KR102091620B1

KR102091620B1 - 엘세린을 유효성분으로 포함하는 혈뇌장벽 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR102091620B1
Application number: KR1020190046017A
Authority: KR
Inventors: 황수경; 전도연; 김영호; 김민주
Original assignee: 주식회사 아스트로젠
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2020-03-20
Also published as: KR20190044045A; KR101948066B1; KR20180103027A; KR20180101242A

Abstract

본 발명은 아미노산인 엘-세린을 유효성분으로 포함하는 신경발달장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 신경발달장애 환자들의 엘-세린 생합성장애를 진단할 수 있는 기술을 확보하고 엘-세린 공급에 의해 임상 증상이 개선되는 효과를 확인하였다. 또한 파괴된 혈뇌장벽을 복구하는 하는 것을 확인하였으므로 저산소성 허혈성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 신경염증질환, 뇌혈관 질환, 퇴행성 신경질환, 집중력장애, 기억장애 등의 예방 및 치료에도 적용될 수 있을 것이라 기대된다. 그러나 엘-세린은 뇌흡수율이 낮아 식이만으로는 치료 효과가 한정적이므로 이를 극대화할 수 있는 조성물의 개발이 필요하다. 본 발명을 통해 확립된 진단법 및 조성물을 통해 다양한 신경질환의 효과적인 예방 및 치료 가이드라인을 제시하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

엘세린을 유효성분으로 포함하는 혈뇌장벽 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF BLOOD BRAIN BARRIER DISORDER COMPRISING L-SERINE AS AN EFFECTIVE COMPONENT AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 아미노산인 엘-세린을 유효성분으로 포함하는 신경발달장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

신경발달장애는 중추신경계가 형성되고 발달하는 중요한 시기에 정상적인 신경발달이 다양한 원인에 의해 저해되어 나타나는 질환으로 자폐스펙트럼장애, 지적장애, 학습장애, 언어장애, 주의력결핍과잉행동장애, 정서장애, 운동장애 등의 증상이 복합적으로 나타나는 경우가 많다. 특히 의사소통과 상호작용의 지속적 결함, 제한적이고 반복적인 행동, 관심, 또는 활동 패턴이 발달 초기부터 나타나는 것을 특징으로 하는 자폐스펙트럼장애는 인간 본연의 사회성을 상실하여 소통 및 정서적 교감이 이루어지지 않아 극심한 고통을 야기하며 다른 질환에 비해서도 장애의 정도가 심해 평생에 걸친 치료와 보살핌이 필요하고 특수치료에 소요되는 비용이 높아 사회경제적인 부담이 크다.

현재까지 신경발달장애 환자의 인지, 사회성, 언어발달 등을 효과적으로 개선하는 약물은 전무하다. 유일하게 승인된 치료제는 항정신병약제인 risperidone과 abilify이며 공격성과 불안이 심한 경우에 한해 제한적으로 처방할 수 있으나 효과가 한정적이고 다양한 부작용이 나타날 수 있다. 최근 신경발달장애의 기전을 밝히기 위한 연구 중 신경교세포 (glia)의 역할에 대한 관심이 높아졌다. 뇌의 80-90 %를 차지하는 신경교세포는 신경세포 (neuron)를 구조적으로 지지하면서 정상적인 기능을 유지할 수 있도록 돕는다. 신경교세포 중 가장 많은 비율을 차지하는 성상교세포 (astrocyte)는 신경세포의 성장과 발달에 필수적인 영양물질인 엘-세린을 합성하고 분비한다. 성상교세포 기능의 장애가 퇴행성 신경질환, 뇌혈관 질환, 신경염증 등 뇌신경질환을 유발하는 병인의 핵심으로 떠올라 다양한 신경질환 치료후보물질로 엘-세린이 제시되기도 하였다.

엘-세린은 많은 대사계에 관여하여 신경세포가 정상적으로 성장하고 발달하는데 중요한 역할을 담당한다. deoxyribonucleic acid (DNA)의 재료가 되는 염기를 합성하여 세포가 증식하는데 필수적인 역할을 하며 글루타치온 (glutathione) 합성의 전구체로서도 작용하여 항산화에도 중요한 역할을 담당한다. 엘-세린에서 유래된 포스파티딜세린 (phosphatidylserine), 스핑고신 (sphingosine) 등의 인지질은 신경세포를 감싸는 수초의 주요한 성분으로 신경 정보가 빠른 속도로 전달될 수 있게 한다. 또한 신경전달물질 중 디-세린 (D-serine)과 글리신 (glycine)을 합성하여 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체를 활성화시킨다. 디-세린은 부족 시 다양한 신경질환을 나타낼 수 있으며 NMDA 수용체 기능 이상과 관련된 질환을 가진 일부 환자를 대상으로 한 치료에서 효과를 보인 바가 있다. 디-세린은 비교적 임상 연구가 많은 반면 엘-세린은 신경발달장애 환자에 대해 효과가 검증된 바가 없고 디-세린에 비해 어떤 우수성과 차별성이 있는지에 대한 연구가 필요하다.

엘-세린은 식품에 널리 포함되어 있으나 혈뇌장벽 (blood brain barrier) 통과가 어려운 아미노산이므로 식이만으로 뇌까지 도달하는 것은 한계가 있다. 정상적인 뇌 기능을 유지하기 위한 엘-세린 대부분이 뇌에서 신생합성 (de novo biosynthesis)을 통해 만들어진다. 엘-세린의 합성은 포도당의 해당과정 중에 세 가지 효소가 연속적으로 작용하여 이루어진다. 첫 번째 효소인 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH)에 의해 3-phosphohydroxy pyruvate로 산화되고, 이어 두 번째 효소인 phosphoserine aminotransferase (PSAT)에 의해 3-phosphoserine으로 전환되며, 마지막으로 세 번째 효소인 phosphoserine phosphatase (PSPH)에 의해 엘-세린이 합성된다. 엘-세린 합성과 관계된 유전자들 (PHGDH, PSAT, PSPH)의 변이로 심각한 신경발달장애 및 기형이 야기되는 것은 정상적인 뇌기능 유지를 위한 엘-세린 대부분이 뇌 내에서 합성된 것임을 시사한다. 엘-세린 합성 결함이 진단되어 식이로 공급하더라도 단독으로는 뇌에 흡수되기가 매우 어려우므로 치료 효과가 한정적이다. 따라서 엘-세린의 치료 효과를 극대화할 수 있는 조성물의 개발이 필요하다.

KR 10-2005-7005544 A

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 엘-세린의 임상적 효과 및 손상된 혈뇌장벽에 대한 복구 효과를 검증하여 디-세린과의 차별성을 제공하고, 다양하고 복잡한 원인을 가진 신경발달장애 환자에게 바이오마커를 통해 엘-세린 생합성장애를 진단하고 맞춤형 치료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 엘-세린이 결핍된 상황에서 신경교세포를 활성화시킬 수 있는 병용물질들을 검증하여 신경발달장애의 개선, 예방 또는 치료용 엘-세린 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 엘-세린 (L-serine)을 유효성분으로 포함하는, 신경발달장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물 중 엘-세린의 함량은 0.01 중량% 내지 99.9 중량%일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 파괴된 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 복구를 촉진시킨다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 신경교세포 증식을 활성화시킨다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경발달장애는 자폐스펙트럼장애, 지적장애, 학습장애, 언어장애, 주의력결핍과잉행동장애, 정서장애, 및 운동장애를 포함한다.

본 발명은 엘-세린 (L-serine)을 유효성분으로 포함하는, 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로,

상기 조성물 중 엘-세린의 함량은 0.01 중량% 내지 99.9 중량% 일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 식용피(Echinochloa crus-galli) 또는 레시틴을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로,

상기 신경질환은 신경발달장애, 저산소성 허혈성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 신경염증질환, 뇌혈관 질환, 퇴행성 신경질환, 집중력장애 및 기억장애를 포함한다.

또한, 본 발명은 엘-세린 생합성 장애 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 엘-세린 생합성 장애 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(1) 엘-세린 결핍 배지에 환자 유래 T 세포, PHA (phytohemagglutinin) 및 인터루킨-2 (Interleukin 2, IL- 2)를 적용하여 엘-세린 생합성을 유도 및 활성화시키는 단계;

(2) 상기 T 세포의 증식 정도를 분석하는 단계; 및

(3) 상기 T 세포의 증식 정도가 정상 대조군에 비해 감소되었을 때, 엘-세린 생합성 장애로 판정하는 단계.

본 발명은 아미노산인 엘-세린을 유효성분으로 포함하는 신경발달장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 식약처 승인을 받은 식품첨가물로서 안전성이 확보되어 있는 엘-세린을 유효성분으로 하므로 부작용과 독성에 대한 우려가 적다. 또한 다양한 대사경로에 관여하면서 통합적이고 생리적인 방식으로 뇌기능 향상에 도움을 주는 것이 다른 화학적 신약과 비교할 때 큰 장점이므로 신경질환 예방 및 신경기능의 향상이 필요한 일반인을 대상으로도 안전하고 효과적으로 사용할 수 있다. 또한 본 발명에서 엘-세린의 파괴된 혈뇌장벽 복구 및 보호 작용이 확인되었으므로 혈뇌장벽 기능장애와 관련된 저산소성 허혈성 뇌손상, 신경염증질환, 뇌혈관 질환, 퇴행성 신경질환, 집중력장애, 기억장애 등의 예방 및 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명을 통해 다양한 기전으로 발생하는 신경질환을 아우르는 효과적인 예방 및 치료 가이드라인을 제시하는 데에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 엘-세린 결핍 배지에 환자 유래 T 세포 및 PHA/IL2를 적용하여 엘-세린 생합성을 유도하여 활성화시켰을 때 T 세포의 증식이 감소하는 것을 바이오마커로 이용하여 엘-세린 생합성에 장애가 있는 환자를 진단하는 방법을 도식화한 그림이다.
도 2는 3차원 미세유체 혈뇌장벽 모델에 IL-1β를 처리하여 혈뇌장벽을 붕괴시킨 후 디-세린과 엘-세린을 농도 별로 첨가하고 24 시간 후 내피세포 전기저항 (transendothelial electrical resistance; TEER)을 측정하여 혈뇌장벽의 복구 및 보호작용을 분석한 결과이다.
도 3은 엘-세린 결핍 상태의 신경교세포에 엘-세린, 레시틴, 엘-세린과 레시틴을 병용한 조성물을 농도별로 적용하여 신경교세포 활성화에 대한 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 선천성 뇌염으로 인해 광범위한 뇌손상과 신경발달장애가 발생한 환자에게 엘-세린 조성물 섭취 전과 섭취 6개월 후의 diffusion tensor MRI imaging와 fiber tractography를 적용하여 치료 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 자폐스펙트럼장애 환자들에게 엘-세린 조성물 섭취 전과 섭취 6개월 후의 Autism Treatment Evaluation Checklist (ATEC)를 적용하여 치료 효과를 평가한 결과이다.
도 6은 엘-세린 결핍 상태의 신경교세포에 엘-세린, 식용피 추출물, 엘-세린과 식용피 추출물을 병용한 조성물을 농도별로 적용하여 신경교세포 활성화에 대한 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 엘-세린 생합성 장애가 있는 자폐스펙트럼 환자 유래 T 세포에 엘-세린, 식용피 추출물, 엘-세린과 식용피 추출물을 병용한 조성물을 농도별로 적용하여 T 세포 활성화에 대한 효과를 분석한 결과이다.
도 8은 스코폴라민을 처리하여 학습과 기억장애가 유발된 마우스 모델에 Y-미로 시험을 적용하여 엘-세린, 식용피 추출물, 엘-세린과 식용피 추출물을 병용한 조성물의 인지개선 효과를 분석한 결과이다.

본 발명자들은 엘-세린 생합성장애 환자의 진단법을 확립하고, 3 차원 미세유체 혈뇌장벽 모델을 통해 파괴된 혈뇌장벽에 대한 복구 및 보호 효과를 구체적으로 확인한 것에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 엘-세린을 유효성분으로 포함하는 신경발달장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물에 함유되는 엘-세린의 함량은 총 조성물 중 0.01 중량% 내지 99.9 중량% 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조되거나, 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 약학적으로 유효한 양의 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 1000mg, 바람직하게는 200mg 내지 600mg을 매일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 상기에서 "약제학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 신경발달장애 치료를 필요로하는 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 신경발달장애 증상을 예방 또는 개선하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 엘-세린은 우수한 신경발달장애 개선 효과를 통해 그 증상을 완화시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 본 발명에서 사용한 엘-세린은 식약처에서 허가된 식품첨가물이므로 체내에서 매우 안정한 특징이 있는 바, 독성 및 부작용 없이 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 장점이 있다.

따라서 본 발명의 엘-세린은 신경발달장애의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가하여, 그 증상을 예방 또는 개선하기 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 엘-세린은 신경발달장애의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료의 제조에 용이하게 활용할 수 있다.

상기에서 "식품"이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 엘-세린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 상기 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미 식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 건강기능식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 "음료"란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 필수 성분으로서 염증 증상의 예방 또는 개선을 위한 상지 추출물을 포함하는 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

이에 더하여, 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 상지 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 99.9 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으며, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

그러므로 본 발명은 엘-세린을 유효성분으로 함유하는 신경발달장애 개선용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 신경발달장애 개선 효과를 나타낸다.

그러므로, 본 발명은 또한 엘-세린의 신경발달장애 치료제로서의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료상 유효량의 엘-세린을 투여하는 단계를 포함하는 신경발달장애 치료방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 엘-세린은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 투여량이 달라질 수 있으나, 일반적으로는 체중 1kg 당 1 내지 1000 mg, 바람직하게는 200 내지 600 mg을 투여할 수 있다.

또한, 여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말하며, "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명에서 정의되는 신경발달장애는 자폐스펙트럼장애, 지적장애, 학습장애, 언어장애, 주의력결핍과잉행동장애, 정서장애 및 운동장애로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 적용하는 질환이다.

또한, 본 발명의 조성물을 기타 적용할 수 있는 신경질환으로는 혈뇌장벽 기능장애와 연관된 저산소성 허혈성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 신경염증질환, 뇌혈관 질환, 퇴행성 신경질환, 집중력장애, 기억장애 등이 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 세포 배양

1-1. HBEC-5i 세포 배양

인체 뇌 혈관내피 세포주인 HBEC-5i (ATCC^ⓡCRL-3245^TM)는 0.1 % gelatin 코팅된 세포배양 접시에서 10 % FBS와 100 units/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 1 mM sodium pyruvate가 포함된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다.

1-2. U-87MG 세포 배양

U-87MG (ATCC^ⓡHTB-14^TM)는 10 % FBS와 100 units/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 1 mM sodium pyruvate가 포함된 EMEM 배지에서 배양하였다.

1-3. 공배양 (Co-culture)

24-웰 플레이트 트랜스웰 인서트의 상단부에 0.1 % 젤라틴으로 코팅하고, HBEC-5i를 웰당 5×10⁴ 세포로 24 시간 배양한 후, 트랜스웰 인서트 바닥면에 U87-MG 세포주를 웰당 5×10⁴ 세포를 부착시켰다. 이후, 내피세포주인 HBEC-5i에 Y-27632 (Rho-associated protein kinase; ROCK inhibitor)를 10 μM 처리하여 48 시간 배양 후, TEER 측정에 사용하였다.

1-4. 엘-세린 조성물 탐색을 위한 세포배양

HBEC-5i (ATCC^ⓡCRL-3245^TM)는 0.1% gelatin 코팅된 세포배양 접시에 10% FBS와 100 units/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 1 mM sodium pyruvate가 포함된 DMEM/F12에 40 μg/mL endotherial growth supplement(ECGS)를 첨가한 배지에서 배양하였다. Mouse hippocampal neuronal cell line HT-22 (Millipore, Cat. #SCC129)와 human glioblastoma U87 MG (ATCC^ⓡHTB14^TM)는 10% FBS와 100 U/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 말초혈액 면역 PBMC 및 T 세포의 배양은 RPMI 1640(HyClone, Logan Utah, USA) 기본 배지에 10% FBS, 20 mM HEPES, 50 μM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 100 ㎍/mL 겐타마이신을 첨가하여 사용하였다. 세포 증식에 미치는 엘-세린 첨가효과를 조사하기 위한 배지로는 엘-세린과 글리신이 결핍된 RPMI 1640 (JBI, Daegu, Korea) 배지에 10% 투석된 FBS (JRH Biosciences, KS, USA), 20 mM HEPES, 50 μM β-머캅토에탄올과 100 ㎍/ml 겐타마이신을 첨가하여 사용하였다.

실시예 2. 엘-세린 합성장애 진단법

2-1. 말초혈액으로부터 단핵구 세포의 확보

정상인과 환자의 상완 정맥으로 말초혈액을 채취한 후 Ficoll Density Gradient Centrifugation으로 단핵세포층을 파스퇴르 피펫을 이용하여 회수한 후 상온의 RPMI 1640 배지로 3회 세척한 후 말초혈액 단핵구 세포를 확보하였다.

2-2. 화학제품 및 항체

혈액으로부터 말초혈액세포 분리에 사용한 Ficoll은 GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA, USA), humanrecombinant interleukin-2 (rIL-2)는 Genzyme (Cambridge, MA, USA)으로부터 구입 하였다. 마우스 단클론 항-CD3 및 항-CD28는 PharMingen (San Diego, Ca, USA)로부터 구입 하였다. Trypan blue는 Sigma-Alderich (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다.

2-3. T 세포 활성화/증식 유도 및 T 세포증식 측정

말초혈액 유래의 단핵구 세포(PBMCs)들 중 T 세포들을 선택적으로 활성화시키고 세포증식을 유도하기 위해, 2×10⁶/mL의 농도로 완전배지인 RPMI 1640 배지에 현탁한 다음, 1 μg/mLl의 PHA와 20 U/ml의 human rIL-2를 처리하여 CO₂ 배양기에서 48 시간 배양하였다. PHA 처리 48 시간 후, 원심분리하여 회수한 T 세포를 0.5×10⁶/mL의 농도로 RPMI 1640 완전배지에 재현탁하였고 20 U/ml농도의 rIL-2를 첨가하여 CO₂ incubator에서 배양하면서, 활성화된 T 세포의 증식을 정도를 MTT 분석법 혹은 Trypan blue exclusion 법으로 viable cell counting 수행하여 비교 조사하였다.

2-4. 인체 말초혈액 PBMCs 유래 T 세포의 in vitro 활성화/증식 모델계

G₀ T 세포의 활성화 시 IL-2/IL-2R 신호 경로에 의해 PHGDH 유전자 발현이 유도되는 것에 착안하여 정상인 또는 환자의 말초혈액으로부터 분리한 단핵구 세포들(PBMCs) 내 G₀ T 세포의 in vitro 활성화 및 IL-2-의존 증식 모델계를 이용하여, 환자의 세린 대사계 변이에 따른 G₀ T 세포의 활성화/증식의 정상 대조구 T 세포와 비교되는 감소 유무를 엘-세린/글리신 결핍배지에서 Trypan blue exclusion 법을 이용한 viable cell counting 혹은 MTT 분석법으로 측정하고, 그 결과 확인되는 T 세포 증식의 감소 정도를 근거로, 신경발달장애 관련 엘-세린 합성장애를 일차적으로 진단하였으며, 이를 도식화하면 도 1과 같다.

실시예 3. 파괴된 혈뇌장벽의 복구 및 보호 작용에 대한 분석

3-1. 3차원 미세유체 혈뇌장벽 모델 구성

상기 실시예 1-3의 방법으로 공배양된 HBEC-5i/U87-MG 세포를 FBS가 제외된 배지에서 12시간 배양하고, 디-세린과 엘-세린을 농도별로 첨가하여 24 시간 배양하였다. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)으로 2 회 세척한 후, 인서트 상위 채널에는 HBSS 200 μl, 아래쪽 웰에는 HBSS 600 μl씩 채워 전기저항을 측정하였다.

3-2. 3차원 미세유체 혈뇌장벽 전기저항의 변화

다음으로, 뇌 모세혈관 내피세포 전기저항의 변화를 통해 파괴된 혈뇌장벽의 복구 및 보호 작용을 확인하였다.

IL-1β 10 ng/ml를 적용하여 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 파괴를 유도하고, 이후 디-세린 10 μM 또는 100 μM, 엘-세린 10 μM 또는 100 μM을 적용하여 전기저항의 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 엘-세린을 적용한 경우가 디-세린을 적용한 경우에 비해 전기저항의 상승정도가 컸으며, 붕괴된 혈뇌장벽의 복구 및 보호에 엘-세린이 디-세린 보다 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 엘-세린 조성물 탐색

경북대학교병원에 등록된 지적 장애 동반 자폐스펙트럼장애 환자 중 엑솜 시퀀싱에서 세린대사유전자 PHGDH 엑손 부위 p.A248V의 변이가 확인된 환자 유래의 T 세포를 이용하여 엘-세린 투여 효과를 증강시킬 수 있는 물질을 탐색하였다. 또한 스코폴라민을 처리하여 학습과 기억장애가 유발된 마우스 모델에 Y-미로 시험을 적용하여 엘-세린 조성물의 인지개선 효과를 분석하였다.

4-1. 엘-세린 조성물의 세포 증식 효능 검정

엘-세린 대사 변이 유전자에 의한 세린 합성 장애를 회복시킬 수 있는 조성물로서 외부에서 공급하는 엘-세린의 효과를 증진시킬 수 있는 후보 물질 탐색을 말초혈액 유래 T 세포 또는 U87 세포에서 MTT 분석법으로 확인하였다. 96 well plate에 적당량의 세포를 가한 후, 엘-세린이나 후보 물질을 농도별로 첨가하여 36에서 44시간 배양 후 MTT 용액 (1.1 mg/ml)을 50 μl를 첨가하였고 4시간 더 배양하였다. MTT 반응으로 생성된 포르마잔은 배양 상등액을 제거한 후 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포증식 증진효능 및 억제효능 등으로 평가하였다.

4-2. 엘-세린과 레시틴 병용 조성물

신경교세포 활성화를 위한 엘-세린 투여 효과를 증가시킬 수 있는 후보 물질로 레시틴의 혼용 효과를 검토하였다. 레시틴은 글리세린, 인산을 포함하는 지방으로 콜린과 이노시톨 성분이 심혈관에 우수한 물질로 알려져있다. 엘-세린과 레시틴을 U87 MG 세포에 동시에 처리하여 세포증식에 대한 효과를 조사한 결과 엘-세린 25 μg/ml 단독 투여 시 (대조구 대비 121%) 보다 엘-세린 25 μg/ml에 레시틴 200 μg/ml를 동시에 처리하였을 때 (대조구 대비 128%) 신경교세포 증식이 활성화됨을 도 3에서 확인하였다.

4-3. 엘-세린과 레시틴 병용 조성물의 임상적 효과

1) 선천성 뇌염으로 인해 광범위한 뇌손상과 신경발달장애가 발생한 환자

6개월 동안 엘-세린과 레시틴 병용 조성물 (엘-세린:레시틴=10:1)을 600mg/kg/day로 섭취하였고, 섭취 전과 후에 diffusion tensor MRI imaging와 fiber tractography를 적용하여 치료 효과를 평가한 결과가 도 4이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 섭취 전에 우측에서 분석되지 않고 좌측에서는 피질하 백색질(subcortical white matter) level에서 discontinuation 소견을 보였던 피질척수로(corticospinal tract)는 섭취 6개월 뒤에 좌측은 피질(cortex)까지 recovery된 소견을 보이며, 우측은 방사관(corona radiata) level까지 recovery 된 소견을 보였다. 내측 섬유대(medial lemniscus)의 경우 섭취 전에 양측 모두 피질하 백색질(subcortical white matter) level에서 discontinuation 소견을 보였으나 섭취 6개월 뒤에 양측 모두 피질(cortex) level 까지 integrity가 유지되는 소견을 보였다. 뇌활(fornix)의 경우 섭취 전과 후 모두 양측 뇌활다리(fornical crus) 저형성 소견을 보이나, 섭취 전 보이지 않았던 단어기억(verval memory)을 담당하는 좌측 crus가 섭취 6개월 뒤에는 호전된 소견을 보였다. 혀면결절(cingulum)의 경우 섭취 전에 비해 섭취 6개월 뒤에는 양쪽 모두 의미 있게 호전된 소견을 보이며, 연령대비 적절한 소견을 보였다. 피질망상로(corticoreticular tract)의 경우 섭취 전 양측 모두 분석 되지 않는 소견이었으나 섭취 6개월 뒤에는 연령대비 적절한 수준까지 recovery 된 소견을 보였다. 또한 섭취 기간동안 어떠한 독성이나 부작용도 관찰되지 않았으며, 순응도 및 내약성이 우수하였다.

2) 자폐스펙트럼장애 환자

ATEC은 여러 연구를 통해 입증된 자폐스펙트럼장애 환자의 치료 경과와 효과를 판단할 수 있는 도구로서, ATEC 총점 (subscale totals)이 104점을 초과할 경우, 90 백분위수 이상의 매우 심한 자폐증이며, 50점 미만인 경우는 30 백분위 이내의 경한 자폐증을 시사한다. 또한, 치료 전과 후의 총점이 50점 이상 감소한 경우는 치료에 큰 효과를 보이는 것을 의미한다. 자폐스펙트럼장애 환자 20명을 대상으로 엘-세린과 레시틴 병용 조성물 (엘-세린:레시틴=10:1)을 6개월간 200mg/kg/day로 섭취하였고, 섭취 전과 후에 ATEC을 시행하여 효과를 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 치료 전의 총점 평균이 128점으로 매우 심한 자폐증이었던 환자들이 치료 후 73점으로 50점 이상 감소한 것을 확인하였다. 언어, 사회성, 인지, 및 행동의 4가지 항목 전반에 걸쳐 증상의 호전을 보였으며, 특히 언어와 인지에서 큰 호전을 보이는 것을 확인하였다. 대부분의 환자들이 치료 수일 째부터 수용 언어와 인지가 향상하는 소견을 보였으며, 지금까지 표현 언어가 한 번도 없었던 환자들이 처음으로 언어를 모방하거나 구사하는 등의 큰 변화를 보이는 것도 확인할 수 있었다.

나아가, 교감행동을 보인 적 없었던 환자들이 상대의 행동에 반응을 보이고 눈맞춤의 빈도가 늘었으며, 이상행동의 빈도도 확연히 줄어 사회성과 행동에서도 호전을 보이는 것을 알 수 있었다. 또한, 섭취 기간동안 어떠한 독성이나 부작용도 관찰되지 않았으며, 순응도 및 내약성이 우수하였다.

4-4. 엘-세린과 식용피 병용 조성물

식용피 (Echinochloa crus-galli)는 일년생 초본과 작물로 전 세계적으로 재배 면적이 감소하는 추세였으나, 최근 들어 타 작물보다 양질의 단백질, 지방과 vitamin B 복합체 함량이 높고 항산화, 항당뇨 및 항염증과 연관이 깊은 플라보노이드 함량이 높다고 보고되면서, 새로운 건강 기능성 작물로 주목받고 있다. 특히 항산화 및 항염증 효과가 보고된 Biochanin A, chlorogenic acid, p-coumaric acid, hesperidin, kaempferol, protocatechuic acid, quercetin,resveratrol 등이 타 작물에 비해 풍부한 새로운 기능성식품으로 인식되고 있다. 따라서 항산화력이 우수한 식용피 에탄올 추출물과 엘-세린의 병용 효과를 신경교세포 U87 MG 세포주를 이용하여 타진해보았다. 식용피 30 kg을 80% 에탄올로 80℃에서 4시간씩 4번 감압 농축하여 EtOH extract 약 1.1 kg을 얻었다. 식용피 에탄올 추출물을 세린과 글리신이 결핍된 상태에서의 U87 MG 세포증식에 대한 효과를 조사해 보았다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, U87 MG 세포에 세린 25 μg/ml 단독 처리 시 세포증식이 대조군에 비해 115%, 식용피 에탄올 추출물 12.5 μg/ml 처리 시 대조구에 비해 113%인 것에 반해 엘-세린 25 μg/ml와 식용피 에탄올 추출물 12.5 μg/ml를 동시에 처리하면 158%로 증식이 증가하여, 식용피 추출물이 세린의 처리 농도를 절감시키면서 세포증식을 1.5배 이상 증가 시켜 우수한 엘-세린 조성물로 확인되었다.

4-5. 엘-세린과 식용피 병용 조성물의 동물 시험 효과

1) 실험동물

실험동물은 수컷의 C57BL/6 (SPF/VAF 6NCrljOri) 5주령을 주식회사 오리엔트(경기도, 한국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 대구한의대학교 동물실에서 7일간 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 각 군당 10마리로 구성하였고, 온도 23 ± 3℃, 습도 50 ± 10% 내외, 명암주기 12시간 주기로 일정하게 유지된 사육실에서 다섯 마리씩 polycarbonate mice cage에 수용하여 사육하였으며 적응 기간 동안 사료와 물을 제한 없이 공급하였다.

2) Y-미로시험 (Y-maze test)

약물 투여는 실험 시작 1시간 전에 실험동물을 행동관찰실로 옮기고 약물을 투여한 후 안정시켰다. 약물투여는 엘-세린은 멸균 증류수에 녹인 후 경구 투여하였고 (300, 600 mg/kg), 식용피 에탄올 추출물은 10% DMSO 첨가된 corn oil에 녹인 후 경구 투여하였다(150, 300 mg/kg). 대조군에는 10% DMSO 첨가된 corn oil을 같은 용량으로 경구 투여하였다. 경구 투여 30분 후에 멸균 증류수에 녹인 스코폴라민을 1 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였고, 스코폴라민 투여 30분 후에 mouse를 실험 기구로 이동시켰다. Y-미로시험에 이용되는 기구는 3개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지(arm)의 길이는 42 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 팔이 접하는 각도는 120°이다. 모든 실험 장치는 검정색의 polyvinyl plastic으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 mouse를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 mouse가 들어간 가지를 기록하였다. 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 계산하였다.

변경 행동력(%)

= 실제변경(actual alternation) / 최고변경 (maximum alternation) × 100

(최고변경 : 총 입장횟수 - 2)

3) 통계처리

모든 실험 결과는 one way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 유의성이 인정 될 경우 Student-Newman-Keuls Method를 이용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

4) 결과

도 8은 스코폴라민 (1mg/kg)을 처리하여 학습과 기억장애가 유발된 마우스 모델에게 엘-세린, 식용피 추출물, 엘-세린과 식용피 추출물을 병용한 조성물을 주고 Y-미로 시험을 적용한 것으로, 조성물을 쓰지 않은 마우스 모델과 비교하여 엘-세린, 식용피 추출물, 엘-세린과 식용피 추출물을 병용한 조성물 모두 인지개선 효과를 보였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해 할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

엘-세린 (L-serine)을 유효성분으로 포함하는, 자폐스펙트럼장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물 중 엘-세린의 함량은 0.01 중량% 내지 99.9 중량%인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 파괴된 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 복구를 촉진시키는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 신경교세포 증식을 활성화시키는 것인, 약학적 조성물.
엘-세린 (L-serine)을 유효성분으로 포함하는, 자폐스펙트럼장애의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
제5항에 있어서,
상기 식품 중 엘-세린의 함량은 0.01 중량% 내지 99.9 중량%인 것을 특징으로 하는, 건강기능 식품.