 추출물과 함께 6시간 동안 배양하였다.

도 3A 및 3B에 도시된 바와 같이, PI 추출물로 처리된 세포의 PI 추출물의 농도가 6 및 0.6 μg/mL일 때의 상대적 ROS 생성(DCX-MFI) 값은 대조군 세포에 비해 유의적으로 증가하였다.

또한 도 3C에 도시된 바와 같이, PI 추출물의 농도가 0.06 내지 6 ㎍/㎖일 때 세포 생존력에 유의한 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 구체적으로, C6 신경교종 세포의 생존율은 PI 추출물을 60 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후에 유의하게 감소하였으며, 다른 농도로 처리한 것은 아무런 유의성을 보이지 않았다.

시험예 4. 실시간 중합 효소 연쇄반응(PCR)에 의한 GABAa 수용체 및 관련 유전자 mRNA 발현의 정량화

도 3D는 증류수 및 PI 추출물(0.6 μg/mL)로 6시간 동안 처리된 C6 랫트 신경교종 세포의 PCR에 의한 GABA 수용체 mRNA 발현을 정량화한 그래프이다.

GABA 수용체에는 알파 서브 타입으로서 Gabra1 및 Gabra4, 베타 서브 타입으로서의 Gabbr1 및 Gabbr2, GABA 트랜스 포터로서의 GAT1, GAT3 및 Slc32a1 및 GABA 합성 효소로서의 GAD를 포함하는 몇 가지 상이한 아형이 있다.

도 3D에 도시된 바와 같이, PI 추출물 처리군에서 Gabra1과 Gabra4(α-서브 타입)의 mRNA 발현 수준이 대조군보다 낮았으며, Gabbr1과 Gabbr2(베타-서브 타입)은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 또한, PI 추출물 처리군에서 감마-서브 타입인 Gabrg2 mRNA 발현에 있어서, 그의 발현은 대조군보다 유의하게 증가하였다.

그러나 GAT3 발현은 PI 추출물 처리군과 대조군간에 유의한 차이를 보였으나, GAT1과 Slc32al GABA 수송체의 mRNA 발현은 PI 추출물 처리군과 대조군간에 유의한 차이가 없었다.

또한, GABA 합성 효소 GAD1은 PI 추출물 처리군과 Veh 처리군 간에 유의한 차이를 보였다.

예컨대, GABA 합성 효소 GAD1, GABA의 베타 서브 타입인 Gabbr1와 Gabbr2, 감마-서브 타입인 Gabrg2, 및 GABA 트랜스 포터인 GAT1과 GAT3의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

이로써, PI 추출물이 GABA 수용체 및 관련 유전자의 mRNA 발현을 증가시키며 신경 세포 활성을 억제하는 능력을 보이는 것을 알 수 있다. 흥미롭게도, GABA 활성은 ROS 발현에 의해 크게 영향을 받는 것으로 보고되었으며, ROS 발현의 증가 또는 감소는 세포 손상 또는 세포 내 사이토카인의 발현과 관련될 뿐만 아니라 GABA의 활성에 필요한 중요한 인자로 작용한다.

상기 결과는 PI 추출물이 GABA 수용체의 α-서브 타입을 감소시키지만 β 및 γ- 서브 타입의 증가를 보이고, GABA 수송 GAT1과 GAT3를 증가시키는 것을 확인하였다. Slc32al의 발현은 PI 추출물에 의해 영향을 받지 않았다.

GABA 트랜스포터는 GAD1을 증가시킴으로써 GABA 합성을 촉진시키는 역할을 하므로, PI 추출물이 수용체 β 및 γ-서브 타입을 α-서브 타입 수용체보다 리간드로 강화시키고 일부 GABA 전달체(GAT1 및 GAT3)를 통해 GAD1을 통한 GABA 합성을 촉진시킴으로써 효능을 발휘할 것으로 예상된다. β 및 γ-서브 타입의 리간드 수용체는 시상 하부에 대한 GABA성 수면 유도 효과로 인한 시냅스 전달에 큰 기여한다.

시험예 5. 단회 또는 반복적으로 PI 추출물을 경구 투여한 후의 혈청 멜라토닌 수치 측정

도 4A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여 후의 멜라토닌 수치를 나타낸 그래프이며, 도 4B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 반복 투여 후의 멜라토닌 수치를 나타낸 그래프이다.

도 4A 및 4B에 도시된 바와 같이, 대조군 또는 PI 추출물을 단회 투여한 후 혈청 멜라토닌 수치는 대조군에서 7.32±0.612, PI 250군에서 8.37±0.858, PI 500군에서 10.92±0.694인 것을 확인하였다. 즉, 대조군 및 PI 500군 간에 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다.

또한, 대조군과 PI 추출물 250 mg/kg로 반복 투여한 후 혈청 멜라토닌 수치는 각각 7.82±0.585와 12.00±1.600인 것을 확인하였다. 즉, 대조군 및 PI 250군 간에 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다.

시험예 6. 단회 또는 반복적으로 PI 추출물을 경구 투여한 후의 부동 시간 측정

도 5A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여한 후의 부동성 점수를 나타낸 그래프이며, 도 5B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 5일 동안 반복 투여한 후의 부동성 점수를 나타낸 그래프이고, 도 5C는 상기 도 5B의 수치를 곡선 처리 면적(AUC)으로 나타낸 그래프이다.

도 5A에 도시된 바와 같이, PI 추출물을 250 mg/kg(PI 250군) 또는 500 mg/kg(PI 500군)의 농도로 단일 경구 투여한 후의 마우스의 부동 시간은 대조군에 비해 연장된 것을 확인하였다. 그러나 대조군에 비해 PI 250군에서는 유의하게 연장되지 않았고, PI 500군에서는 유의하게 연장되었으며, PI 500군의 부동성 점수는 PI 250군보다 유의하게 연장되었다.

또한 도 5B에 도시된 바와 같이, PI 추출물을 250 mg/kg(PI 250군)의 농도로 5일간 반복 경구 투여 하였을 때의 부동성 점수는 투여 시작 시점부터 대조군에 비해 지속적으로 높은 것을 확인하였다.

또한 도 5C에 도시된 바와 같이, AUC은 PI 250군과 대조군 간에 유의한 차이를 보였다.

이러한 결과는 하기 안구 폐쇄 시간 검사의 결과와 도의 동일하다.

시험예 7. 단회 또는 반복적으로 PI 추출물을 경구 투여한 후의 안구 폐쇄 시간 측정

도 6A는 증류수, PI 추출물 250 mg/kg 및 PI 추출물 500 mg/kg을 단회 투여한 후의 안구 폐쇄 시간을 나타낸 그래프이며, 도 6B는 증류수 및 PI 추출물 250 mg/kg을 3일 동안 반복 투여한 후의 안구 폐쇄 시간을 나타낸 그래프이고, 도 6C는 상기 도 6B의 수치를 곡선 처리 면적(AUC)으로 나타낸 그래프이다.

PI 추출물과 증류수를 경구 투여 후 30분부터 1시간 동안 SD 랫트의 안구 폐쇄 시간의 누적 분을 측정한 것이다.

도 6A에 도시된 바와 같이, PI 추출물을 250 mg/kg(PI 250군) 또는 500 mg/kg(PI 500군)의 농도로 단일 경구 투여한 후 SD 랫트의 안구 폐쇄 시간은 대조군보다 연장된 것을 확인하였다. 더욱이, PI 500군의 안구 폐쇄 시간은 PI 250군보다 현저히 높은 것을 확인하였다.

또한 도 6B 및 6C에 도시된 바와 같이, PI 추출물을 250 mg/kg(PI 250군)의 농도로 3일간 반복 경구 투여한 군은 대조군에 비하여 SD 랫트의 안구 폐쇄 시간이 높은 것을 확인하였으며, 특히 2일 째부터 PI 250군이 대조군보다 안구 폐쇄 시간이 점차 증가하는 것을 확인하였다.

PI 250군과 대조군 사이의 곡선 부분(AUC)도 유의한 차이를 보였다.

본 발명은 PI 추출물이 수면을 일으키는 모든 기전을 설명하는 것은 불가능하지만, 가장 기본적인 메커니즘인 GABA의 조절과 밀접한 관련이 있으며, 그 활성 부위는 뇌의 모유체의 RMM으로 제한된다는 것을 확인하였다. PI 250 mg/kg(PI 250군)의 반복 투여는 동물의 체중이나 비정상적인 섭식 행동에 심각한 변화를 일으키지 않는다.

또한, PI 250 mg/kg(PI 250군)의 단회 또는 반복 투여로 수면시간을 증대시킬 수 있고, PI 500 mg/kg(PI 500군)은 단회 투여만으로도 마우스에서 수면시간을 증대시킬 수 있다.

하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간질의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 인비트로(in vitro) 상에서 GABA 합성 효소 GAD1, GABA의 베타 서브 타입인 Gabbr1와 Gabbr2, 감마-서브 타입인 Gabrg2, 및 GABA 트랜스 포터인 GAT1과 GAT3의 mRNA 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 간질의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 혼합물과 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 1 내지 100의 부피비로 혼합하여 추출하는 것을 특징으로 하는 간질의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 간질의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 간질에 의한 발작을 억제시키는 것을 특징으로 하는 간질의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간질의 개선 또는 예방용 식품 조성물.

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